枫杨总黄酮通过抑制中性粒细胞胞外陷阱网的释放减轻大鼠类风湿关节炎

Pterocarya hupehensis Skan total flavones ameliorate rheumatoid arthritis in rats by suppressing formation of neutrophil extracellular traps

摘要

目的 探讨枫杨总黄酮（PHSTF）干预类风湿关节炎（RA）的机制，为治疗类风湿关节炎提供新的理论基础。 方法 将25只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组（CIA组）、枫杨总黄酮低剂量组［CIA+PHSTF （45 mg/kg）］、枫杨总黄酮高剂量组［CIA+PHSTF （90 mg/kg）］、雷公藤多苷片组［CIA+ TPG（10 mg/kg）］，5只/组。除正常组外，对其余大鼠采用二次免疫法建立CIA大鼠模型。二次免疫结束后，枫杨总黄酮组和雷公藤多苷片组按相应剂量灌胃给药，1次/d，连续4周。采用ELISA检测血清中细胞因子（TNF-α、IL-1β）的水平；HE染色检测踝关节组织损伤情况；免疫组化（IHC）检测踝关节中性粒细胞胞外陷阱网（NETs）标志物瓜氨酸化组蛋白3（Cit-H3）的表达水平。建立细胞模型，设立枫杨总黄酮不同剂量组（0、12.5、25、50、100、200 μg/mL），利用CCK-8探索PHSTF用药浓度，采用迪夫快速染色法观察中性粒细胞的形态；设立对照组（Control），佛波酯（PMA）刺激中性粒细胞模拟NETs形成建立模型组（PMA），枫杨总黄酮低剂量组［CIA+PHSTF （100 μg/mL）］，枫杨总黄酮高剂量组［CIA+PHSTF （200 μg/mL）］。Western blotting检测枫杨总黄酮干预后NETs标志性蛋白Cit-H3，肽酰基精氨酸脱亚胺酶4（PADI4），中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）以及髓过氧化物酶（MPO）的表达，免疫荧光检测Cit-H3的表达观察NETs形成。 结果 体内实验中，与模型组相比较枫杨总黄酮可明显改善CIA大鼠踝关节的肿胀程度（P<0.05），降低血清中炎症因子水平（P<0.05），显著改善踝关节组织病理程度，降低血清以及踝关节软骨中性粒细胞胞外诱捕网浓度，抑制中性粒细胞胞外诱捕网的释放（P<0.05）。体外实验中，枫杨总黄酮并未对中性粒细胞活性有明显影响（P<0.01），此外枫杨总黄酮显著抑制PMA诱导的中性粒细胞胞外诱捕网的释放（P<0.05）。 结论 枫杨总黄酮可以通过抑制NETs的产生，达到干预类风湿关节炎的目的。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic mechanism of Pterocarya hupehensis Skan total flavonoids (PHSTF) for rheumatoid arthritis (RA). Methods Twenty-five male SD rats were randomly divided into normal control group, RA model group, PHSTF treatment (45 and 90 mg/kg) groups, and Tripterygium glycosides (TPG) tablet (10 mg/kg) group (n=5). Except for those in the normal control group, all the rats were subjected to collagen-induced arthritis (CIA) modeling using a secondary immunization method, after which PHSTF and TPG were administered via gavage once daily for 4 weeks. After the treatments, serum levels of TNF-α and IL-1β were measured using ELISA, and ankle joint pathologies were assessed with HE staining; the expression of citrullinated histone H3 (Cit-H3), a neutrophil extracellular trap (NET) marker, in the ankle joints was evaluated with immunohistochemistry. In primary cultures of rat peripheral blood neutrophils stimulated with phorbol ester (PMA), the effects of PHSTF (100 and 200 μg/mL) on the expressions of Cit-H3, peptidylarginine deiminase 4 (PADI4), neutrophil elastase (NE), and myeloperoxidase (MPO) were examined with Western blotting; immunofluorescence assay was used to observe Cit-H3 expression and NET formation in the cells. Results In the CIA rat models, PHSTF significantly alleviated ankle swelling, decreased serum levels of TNF-α and IL-1β, improved histopathological changes in the ankle joints, and reduced Cit-H3 expression in both the serum and ankle joint cartilage. In the isolated rat neutrophils, PHSTF showed no significant effect on cell viability but strongly inhibited PMA-induced NET release. Conclusion PHSTF can alleviate RA by inhibiting the formation of NETs.

Graphical abstract

关键词

枫杨总黄酮 / 中性粒细胞胞外陷阱网 / 类风湿关节炎

Key words

Pterocarya hupehensis Skan total flavonoids / neutrophil extracellular traps / rheumatoid arthritis

类风湿关节炎（RA）是全球成人发病率0.5%~1.0%的系统性自身免疫病，在我国占0.32%~0.36%^［1］，且随年龄增加患病率逐年上升。以关节的炎性反应为主要病理改变，并伴有滑膜细胞浸润、软骨及骨质破坏^［2］。尽管当前世界范围内已经对RA的发病机制进行了深入探究，但其发病机制依旧不完全清楚。临床上，常将非甾体类抗炎药（NSAIDs）和抗风湿药（DMARDs）等药物广泛用于治疗RA患者^［3］。但其药后并发的诸多不良反应，如恶心、消化不良、肾脏损害，很大程度上制约了上述两类药物在治疗RA的使用，因此探索更多药物及方法治疗RA具有重要意义^［4］。

湖北枫杨拥有丰富的黄酮类物质，是恩施地区民间治疗风湿的常用药材，具有低毒副作用、疗效好等优点。近来研究发现其可以显著抑制非小细胞肺癌的侵袭与迁移，对非小细胞肺癌也有着显著的干预效果^［5］。有研究表明，多味中药总黄酮具有多靶点、多途径的作用，对RA具有良好的治疗作用^{［6， 7］}。中性粒细胞在应激条件下发生核膜断裂，形成染色质的网络^［8］，这个结构被称为中性粒细胞胞外陷阱网（NETs），其产生的过程被称为中性粒细胞胞外诱捕网释放（NETsosis）。NETosis与RA的进展密切相关^{［9， 10］}。在这个过程中，中性粒细胞颗粒蛋白，如髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性酶（NE）^［11］，在RA滑液中浓度增高，而它们正是导致关节损伤的原因^［12］。已有研究证实，NETs能够增强机体的自体免疫反应，加剧机体的损伤^{［13， 14］}。因此，靶向调控NETs的释放已成为RA治疗的重要靶点。为了探究湖北枫杨总黄酮对RA的治疗作用与NETs的释放之间的关系。本研究结合体内外实验以NETs为切入点论证枫杨总黄酮干预类风湿关节炎的作用机制，以阐明湖北枫杨总黄酮抗类风湿关节炎的药理机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药物及制备

枫杨总黄酮（PHSTF）来自湖北风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室的赠与，以芦丁为标准品，采用光谱扫描法进行比对及计算，测定出枫杨总黄酮含量为78%。

1.1.2 主要试剂

牛II型胶原、弗氏完全佐剂、不完全弗氏佐剂（Sigma）。大鼠外周血液嗜中性粒细胞分离液试剂盒（天津灏洋华科生物）。雷公藤多苷片（浙江得恩德制药股份有限公司，国药准字H22022674）。PADI4抗体（Fine Test，稀释比例为1∶1000）。Cit-H3抗体、NE抗体（Abcam，稀释比例为1∶1000）。山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG（Proteintech，稀释比例为1∶20 000）。MPO/DNA ELISA、TNF-α ELISA和IL-1β ELISA试剂盒（上海酶联生物）。PMA、MPO抗体（Beyotime，稀释比例为1∶1000）。CCK-8试剂盒（武汉科瑞生物）。

1.1.3 仪器

多功能酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；EL204型万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海森信）；高速冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific）；免疫蛋白印迹系统通用设备（BIO-RAD）；冷冻干燥机（Marin Christ）；BX51光学显微镜（Olym‐pus）；Western 成像分析仪（上海勤翔科学仪器有限公司）。Multiscan Go酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；倒置荧光显微镜（LEICA DFC7000 T）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；311型CO₂细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific）。

1.1.4 动物

SD大鼠，雄性，SPF级，周龄6~8在SPF条件下词养于三峡大学实验动物中心［许可证号SCXK（湘）2020-0018］。所有实验过程与操作遵守湖北恩施学院实验动物伦理委员会的要求与原则（伦理审批号：20240502）。

1.2 方法

1.2.1 动物造模及分组

25只大鼠随机分为5组，5只/组：对照组、模型组（CIA组）、枫杨总黄酮低剂量［CIA+PHSTF（45 mg/kg）］组、枫杨总黄酮高剂量［CIA+PHSTF（90 mg/kg）］组、阳性药物雷公藤多苷片［CIA+TPG （10 mg/kg）］组。饲养1周排除环境带来的影响。采用牛II型胶原乳剂和等量的完全弗氏佐剂建立CIA大鼠模型。除对照组大鼠外，其余大鼠尾根部皮下与右后脚掌肉垫注射0.2 mL乳剂进行诱导。在第14天，除对照组外，所有大鼠均注射0.2 mL不完全弗氏佐剂和牛II型胶原的混合乳剂进行二次免疫。将湖北枫杨总黄酮溶于羧甲基纤维素钠，从第14天开始，采用灌胃的方式给药。其中对照组与CIA组以2 mL/只灌胃羧甲基纤维素钠，其余各组大鼠分别用枫杨总黄酮45 mg/kg和90 mg/kg灌胃，CIA+TPG组按TPG 10 mg/kg，定量2 mL/只灌胃，1次/d，连续4周。采用0-4评分标准量表评估关节炎严重程度：0-正常，1-踝关节轻度红肿，2-中度肿胀，轻度活动受限，3-明显肿胀，活动受限，4-严重肿胀和活动障碍。当评分≥4时，表明该模型构建成功。每周两次测量体质量，脚掌用游标卡尺测量厚度。第7周将大鼠处死，采集大鼠踝关节，用4%多聚甲醛固定，进行组织病理学分析。

1.2.2 苏木精伊红染色观察

对大鼠踝关节进行解剖，剥去皮肤，浸泡于福尔马林中固定组织。使用酒精和二甲苯进行梯度脱水处理，使组织脱水并透明化，将组织包埋在石蜡中。制成切片后进行苏木精和伊红染色，封片。最后在显微镜下拍照，观察大鼠关节组织病理改变。

1.2.3 酶联免疫吸附分析

取待测血清及细胞悬液，严格按照ELISA试剂盒说明书的步骤进行操作。使用双蒸水配置洗涤液（1∶20）。按照说明书中的要求配置标准品，各浓度应符合说明书所示，每个浓度设置一个复孔，并设立空白孔。将标准品和待测样本每孔加入0.1 mL。在室温下孵育2 h。将孔中液体废弃，使用洗涤液洗板3次，拍干酶标板。加入预先配置好的工作液，室温下孵育1 h，再次使用洗涤液洗板3次，拍干酶标板。加入预先配置的显色剂0.1 mL/孔，避光条件下室温孵育30 min，加入终止液0.1 mL/孔，混匀后，用酶标仪测定450 nm的吸光度。根据标准曲线计算血清中MPO/DNA、TNF-α和IL-1β的含量，以样品分组为横坐标，标准品浓度为纵坐标进行计算。

1.2.4 免疫组化分析

采用免疫组化应用溶液试剂盒进行免疫组化。将踝关节蜡块在60 ℃下烘烤去除石蜡，浸泡在二甲苯、乙醇和超纯水中。采用10%牛血清白蛋白阻断，兔抗Cit-H3单克隆抗体（Abcam）以1∶400稀释孵育过夜，二抗孵育1 h。DAB工作液进行处理，最后在200倍显微镜下观察。

1.2.5 大鼠外周血中性粒细胞的分离与培养

严格按照大鼠外周血中性粒细胞分离试剂盒的说明书进行实验，取4 mL中性粒细胞分离液于离心管中。使用负压移液枪将大鼠外周血小心加入离心管中进行离心（2250 r/min，25 min，21 ℃）。离心结束后，小心吸取试管中的中性粒细胞转移到另一支试管中。使用PBS洗涤细胞，离心条件为21 ℃，1000 r/min，5 min。使用红细胞裂解液去除残余的红细胞。最后，将中性粒细胞重悬于1 mL RPMI 1640完全培养基中。将细胞置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。

1.2.6 CCK-8实验

将中性粒细胞（10⁴/孔）接种在96孔板中，加入RPMI 1640培养液置于37 ℃ 5% CO₂培养箱。加入0、12.5、25、50、100、200 μmol/L的枫杨总黄酮处理中性粒细胞4 h，每孔加入10 μL Cell Counting Kit 8溶液，孵育1 h，采用Thermo Fisher Scientific多功能酶标仪测定450 nm处吸光度，实验重复3次。

1.2.7 枫杨总黄酮处理佛波酯（PMA）诱导中性粒细胞释放中性粒细胞陷阱网

将分离提纯的中性粒细胞以1×10⁶/mL的密度接种于六孔板中，除对照组外，加入枫杨总黄酮低剂量组（100 μg/mL），枫杨总黄酮高剂量组（200 μg/mL）和PMA组（25 nmol/L）孵育4 h。以备后续细胞实验。

1.2.8 Western blotting分析

使用蛋白提取液（RIPA：PMSF=100∶1）提取总蛋白，3000 r/min离心4 ℃，5 min。弃去上清液，加入蛋白上样缓冲液。按照150~250 μL/孔加入裂解液，轻弹管底以充分裂解细胞，确保没有明显的细胞沉淀。将EP管放入沸水中煮10 min，存放于-20 ℃冰箱中。电泳需确保每个样品的蛋白量保持一致（30~50 g），使用12%、15% SDS-PAGE凝胶分离蛋白，将蛋白电转至PVDF膜上。5%脱脂牛奶使PVDF膜封闭1 h，加入PADI4（1∶1000）、MPO（1∶1000）、NE（1∶1000）、Cit-H3（1∶1000）、β-Actin（1∶10 000）的特异性一抗，孵育12~16 h。接着将条带洗涤3次，加入相应的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG二抗（1∶20 000），37 ℃孵育2 h。使用DAB显色，并将膜放入显影仪中显影。使用Image J软件分析条带密度，将数据标准化使用内源对照β-actin和Histone-H3，重复实验3次。

1.2.9 免疫荧光染色分析

将各组细胞悬液收集后，进行离心（3000 r/min，时间为5 min，温度为4 ℃），去除培养基。使用PBS洗涤3次，3 min/次。加入4%多聚甲醛固定20 min，随后PBS洗涤，3 min/次，重复3次。加入0.1% Triton X-100透化15 min，再次使用PBS洗涤，3 min/次，重复3次。加入山羊血清工作液封闭20 min，去除血清后加入稀释的Cit-H3抗体，在4℃条件下孵育过夜。使用PBS洗涤，3 min/次，重复3次，避光条件下加入稀释的山羊抗免疫荧光二抗（1∶500），37 ℃孵育1 h。最后加入DAP1工作液进行细胞核染色。洗净PBS后，进行镜检。

1.3 统计学分析

以上各项实验数据统计均以均数±标准差表示。统计分析使用GraphPad Prism 8.0软件进行，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P<0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 枫杨总黄酮对CIA大鼠踝关节肿胀程度的影响

对照组大鼠踝关节结构未见明显发红肿胀，脚掌厚度未见明显增厚。模型组表现出踝关节结构明显发红肿胀，且脚掌明显增厚（图1B）。雷公藤多苷组、枫杨总黄酮低剂量组（45 mg/kg）和枫杨总黄酮高剂量组（90 mg/kg）大鼠的踝关节肿胀程度明显减轻（图1C），脚掌厚度减缓（图1D），其中，类风湿关节炎炎症评分显著降低（P<0.05）。枫杨总黄酮高剂量组的关节肿胀程度比枫杨黄酮低剂量组进一步降低，呈现一定的浓度依赖性（P<0.05，图1）。

2.2 枫杨总黄酮对CIA大鼠血清中炎症因子变化的影响

与对照组相比，模型组大鼠血清中TNF-α（图2A）和IL-1β（图2B）的水平显著升高（P<0.05）。与模型组相比，雷公藤多苷组、枫杨总黄酮低剂量组（45 mg/kg）和枫杨总黄酮高剂量组（90 mg/kg）大鼠的TNF-α和IL-1β水平显著降低（P<0.05）；其中，枫杨总黄酮高剂量组的炎症因子表达低于枫杨总黄酮低剂量组，具有统计学意义（P<0.05）。

2.3 枫杨总黄酮对CIA大鼠踝关节组织病理变化的影响

正常组大鼠踝关节结构完整，关节腔清晰，软骨表面光滑，无明显炎症细胞浸润。相比之下，模型组大鼠关节腔明显狭窄，软骨表面粗糙，存在大量炎症细胞浸润和组织破坏，显示出显著的类风湿关节炎病理特征。枫杨总黄酮低剂量组（45 mg/kg）大鼠的踝关节组织明显改善，关节腔较为宽敞，炎症细胞浸润减少，软骨表面的损伤有所缓解。然而，与模型组相比，改善效果尚不完全。枫杨总黄酮高剂量组（90 mg/kg）表现出更好的治疗效果，关节腔更加宽敞，炎症细胞显著减少，软骨表面较为光滑，组织结构接近正常状态。雷公藤多苷组（10 mg/kg）的治疗效果也较为显著，关节腔宽敞度增加，炎症细胞浸润明显减少，软骨表面结构完整，无明显损伤。枫杨总黄酮高剂量组的炎性细胞浸润程度比枫杨总黄酮低剂量组进一步降低（图3）。

2.4 枫杨总黄酮对CIA大鼠血清以及踝关节软骨中性粒细胞胞外陷阱网释放的影响

正常组大鼠的滑膜细胞Cit-H3染色阴性，几乎无NETs形成；模型组出现明显的Cit-H3染色阳性，提示大量NETs的形成。相比之下，枫杨总黄酮低剂量组和高剂量组的Cit-H3染色阳性细胞明显减少（图4A）。正常组大鼠的CitH3阳性面积较小，模型组则显著增加。与模型组相比，枫杨总黄酮低剂量组（45 mg/kg）显示出显著减小的Cit-H3阳性面积，而枫杨总黄酮高剂量组（90 mg/kg）进一步减少了Cit-H3阳性面积，接近正常组。这表明枫杨总黄酮在抑制NETs形成方面具有剂量依赖性（图4B）。此外，正常组大鼠的NETs释放量最低。枫杨总黄酮低剂量组（45 mg/kg）显著降低了NETs释放量（P<0.05），但仍高于正常组。枫杨总黄酮高剂量组（90 mg/kg）进一步抑制了NETs的释放，比低剂量组效果更明显，释放量更接近正常水平（P<0.05，图4B）。

2.5 枫杨总黄酮对正常中性粒细胞活力的影响

CCK-8检测结果显示，枫杨总黄酮在不同浓度（0， 12.5、25、50、100、200 μg/mL）条件下，各组中性粒细胞的存活率皆保持在90%以上，且在不同浓度下未见显著差异（P>0.05，图5A）。迪夫快速染色法结果显示，从大鼠外周血中提取的正常中性粒细胞在不同浓度枫杨总黄酮处理后，中性粒细胞均呈现出较高的存活情况，细胞形态完整，无明显的细胞死亡迹象（图5B）。

2.6 枫杨总黄酮对PMA诱导的中性粒细胞胞外陷阱网释放的影响

通过Western blotting实验发现，与正常组相比，PMA诱导组大鼠中性粒细胞胞外陷阱网标志性蛋白Cit-H3、NE、MPO、PADI4的表达水平显著升高。与PMA组进行比较，枫杨总黄酮100 μg/mL组和200 μg/mL组中Cit-H3、MPO、PADI4蛋白的表达水平显著降低，且高剂量组的降低程度显著优于低剂量组（P<0.01，图6A）。

另外，免疫荧光染色结果显示，与正常组相比，PMA诱导组中Cit-H3的表达明显高于正常组，并且在PMA组的中性粒细胞中发现DAPI和Cit-H3在显微镜下呈现较为明显的网状结构。与PMA组进行比较，枫杨总黄酮低剂量组和高剂量组中Cit-H3的表达明显下降，且在显微镜下未见明显的网状结构。因此，枫杨总黄酮显著抑制了PMA诱导的中性粒细胞胞外陷阱网的释放（图6B）。

3 讨论

RA是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，常涉及多个关节，致残率较高，其主要病理表现包括滑膜炎和关节结构损伤^［15］。该疾病的确切原因和机制尚不清楚。研究表明，中性粒细胞参与 RA的发生发展。我们前期研究发现，RA患者滑液中中性粒细胞的激活与关节炎症和损伤水平相关^{［16， 17］}。中性粒细胞表达多种炎症介质，包括细胞因子和趋化因子^{［18， 19］}。这些分子可以增加中性粒细胞的迁移能力，导致大量募集到RA关节。炎症介质也抑制中性粒细胞的凋亡，从而放大炎症。中性粒细胞释放的NETs是RA中瓜氨酸化蛋白抗原的来源，尤其是TNF-α和IL-1β在募集和激活中性粒细胞中扮演着重要角色，这些炎性细胞因子通过诱导其他细胞因子和趋化因子的产生来放大免疫反应^［20］。

中性粒细胞是炎症发生早期首先进入炎症部位的免疫细胞。中性粒细胞浸润是RA发病的关键在RA早期，中性粒细胞迁移到关节腔内，并在RA滑膜炎症过程中发挥功能，加重RA的骨破坏，介导RA疾病进展^［21］。NETsosis是近年发现的一种新的程序性死亡模式，中性粒细胞可在胞外形成大量的非编码RNA （CHIP），因此，大量学者提出将NETs作为靶点研发RA的新型治疗手段^{［22， 23］}，但NETs影响RA的具体机制尚未明确。目前以NETs为靶点治疗RA大多仅仅处于动物模型的研究阶段^［24］，本研究旨在结合动物原代细胞和动物模型探讨NETs干预RA的治疗机制。

有研究表明许多药物的总黄酮成分对RA有一定治疗效果^{［25， 26］}，前期通过研究发现湖北枫杨水煎液以及醇提物对RA具有治疗作用，本研究以湖北枫杨中提取的总黄酮成分对NETs的影响进行讨论。本研究构建的CIA模型结果表明，CIA组大鼠出现体质量下降，脚掌增厚，关节评分上升，炎性细胞浸润及其募集和激活。与CIA组相比，枫杨总黄酮干预能有效减轻CIA大鼠的关节肿胀，并表现出明显的浓度依赖关系，提示枫杨黄酮可作为一种新型的药物以干预RA。

近年来研究发现NETs会诱导炎症细胞因子的产生，如IL-6和TNF，从而扩大炎症反应，因此抑制NETs的形成有利于缓解RA^［27］，此外敲降PADI4能有效降低NETs的释放从而减轻RA^［28］。通过抑制中性粒细胞活性来改善RA大鼠的炎症等。在本研究中，枫杨总黄酮能够显著降低大鼠模型踝关节中NETs的生物标志物Cit-H3以及MPO/DNA复合物的表达。此外，我们在大鼠外周血液中分离提取了中性粒细胞以构建细胞模型。在高浓度的枫杨总黄酮干预下，NE和PADI4的表达有时甚至低于正常中性粒细胞，这可能揭示着枫杨总黄酮干预NETsosis释放的关键靶点，可能为干扰NE或者PADI4发挥相应作用。而患者血清中的PADI4表达的上调也揭示着RA将会持续恶化^［29］。所以，我们猜测PADI4的上升与NETs的释放以及持续恶化的RA之间是否会存在某种联系。我们将继续以此为切入点，为了进一步论证枫杨总黄酮通过调控中性粒细胞胞外陷阱网的释放干预类风湿关节炎。深入挖掘枫杨总黄酮干预NETs生成的相关机制，以期更深入地了解其免疫学机制。此外，通过在共聚焦显微镜，同样发现枫杨总黄酮可明显干预NETs的生成。清晰的表明枫杨总黄酮能够通过抑制NETs的形成而对RA有一定的干预效果。

综上所述，枫杨总黄酮能够通过调控中性粒细胞胞外陷阱网的释放干预类风湿关节炎。通过这项研究，我们进一步丰富了枫杨总黄酮的抗炎特性，为其在治疗免疫疾病的潜在临床应用方面提供一定的见解。进一步的探索土家药湖北枫杨治疗RA的药理作用机制，将为湖北枫杨干预RA提供实验及理论基础。后续，关于枫杨总黄酮是否通过其他途径干预RA，我们将在后续研究中进一步探索。

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基金资助

国家自然科学基金(81960776)

湖北省自然科学基金(2022CFB515)

恩施土家族苗族自治州科技局技术支撑类项目(D20230022)

湖北恩施学院校级科研项目(KYZY202406)

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