循环肿瘤细胞的响应性分离、释放和临床应用研究进展

Recent advances in responsive isolation, release and clinical application of circulating tumor cells

摘要

循环肿瘤细胞（CTCs）是从肿瘤组织上分离并进入淋巴系统或血液的细胞，虽然在体液中数量极少却与肿瘤的转移和复发密切相关。CTCs包含完整病理信息，可通过对CTCs的分离、富集和分析来提取这些能够指导癌症诊治的信息，从而显著改善癌症的监测效率和预后状况。与传统组织活检相比，使用CTCs作为生物标志物的液体活检技术可以实现肿瘤信息的特异性检测和动态持续检测并减轻患者痛苦。为了实现CTCs的检测，首先必须将CTCs从体液中分离，分离后则需要将其释放富集，本文将详细描述CTCs的响应性分离（包括光、介电泳、声波电泳和磁泳）、化学分离（特异性分子和拓扑结构）和响应性释放（包括光、电、热、pH、酶响应以及可降解基底）的最新研究进展。响应性分离利用CTCs与血细胞物理性质的差异进行分离，化学分离利用特异性识别来捕获CTCs。这些先进的分离和释放的技术具备细胞损伤低和特异性高的特点，为进一步分析提供了条件。目前CTCs检测可应用于多种癌症的检测，本文在最后讨论了CTCs对各种癌症（如肺癌、肝癌、结直肠癌和前列腺癌）的早期诊断和预后评估等方面的作用。

Abstract

Circulating tumor cells (CTCs) are cells that dissociate from the tumor tissue and enter the lymphatic system or bloodstream with close association with tumor metastasis and recurrence. CTCs contain complete pathological information, which can be extracted by isolation, enrichment, and analysis of the CTCs to guide cancer diagnosis and treatment, thereby significantly improving the monitoring efficiency and prognosis of cancer. Compared with tissue biopsy, liquid biopsy with CTCs as a biomarker enables specific and dynamic detection of tumor growth with a less painful experience. For detection of CTCs, the cells must be captured from body fluids, followed then by their release and enrichment. This review summaries the latest research progress in responsive isolation of CTCs (e.g. with light, dielectrophoresis, acoustophoresis and magnetophoresis), chemical isolation (specific molecules and topological structure) and responsive release (e.g., light, electric, thermal, pH, enzyme responsiveness, and substrates break). Responsive isolation utilizes the differences in physical properties between CTCs and blood cells, while chemical isolation utilizes specific recognition mechanisms to capture the CTCs. These techniques result in low cell damage with a high specificity to facilitate further analysis. Currently, CTC detection has been applied for early diagnosis and prognostic assessment of multiple cancers including lung cancer, liver cancer, colorectal cancer, and prostate cancer.

Graphical abstract

关键词

循环肿瘤细胞 / 液体活检 / 响应性分离 / 响应性释放 / 诊断

Key words

circulating tumor cells / liquid biopsy / responsive isolation / responsive release / diagnosis

液体活检是指以血液^［1］、唾液^［2］和尿液^［3］等体液为检测来源来获取疾病有关的生物信息的一种技术。与传统穿刺有创的活检不同，液体活检具备非侵入性和快速的特点^{［4， 5］}。通过分析体液中的生物标志物，能够为癌症的筛查、检测和治疗提供帮助。在众多生物标志物种，循环肿瘤细胞（CTCs）是其中一种具有前景的生物标志物^{［6， 7］}。

CTCs是从肿瘤组织中脱落并进入淋巴系统或血液循环的肿瘤细胞^［7］。许多研究表明，CTCs的释放和转运是癌症转移的潜在诱因，CTCs与癌症临床结果之间具备相关性^［8-10］。CTCs携带肿瘤组织的完整信息^{［11， 12］}，通过分析CTCs，可以获取患者患癌期间全面的信息，从而能够随时评估患者的预后并进行差异化的治疗^{［8， 13， 14］}。本综述旨在介绍CTCs相关的响应性分离及释放技术及在临床中的应用，为肿瘤诊断及精准治疗提供参考。

1 CTC响应性分离和释放技术

CTCs在外周血中的分布极少，因此需要将其与血细胞进行分离并进一步提纯^［15］。近些年在分离CTCs方面已经取得了许多重大的突破。在分离CTCs的方法中，基于物理特征的响应性分离可以实现无标记分离，这种分离技术对细胞完整性的干扰小，便于进行进一步分析^{［16， 17］}。此外，基于化学特征的分离从增强细胞与分离基底的亲和力出发，利用具有特异性结合能力的分子或是拓扑结构的匹配来提高CTC分离的特异性和准确性^{［8， 18-20］}。然而，分离CTCs并未完成对其进行检测的目的，CTCs在分离后仍留在分离材料上，因此开发了多种刺激响应性的CTC释放策略，通过释放CTCs来进行体外培养等下游分析^{［21， 22］}。通过响应性、结构、分子特征的配合，可完善CTC的分离和释放过程，最终提高液体活检的分析能力。

1.1 基于物理特征的CTC响应性分离

CTC分离的物理策略涉及使用外部场来操纵CTCs，如光^［23］、介电场^［24］、声场^［25］、和磁力^［26］。这些技术通过施加外力来选择性地移动CTC，从而将其与血细胞分离。

1.1.1 基于光操纵的CTC分离

肿瘤细胞的光学常数与其它血细胞具有差异，这种光学常数的差异可被用于分离CTC。然而，白细胞（WBCs）与CTCs具备相似的光学常数，这限制了光操纵分离方式的纯度。有研究为了解决这一问题，将红细胞（RBCs）与CTCs进行结合，产生的光学常数差异使分离纯度达到了92%，同时回收率也达到了90%以上^［23］。另外，通过分离通道的优化设计，也可以实现光响应的CTC分离（图1A）^［27］。这种分离方法虽然可以实现高纯度和高回收率，然而WBCs在许多物理特性上与CTCs的相似增加了预处理的步骤和器件制造的难度。

1.1.2 基于介电电泳的CTC分离

由于CTCs与血细胞相比具有明显的介电特性，因此介电电泳（DEP）可被用于分离CTCs（图1B）^［28］。细胞在非均匀电场下极化会产生偶极矩，从而能够根据最大场强区域移动，这与电导率、渗透率、电场大小和频率以及液体极化率等因素有关^［29］。DEP与流体学分离CTC相结合，可以实现高效快速的CTC分离^［24］。另一项研究是在微流控装置中引入了一种带有V形电极的DEP驱动芯片，其能够在1 h内从2 mL外周血样本中连续分离CTC，使得血细胞数量减少96.5%，CTC富集效率提高18.6倍^［30］。

1.1.3 基于声波的CTC分离

声波电泳是一种利用声波和带电细胞相互作用来实现CTC捕获的方法，分离效率高且不会对CTCs造成损伤（图1C）^{［31， 32］}。首先调节通道宽度来创建一个优化的声学驻波谐振腔，接着，通过声流体的颗粒分离技术将声能耦合到液体中，实现对流体和颗粒的精确控制^［33］。在静声场下，声流装置可以实现对癌细胞的高效分选，分离效率可达到（91.5±4.5）%^［25］。

1.1.4 基于磁泳的CTC分离

基于磁泳的CTC分离技术根据是否将CTCs吸引到磁源而分为正磁泳和负磁泳。正磁泳将被磁性粒子（MPs）标记的CTCs吸引到磁源^［34］，负磁泳通过吸引磁性介质而将没有磁性的CTCs推开^［17］。通过调节样品流速，操纵铁磁流体中磁性材料的体积浓度和磁场强度梯度，实现了基于负磁泳的CTC分离（图1D）^［26］，在临床样品中实现较高的CTC分离效率。

这些基于物理特征的响应性CTC分离技术通常具备无标记的特点，能够保持细胞完整性。但其依赖外力进行分离的方法因其通量低而受到限制。另外，这些技术涉及复杂的预处理工艺，增加了医护人员的学习成本和规模化应用门槛。此外，仅依靠物理特征分离CTC可能无法解决分离特异性和细胞异质性等问题，从而降低对特定患者群体的敏感性。因此，未来的研究可能需要整合多种特征和响应性来应对这些新挑战。

1.2 基于化学特征的CTC分离

CTCs起源于携带不同于血细胞的多种信息的肿瘤组织^{［1， 5］}。因此，在物理特征外，还可以利用CTC细胞膜中存在的生物分子，尤其是特定蛋白质。例如EpCAM^［36］、上皮生长因子受体（EGFR）^［37］、人表皮生长因子受体2^［38］、和间充质干细胞抗原^{［39， 40］}。通过特异性的结合剂（如抗体^［19］、肽^［41］、适体^［42］或生物膜^［43］）将这些生物识别分子连接到底物上，可以实现基于化学识别的CTC分离。此外，CTC表面结构（如细胞体和伪足）和底物之间的拓扑结构匹配，为CTC分离提供了额外的优势^{［8， 19， 20， 44， 45］}。结合分子识别和结构匹配，为实际应用中高效和特异的CTC分离提供了可行的途径（图2）。

1.2.1 特异性分子

除了可利用抗体标记MNPs来分离CTC外^［11］，还可以利用能够与CTC建立化学键的各种特异性抗体来分离CTC。EpCAM蛋白是CTC分离的一个常用靶点。有研究证明了在不同癌症类型中使用Anti-EpCAM的CTCs分离具有较高的分离效率^{［19， 46］}。然而，CTC在上皮间质转化（EMT）期间表面蛋白会发生改变，具体表现为EpCAM低表达，而N-钙粘蛋白高表达^［47］。因此可以利用靶向EpCAM和N-钙粘蛋白的共同抗体来捕获CTC。有研究开发了一种用多抗体共同修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米纤维基底来分离CTCs^［39］。与单抗体修饰的方法相比，这种多抗体修饰的策略对上皮细胞和间充质细胞的捕获效率均有提高。除了EMT会导致靶向蛋白的改变外，来源于不同组织的CTC会表现出不同的蛋白质。Wang等^［8］通过用Anti-EpCAM和Anti-PSMA（前列腺特异性膜抗原抗体）修饰的基于还原氧化石墨烯（rGO）的CTC分离平台，实现对前列腺癌CTC高达90.3%的捕获效率。

肽由于低成本、易保存、一致性高和易于生产等优点，有望成为抗体的替代品。有研究使用肽的CTC富集平台，并开发了用于高效CTC分离的TumorFisher®平台^［48］，设计了各种肽，成功的从不同类型的癌症中分离CTCs，并转化为临床实践。对于EMT期的CTCs，有研究筛选了一种靶向N-钙粘蛋白的新肽^［41］，实现了CTCs的高效捕获，捕获率约为85%。此外，López及其同事配制了专门针对癌症CTCs的细胞膜蛋白EpCAM和EGFR的肽改性纳米乳液^［49］。

适体是一种合成的寡核苷酸，对癌细胞膜上的蛋白质具有较高的特异性和亲和力^［50］。一种以三维DNA结构（TDN）为框架的微流控芯片^［51］，由于TDN高度精确的尺寸和刚性框架，捕获效率提高到87%左右。通过在纳米级的Ag上功能化双四面体DNA探针，分子识别和拓扑结构匹配的协同作用使的SGC-7901细胞在PBS缓冲液中的捕获效率提高到90.2%^［52］。

CTC分离方法的基本原理可分为4部分：鉴定高表达的蛋白质、筛选特定分子、在底物上修饰特定分子，最终分离CTCs。这种基本方法可能面临无法识别EpCAM阴性的CTCs和与WBCs进行非特异性吸附的局限性。为解决这一问题，有研究创新使用覆盖有生物膜的基质，利用从癌细胞和WBCs中提取的杂交膜包裹了免疫磁珠（MBs）^［43］。这些仿生免疫磁珠在保证了高效率特异性分离CTCs的同时，由于WBCs膜的存在，对背景血细胞的亲和力也会大大降低。

1.2.2 拓扑结构

化学分离需要一个底物来负载特异性识别分子。目前有3种可作为CTC分离底物的策略，即MBs^［53］、微流体^［19］、和捕获芯片^［44］。

在上述3种策略中，纳米/微米级MBs是CTC分离中应用最广泛的^{［54， 55］}。MBs表面修饰上特定识别分子后能够快速捕获靶细胞，并能够在磁场下快速分离。根据选择识别分子的不同，MBs可用于阳性CTC的捕获^［53］或阴性血细胞的分离^［56］。然而，目前使用的大多数MBs表面光滑，无明显结构，这可能会产生低灵敏度和低特异性等问题。Song等^［57］介绍了一种使用静电相互作用调节乳液界面聚合来制备纳米分形微粒的新方法。这些纳米微粒经修饰上特异性识别分子后，能够快速捕获、释放和分离蛋白质。另外，微粒表面上的微纳米结构可以很好地与癌症细胞上的伪足相匹配。除了球形MBs外，还开发了使用DNA适体功能化的磁性短纳米纤维，用于高效捕获和释放CTCs^［58］。

除MBs外，结构化底物为与细胞相互作用提供了独特的表面。例如，纳米线结构可提供更高比表面积，Tseng利用这一结构来进行CTC分离，不仅实现单个CTC的分离，还实现了CTC簇分离^{［19， 59， 60］}。Wang等 ^［8］设计了纳米片、纳米分形和纳米花等仿生界面 ^{［20， 44， 45， 61］}，利用结合拓扑匹配与分子识别的协同作用，可以高效与特异性地分离CTCs。

为了提高CTC的化学分离效率，可有以下几种策略：选择更合适的特异性结合剂；增加捕获基质的比表面积，从而赋予其更多的特异性识别分子；结合界面应具备相似的尺寸或互补的结构，从而实现与细胞的拓扑匹配。此外，传统的化学分离策略仍然依赖于与基质和细胞的被动相互作用，捕获基质需要被动等待细胞与之结合，而不是像免疫细胞那样主动进行捕获。主动CTC捕获的发展可能会缩短等待时间和检测步骤，从而促进癌症的大规模检测。

基于化学特征的捕获策略具备卓越的捕获性能，然而它们往往将细胞严格限制在捕获底物上，这限制了对CTCs中数据的提取^{［8， 43， 45］}。在进一步结合了光电化学生物传感器^［62］、表面等离子体共振^［63］、和使用猝灭效应的传感器^［64］等技术后，CTCs的分离和分析能力得到进一步的提高。但是，分离存在着试剂昂贵、程序复杂和数据显示非直观等问题，这些都是临床使用中有待解决的难题。

1.3 CTC的响应性释放

在分离CTCs后，需要将CTCs与底物分离来进行一步分析。一些处理方法，如施加物理力^［65］和胰蛋白酶消化^［66］会对CTCs造成损伤，导致无法提取出完整的信息。因此，许多研究从响应性的角度实现了CTCs的无损释放，包括光^［67］、电^［68］、热^［69］、pH^［21］、酶响应^［70］和降解基底^［71］等。

1.3.1 光响应

光响应性CTC释放可以通过设计对光敏感的键来实现。有研究^［72］以7-氨基香豆素作为光释放剂，光释放剂一端连接抗体，一端连接修饰后的MBs。在紫外（UV）或近红外（NIR）的照射下，香豆素中的C-O键发生断裂，从而将CTCs与捕获基底MBs分隔开来，释放效率分别达到了（73±4）%和（52±6）%（图3A）。然而，紫外照射等手段不可避免会对CTCs造成损伤，有研究合成了一种暴露于可见光（400-450 nm）时裂解的光释放剂^［67］。将SKBR3细胞与光释放剂相结合，在可见光照射2 min后就达到94%的释放效率。这种光响应键使核酸损伤最小化，细胞存活率高达94%。

1.3.2 电响应

利用电化学操纵技术，电信号被转化为化学信号。电化学还原脱附有诸多优势，包括保持细胞活性的能力和强大的释放能力。使用抗EpCAM修饰半导体硅表面来分离CTC，随后施加1.2V的电位和光照来释放单个单元内的CTC（图3B）^［68］。施加电位后酰胺键的断裂可以使捕获的CTCs高效释放。由于电位被限制在光照射的单个单元内，从而实现了光电的协同响应。该电化学过程并未导致细胞膜的破裂，从而保证了CTCs的高活力。

1.3.3 热响应

热响应释放CTCs是指利用热响应材料来连接识别分子，从而在温度变化后实现连接的断开。聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）是一种常见的热响应聚合物，PNIPAM在低于较低临界溶液温度时会发生构象改变，导致其与CTC亲疏性的改变。Liu等^［69］将PNIPAM分子刷接枝到硅纳米线上。在37 ℃时PNIPAM、抗体和生物素-BSA的结合可以实现CTCs的捕获，当降低到20 ℃时，PNIPAM的骨架扩张，生物素-BSA从表面脱附，从而释放CTCs（图3C）。

1.3.4 pH响应

通过改变pH值，可以使识别分子和底物之间的化学键断开，从而导致了CTCs的释放。Neoh等^［21］设计了玻璃/聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控pH响应碳纳米管（CNT）芯片用于捕获和释放CTCs。pH响应性聚-L-赖氨酸与EpCAM抗体相连接，实现了86.7%±9.3%的捕获效率。随后，提高pH值从而产生构象变化，实现了84.7%±12.2%的释放效率。此外，释放的CTCs具有84.6%±5.5%的生物学活性，进一步进行再培养，细胞形态和EpCAM表达均无变化。然而，当pH改变程度超过了细胞培养环境范围，可能会损害细胞的存活率和完整性。

1.3.5 酶响应

酶响应使CTCs与底物分离通常涉及胰蛋白酶使膜相干分子失效。酶响应释放的方法具备很高的特异性^［70］，但是这种策略可能会损害表面标记和膜结构，从而影响后续的CTCs分析。所以为了尽可能保留CTCs中封装的信息，需要开发能够使特定分子和底物之间的连接失效而不影响细胞活性的酶。Liu等^［73］设计了一种修饰了适体DNA纳米结构的图案化微流控芯片（图3E）。DNA纳米结构的引入使核酸酶更容易和适体接触，从而释放出高完整性和高活性的CTCs。

1.3.6 可降解基底

将CTCs从捕获基底上分离的最直接策略之一是将基底分解。例如，有研究构筑了由金纳米棒（GNR）和热响应水凝胶组成的CTC捕获和释放界面（图3F）^［71］。靶癌细胞对水凝胶的压印可以获取能更高效捕获CTCs的微纳结构，实现了92%±6%的CTCs捕获效率。随后，NIR光照激活GNR，升高水凝胶的温度，在37 ℃时热响应基底裂解，获得了92%±6%的释放效率和90%的细胞活性。

根据捕获基底和CTC表面分子不同的性质，可以采取合适的响应性策略来有效释放捕获的CTC，并保证细胞的高存活性。

2 基于CTC的临床应用

分离CTCs的最终目的是得到所包含的有关原发性肿瘤的信息，可以使医生更有效地指导患者治疗。在各种肿瘤类型的临床应用中，CTCs都显示出相当大的潜力，如肺癌^［74］、肝癌^［75］、结直肠癌^［76］和前列腺癌^［8］。CTCs计数可用于癌症的疗效和预后评估，可能在患者出现临床症状前提供复发或转移的预测。

2.1 肺癌

肺癌是癌症死亡的主要原因，是全球第2大难以诊断的癌症^［77］。传统肺癌筛查方法准确率低，如低剂量CT（LDCT）在筛查过程中容易出现假阳性，导致检测准确率的下降。许多患者在经过初步治疗后仍出现复发或转移，导致肺癌患者CTC数量显著的增加，因而可根据治疗后CTCs的数目来判断癌症的进展^［74］。研究表明，可根据每7.5 mL血液中CTC的数量（≥2和≥5）来判断无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）^［78］。

2.2 肝癌

肝癌（HCC）是全球癌症死亡的第3大原因^［77］，术后复发率达到60%以上。肝活检虽然可以明确诊断HCC，然而其有创性和风险性使其在实际临床过程中受到限制。针对HCC患者的CTC计数表明，进行手术干预会导致CTC数量减少^［75］，外周血中CTC簇的存在会导致预后较差^［9］。随着肝癌的发展，CTCs倾向于经历EMT过程并侵入循环系统和组织，因此可以通过分析CTCs和CTC-WBC簇的间充质基因组变化来监测肝癌和指导治疗^［79］。

2.3 结直肠癌

结直肠癌（CRC）是第3大发病率和第2大死亡率的癌症^［77］。CRC与国家经济发展高度相关，高热量饮食和久坐等因素都会增加结直肠癌的发病率。CRC的局部复发率较高，容易出现局部浸润和转移。Magri等^［80］使用ARB101抗体从CRC患者的血液中高效特异性分离出CTCs^［76］。在TNM I至IV期的CRC患者中检测出77%的ARB101阳性CTC，并在 TNM I至III期的CRC患者手术前后检测到ARB101阳性CTC水平存在显著差异。一项针对218例CRC患者的研究表明，在任何测量时间点都没有CTCs的患者预后最佳，而两次检查中均显示CTC阳性患者的PFS和OS较低，证明了CTCs可用于预测CRC患者预后。

2.4 前列腺癌

前列腺癌（PCa）是第2常见癌症和第5大癌症死因^［77］。目前，前列腺癌特异性抗原（PSA）用于前列腺癌筛查的技术已使用20多年，这一筛查技术显著降低了PCa的死亡风险。然而，其他前列腺相关的疾病例如前列腺增生或前列腺炎等也会导致PSA水平的升高，导致假阳性的出现。为提高PCa诊断的准确性，Wang等 ^［8］采用双抗体修饰的rGO芯片构筑了PCa诊断平台，对PSA灰区（PSA在4~10 ng/mL）患者实现了高达91.7%的诊断灵敏度。因此，CTC检测方法为无损检测PCa提供了一个有效的手段。

3 总结及展望

本文我们总结了CTCs响应性分离和释放的最新技术，以及在临床上的代表性应用。目前，临床应用要求CTCs的检测必须具备高灵敏度和高特异性，同时尽可能简化流程并不破坏细胞。尽管该领域已经取得重大突破进展，但在临床中相关技术的应用仍然有限。需进一步开展多中心合作，扩大患者的使用数量，验证CTCs分离技术的可行性与稳定性。总之，CTCs响应性分离与释放技术的不断发展将为癌症的早期诊断提供准确性更高的解决方案。将材料学，化学，人工智能和临床医学等学科进一步交叉融合，有望推动临床决策迈入新的阶段。

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基金资助

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