IL-21和CCL19修饰可提高NKP30 CAR-T细胞对肺癌的杀伤效率并促进其肿瘤浸润

Modification with IL-21 and CCL19 enhances killing efficiency and tumor infiltration of NKP30 CAR-T cells in lung cancer

摘要

目的 探讨细胞因子IL-21和趋化因子CCL19修饰的NKP30 CAR-T细胞是否增强对肺癌的杀伤和浸润作用。 方法 在NKP30 CAR基础上融合基因IL-21和CCL19构建IL-21-CCL19 NKP30 CAR；CAR-T细胞的培养使用CD3CD28单抗及细胞因子IL-2刺激；流式细胞术检测免疫细胞表型；迁移实验检测IL-21对免疫细胞的迁移作用；乳酸脱氢酶（LDH）及成球实验检测CAR-T细胞的杀伤及浸润能力；酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测IFN-γ的分泌数量；ELISA检测IL-21及CCL19的分泌情况；体内实验中，将肿瘤细胞显微注射到斑马鱼卵黄囊，构建斑马鱼移植瘤模型，24 h后将免疫细胞注射至同样部位，体式荧光显微镜拍摄荧光。 结果 NKP30配体（B7H6）在正常组织及血液细胞不表达，在肺癌细胞上高表达（90%以上）。IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T细胞与NKP30 CAR-T细胞和常规T细胞相比，具有更强的增殖能力、迁移能力及中心记忆T细胞的形成（P<0.001），免疫抑制分子CTLA4与PD1显著降低（P<0.005），对肺癌细胞具有更强的杀伤能力（P<0.001），伴随IFN-γ数量明显增加（P<0.001）。IL-21-CCL19 CAR-T 细胞杀伤肺癌细胞中产生大量细胞因子IL‑21 （3152.33±526.74 pg/mL）和趋化因子CCL19（1853±211.95 pg/mL）。体内实验中，CAR-T细胞和普通T细胞比较，具有较强的杀伤能力和增殖能力，但2种CAR-T细胞无明显差异（P>0.05）。 结论 IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T细胞更容易浸润到肿瘤内部，有效杀伤肿瘤细胞，同时产生更多的记忆T细胞。

Abstract

Objective To investigate whether modification with IL-21 and CCL19 enhances killing and tumor-infiltrating efficiency of NKP30 CAR-T cells in lung cancer. Methods The modified IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T cells expressing IL-21 and CCL19 fusion gene was constructed based on NKP30 CAR-T cells and stimulated with CD3CD28 antibodies and IL-2. The immunophenotype and migration of the cells in the presence of IL-21 were investigated using flow cytometry and migration experiments. Lactate dehydrogenase (LDH) release and sphere formation assays were used to assess the killing and infiltration capabilities of CAR-T cells, and the secretion levels of IFN‑γ, IL-21 and CCL19 were determined with enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) and ELISA. A zebrafish model bearing HCG-27 cell xenograft was established by microinjection of the tumor cells into the yolk sac followed 24 h later by injection of the immune cells at the same site, and the fluorescence signals were captured using a fluorescent microscopy. Results The NKP30 ligand B7H6, which was almost undetectable in normal tissues and blood cells, was highly expressed (over 90%) in lung cancer cells. Compared with NKP30 CAR-T cells and conventional T cells, IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T cells exhibited stronger proliferative and migration capabilities with the formation of central memory T cells. The reduced expressions of CTLA4 and PD1 in the constructed cells resulted in enhanced killing efficiency against lung cancer cells accompanied by significantly increased production of IFN‑γ, IL-21 and CCL19. In the zebrafish models, CAR-T cells exhibited stronger cytotoxicity and proliferative abilities than typical T cells, but these differences were not statistically significant between the two CAR-T cells. Conclusion Modification of NKP30 CAR-T cells with IL-21 and CCL19 facilitates their access into solid tumors for more effective tumor cell killing while producing a large number of memory T cells.

Graphical abstract

关键词

肺癌 / NKP30 / 嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞 / IL-21 / CCL19

近年来，免疫疗法尤其是单克隆抗体和靶向药物越来越多地应用于肺癌的临床治疗，但仍有很多局限性，如总的缓解率偏低、间质性肺炎及心肌炎等严重副作用^［1］。嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞（CAR-T）疗法对于部分B细胞淋巴瘤和白血病的疗效显著，也为实体瘤的免疫治疗开辟了新途径。CAR-T细胞用于肺癌的治疗主要挑战包括：肺癌的靶抗原存在异质性，靶向抗原的CAR-T细胞特异性不强，导致副作用较大，如脱靶效应与细胞因子风暴等^［2］；肿瘤的周围基质和免疫细胞构建的物理障碍及免疫屏障使得CAR-T细胞难以完全浸润肿瘤组织；肿瘤内部低氧营养匮乏，使得浸润其内的CAR-T难于长时间存活及扩增^［3］。为了解决部分问题，我们在NKp30 CAR-T基础上，将细胞因子IL-21及趋化因子CCL19融合表达于NKP30 CAR-T细胞，形成IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T细胞。

相对于常规CAR-T细胞，IL-21-CCL19NKP30 CAR-T细胞主要有以下优势：首先，NKp30是NK细胞的活化性受体，是NK细胞发挥杀伤活性的关键因素之一。B7-H6作为NKp30的主要配体，特异性的表达在肿瘤细胞表面，目前尚未在健康细胞中发现过B7-H6^{［4， 5］}。其次，细胞因子IL-21可以促进T细胞增殖，长期维持记忆干细胞表型^{［6， 7］}，解决CAR-T细胞在肿瘤内部长期存活问题。再次，趋化因子CCL19能够促进效应T细胞浸润到肿瘤部位^［8］，有望解决CAR-T难以到达实体瘤内部问题。截至目前，已有多个CAR-T细胞的临床研究，亦有少量NKP30 CAR的研究，如Gacerez 等^［9］构建人的NKP30 CAR-T细胞对B7-H6靶向肿瘤非常敏感，取得有效的抗肿瘤活性。目前尚未发现IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T细胞用于实体瘤或肺癌的研究。因此，本研究拟探讨这种新型IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T细胞的靶向性、持久性和趋化性，为临床实体瘤应用研究提供新的方法。

1 材料和方法

1.1 细胞株

人肺癌细胞系H460和DMS114购自中国科学院细胞库。细胞系A549在本实验室保存。所有细胞株均在RPMI 1640培养基中培养，并添加10%胎牛血清和1%抗生素。肺癌抗原使用肺癌细胞株经丝裂霉素（浓度为20 μg/mL）处理2 h，DPBS洗涤2遍，使得肺癌细胞失去活性，但保留抗原性。

1.2 材料

RPMI 1640 （Gibco）；胎牛血清（PAN SERATECH，稀释倍数1∶10）；抗生素（MP-Biomedicals，稀释倍数1∶100）；DPBS（Gibco）；丝裂霉素c（sigma，终浓度20 μg/mL）；淋巴分离液（MP）；KBM581（康宁）；CD3CD28单抗（T Cell TransAct™ human，美天旎，稀释倍数1∶100）；慢病毒（上海汉恒生物公司）；流式抗体CD3-PerCP、CD25-PE、NKP30-APC，B7H6-PE、CD45RO-PE、CD62-APC、PD1-PE、CTLA4-PE（BD）（eBioscience，稀释倍数1∶500）；封闭抗体IL-21R（ATR-107）及CCR7（BD）；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（罗氏）；膜联蛋白PKH26染料（sigma）；ELISPOT试剂盒（达科为）；IL-21及CCL19细胞因子ELISA试剂盒（博士德）；其他细胞因子混合试剂盒（BD）；荧光探针Dil（美伦）。

1.3 方法

1.3.1 CAR表达载体的构建及人T细胞的转导

抗人NKP30 single-chain variable fragment （scFv），CD8a引导链连接人NKP30胞外功能区，CD8 a铰链区和CD28跨膜区，胞内嵌入4.1BB或CD3z共刺激信号域。21×19 CAR是在上述NKP30 CAR基础上加一个启动子（PGK），启动细胞因子IL-21及CCL19，之间嵌入2A序列，允许IL-21和CCL19分开表达。载体自带GFP荧光。采取10 mL健康志愿者的新鲜抗凝血，用淋巴分离液分离外周血单核细胞（PBMC）。经淋巴细胞培养基进行无血清培养，调整细胞浓度为2×10⁶/mL，添加CD3CD28单抗及细胞因子IL-2。37 ℃培养24 h后，进行病毒转染，分组如下；空病毒组（Mock组）；NKP30 CAR T组（Conv.CAR-T组）；IL-21-CCL19 NKP30 CAR T组（21×19 CAR-T组），设定MOI=10∶1，37 ℃培养4 h，去除病毒上清，隔天扩增培养，细胞浓度维持2×10⁶/mL，并添加细胞因子IL-2。

1.3.2 流式细胞术

被检测细胞加入5 μL流式抗体，室温孵育15 min后，PBS洗涤2次，经流式细胞仪检测。所有检测均设同型对照。肺癌NKP30配体B7H6的表达：使用B7H6-PE抗体标记肺癌细胞株；CAR-T细胞增殖分裂倍数：使用PBS稀释染料eFluor™ 670，与免疫细胞悬浮液以1∶1的比例混合。在暗处37 ℃孵育10 min。加入4~5倍体积的冷全培养基终止标记，并在冰上孵育5 min，用完全培养基洗涤细胞3次；CAR-T细胞感染效率：以APC-NKP30及GFP为双指标检测CAR T细胞比例，并分别检测CD4⁺T及CD8⁺T细胞的CAR-T细胞比例；记忆细胞（TCM）的比例：使用CD45RO和CD62抗体进行标记；活化指标：使用CD3及CD25抗体进行标记；耗竭指标：使用PD1或CTLA4抗体进行标记。

1.3.3 细胞迁移实验

responder T 细胞预先用Dye eFluor™ 670标记，取200 μL培养于Trans-well（罗氏）上层小室。Conv. CAR-T或21×19 CAR-T与丝裂霉素c处理的HCG-27细胞共培养3 d，400 μL细胞接种到Transwell下层，培养3 h或5 h。用流式细胞仪检测从上层迁移到下层的细胞。在另外的实验中用Anti-CD21或Anti-CCR7封闭IL-21或CCL19，与上述相同，检测从上层迁移到下层的细胞。

1.3.4 乳酸脱氢酶（LDH）杀伤

效靶比1∶1，CAR-T细胞密度调至1×10⁶/mL，终体积200 μL/孔，设3个复孔。根据说明书设立对照组，包括加入靶细胞的自发释放组（SR靶）、加入靶细胞并在检测前40 min 加入10 mL/L Triton-100的最大释放组（MR靶），只加入效应细胞的自发释放组（SR效应），在37 ℃孵箱中培养4 h。离心后吸出50 μL/孔上清，转移至另一ELISA板，加入50 μL/孔LDH 反应液，室温避光放置30 min后，测定吸光度A_{492 nm} ，计算杀伤活性=［（实验孔-SR效应-SR靶）（/MR靶-SR靶）］×100%。

1.3.5 肿瘤细胞球的杀伤

将肺癌细胞以1×10³ /孔经膜联蛋白PKH26染色（红色），接种于非处理的96孔板中，4 d后，观察成球情况，每孔加入效应细胞，效应细胞与靶细胞1∶1共培养，4 h或24 h动态监测效应细胞对肿瘤细胞的杀伤情况。

1.3.6 酶联免疫斑点技术（ELISPOT）

根据说明书，使用96孔板预先包被人IFN-γ抗体（达科为），采用ELISPOT法检测产生IFN-γ的效应细胞。以NT、Conv. CAR-T细胞及15×19 CAR-T细胞为效应细胞，肺癌细胞为靶细胞。效应细胞与靶细胞共培养24 h（效靶比1∶1），使用AID EliSpot Reader classic （AID GmbH）对斑点形成细胞（SFC）进行计数。

1.3.7 细胞因子释放实验

细胞因子释放实验按照5×10⁴ /孔效应细胞与5×10⁴ /孔HCG-27细胞混合，每组实验设3孔重复，培养于96孔的平板上，KBM581培养基终体积200 μL，孵育3 d，400 g离心5 min。收集游离上清，按照说明书，ELISA检测IFN-γ、IL-21及CCL19细胞因子水平。其他细胞因子IL-2、 IL-4、IL-6、IL-10、TNFα、IFN-γ及IL-17A在流式细胞仪上使用细胞计数珠阵列（CBA）法进行检测，数据使用CBA FCAP Array （BD Biosciences）软件进行处理。

1.3.8 斑马鱼移植瘤模型

斑马鱼由福州百维斯生物科技有限公司提供，异种移植采用注射毛细血管（玻璃毛细血管）连接到微喷射器。斑马鱼受精后48 h 注射HCG-27细胞，注射前HCG-27细胞经红色荧光探针Dil染色，显微注射200个细胞/条至卵黄囊。选择异种移植成功斑马鱼在35 ℃养殖。肿瘤细胞注射后24 h，分组注射效应细胞。PBS组：只注射PBS做为对照；空病毒组（Mock）：注射空病毒转染的T细胞；Conv.CAR-T组：注射NKP30 CAR T细胞；21×19 CAR-T 组：注射IL-21-CCL19 NKP30 CAR T细胞。注射部位及细胞数与肿瘤细胞相同。0hpi及24hpi在体式荧光显微镜下拍摄，通过ImageJ软件计算每条鱼的荧光面积。

1.3.9 统计学分析

所有数据统计分析均使用Prism 9 （GraphPad）软件进行，计量数据以均数±标准差表示，多组间差异比较采用单因素方差分析，两组之间均数比较使用双侧t检验，组间比较使用配对t检验，P<0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NKP30配体在肺癌细胞上的表达

根据Human Proteome Map数据库查找，NKP30的配体B7H6（NRC3LG1）在正常组织及血液细胞不表达（图1A），B7H6在多数肿瘤细胞上有表达，如前列腺癌、肠癌、乳腺癌、肝癌及肺癌等（图1B）。本文检测的3株肺癌细胞均高表达B7H6分子（图1C）。

2.2 21×19 CAR的构建与T细胞体外转染

作为对照，我们构建了常规的的NKP30 CAR，包含CD28、4-1BB和CD3ζ序列（以下简称Conv. CAR），IL-21-CCL19 NKP30 CAR是在此基础上增加单独启动子PGK链接IL-21和CCL19序列，之间用2A分开 （简称21×19 CAR）（图2A）。编码CAR的慢病毒载体转染人类外周血单个核细胞，72 h后荧光显微镜可见明显的GFP荧光（图2B），Conv. CAR或21×19 CAR转染效率第7天左右达到峰值50%以上，但2组之间没有明显差异（图2C）， 进一步细分不同时间点T细胞各亚群的转染效率，第7天，CD4+和CD8+均达50%以上，差异无统计学意义（图2D）。

2.3 21×19 CAR-T细胞促进T细胞增殖与迁移

21×19 CAR-T组增殖明显快于其他组（图3A）。21×19 CAR-T细胞的数量高于其他组，Mock组与Conv.CAR-T组无明显差异（图3B）。经封闭抗体（同型对照抗体、IL-21R单抗或CCR7单抗）刺激5 d，测定记忆细胞绝对数量，IL-21R抗体可完全削弱21×19 CAR-T组的记忆细胞，而CCR7抗体却无此作用（图3C）。迁移试验结果表明，与其他组细胞相比，21×19 CAR-T细胞对T细胞的迁移显著增强（图4D）。CCR7抗体能够阻断CCL19-CCR7 通路，这种趋化能力明显下降（图4E）。

2.4 21×19 CAR-T 细胞的免疫表型

不同组细胞经肺癌抗原刺激24 h后，21×19 CAR-T细胞的活化标志CD25水平明显高于其他组。21×19 CAR-T 细胞的免疫抑制分子CTLA4与PD1显著降低。结果发现，与其他组相比，抗原刺激下21×19 CAR-T 细胞中心记忆TCM（CD62L+CD45RO+）比例显著增加。

2.5 21×19 CAR-T细胞强大的体外杀伤能力

与Mock细胞相比，Conv. CAR-T及21×19 CAR-T细胞对不同肺癌细胞株不同效靶比均明显增加，但后2组之间无明显差异（图5A）。动态荧光观察不同细胞组对肺癌细胞球的杀伤能力，结果显示Mock组杀伤效率低，24 h后仍有大量肿瘤细胞，还有增加趋势，T细胞扩增不明显（图5B）；conv. CAR-T组虽然可见部分免疫细胞扩增，但难于进入细胞球内部，仍然有大量肿瘤细胞存活（图5B）。21×19 CAR-T 4 h内将大部分肿瘤细胞杀灭，伴随效应细胞的扩增。ELISPOT结果显示（图5C），conv. CAR-T细胞组与21×19 CAR-T细胞组产生特异性IFN-γ细胞数量明显高于Mock组，但前两组之间差异没有统计学意义（P>0.05）。

2.6 21×19 CAR-T细胞产生IL‑21 和CCL19细胞因子

21×19 CAR-T细胞能显著促进IL-21产生（图6A）与CCL19分泌（图6B），其他细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、TNFα及IL-17A上清分泌极少，分泌较多的IFN-γ在3组之间差异没有统计学意义。与Mock组比较，conv. CAR-T细胞与21×19 CAR-T细胞分泌较多的细胞因子IL-6，后两组差异没有统计学意义（图6C）。

2.7 21×19 CAR-T细胞介导斑马鱼体内肺癌的杀伤

本研究将A549细胞及效应细胞被植入每条斑马鱼的卵黄囊，体视荧光显微镜监测癌细胞和效应的存活情况（图7A）。结果显示PBS组肿瘤细胞面积无缩小，甚至有增加趋势（图7B）。Mock组肿瘤面积无缩小（图7D），效应T细胞无扩增（图7C）。conv. CAR-T 细胞与21×19 CAR-T细胞在斑马鱼体内遇到A549细胞后不同程度扩增（图7E、G）。conv. CAR-T 组与21×19 CAR-T组肿瘤细胞24 h后不同程度缩小（图7F、H）。

3 讨论

CAR经历了4代的发展，第4代 CAR是在第3代CAR基础上，进行各种改造，包括逻辑门及添加各种细胞因子等^{［10， 11］}。本文构建的新型IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T细胞，副作用较小，能够分泌大量的IL-21和CCL19因子，CAR-T细胞容易浸润到肿瘤内部，并促进中心记忆T细胞产生，抑制T细胞耗竭。

CAR-T细胞对肿瘤细胞特异性的核心是选择合适的靶点，目前肺癌CAR-T热门靶点已有10余种，包括间皮素、黏蛋白Tn 突变体、表皮生长因子受体等^［12-14］。本文选择NKP30 作为CAR靶点，具有以下优点：①NKp30的配体B7-H6特异性表达肿瘤细胞上，可视为肿瘤特异性抗原，不会引起“误伤”的现象。②NKP30 CAR-T细胞表达的CAR不含有识别肿瘤表面抗原的抗体片段，不会引发患者免疫反应的蛋白结构，从而降低了CAR-T细胞被患者免疫系统排斥的可能性。所以NKP30 CAR-T较传统的CAR-T细胞有明显优势。

本文在NKP30 CAR-T细胞上融合了细胞因子IL-21及趋化因子CCL19，主要因为这2种因子对CAR-T细胞具有独特作用。IL-21主要由活化的 CD4+T细胞产生，调节免疫细胞活性，能够刺激B细胞分化成记忆细胞和T细胞增殖^［15］。有报道IL-21可以促进CAR-T细胞长期维持记忆干细胞表型，调节局部微环境并辅助CAR-T细胞功能^［16-18］。本实验IL-21能够显著提高 NKP30 CAR-T细胞增殖能力，产生更多中心记忆细胞（CD45RA+CD62L+）。纤维网状细胞分泌的CCL19 能够趋化外周DC细胞、T细胞到达淋巴器官^［19］，Adachi等^［20］在CAR结构中加入CCL19，能够招募体内DC细胞和T细胞到达肿瘤部位，引起自体免疫细胞反应，有效提高肿瘤清除能力。本研究融合了CCL19的CAR-T细胞，能够主动招募T细胞，迁移到肿瘤部位，增强内部肿瘤细胞杀伤。

目前评估CAR-T细胞临床前的金标准是小鼠异种移植。然而，小鼠异种移植实验是昂贵和缓慢的。因此，其他脊椎动物体内实验将有助于弥补从体外到小鼠异种移植的差距。由于斑马鱼在胚胎和早期发育阶段缺乏功能性适应性免疫系统，移植细胞不会产生排斥^［21-23］，斑马鱼异种移植模型已成功用于抗肿瘤作用^［24-26］，已有学者应用斑马鱼进行CAR-T细胞体内研究，如Pascoal等^［27］用胚胎斑马鱼成功进行CAR-19的研究。我们基于斑马鱼异种移植的方法来研究CAR-T细胞介导的对人类肺癌的杀伤。结果发现21×19 CAR-T细胞对斑马鱼体内肺癌细胞的杀伤明显高于普通T细胞，同时CAR-T细胞增殖明显。由于效应细胞杀伤肿瘤细胞时，效应细胞直接显微注射到肿瘤内部，无法如小鼠实验，经尾静脉注射效应细胞可以观察是否浸润到肿瘤内部，本研究结果显示21×19 CAR-T与conv. CAR-T细胞对肿瘤杀伤无明显差异。斑马鱼移植瘤模型相比小鼠还有其他缺陷，比如无法分离斑马鱼体内肿瘤细胞，无法进一步研究；观察时间较短，无法比较生存期；操作需要借助显微注射，对实验人员技术要求较高等。

虽然本研究构建的新型CAR-T细胞解决部分问题，但还有很多值得改进地方，如体内免疫应答过强又会产生细胞因子释放综合征（CRS）^［28］。除了阻断IL-6途径外^［29］，有研究者尝试通过改变CAR基因转染方式，导入“自杀基因”以及利用纳米微粒调控CAR-T细胞的体内寿命和动力学，用来削弱或避免CRS^［30］。

综上所述，本研究在NKP30 CAR-T中加入细胞因子IL-21及趋化因子CCL19，构建了新型的第4代CAR-T细胞。初步结果显示，这种新型CAR-T细胞增殖能力增强，在杀伤靶细胞过程中，能够产生更多中心记忆细胞。而且这种新型CAR-T细胞能够促进CAR-T 细胞浸润到肿瘤内部，提高肿瘤清除能力，解决了普通CAR-T细胞的缺陷。为进一步临床研究打下良好的理论基础。

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