RgpB通过抑制自噬小体与溶酶体融合避免Cx43降解参与食管癌化疗耐药

RgpB contributes to chemoresistance in esophageal squamous cell carcinoma by preventing Cx43 degradation via inhibiting autophagosome-lysosome fusion

摘要

目的 探讨牙龈卟啉单胞菌（Pg）的毒力因子RgpB在食管鳞癌化疗耐药中的作用机制。 方法 采用免疫沉淀-质谱联用技术筛选与Pg的毒力因子RgpB互作的自噬调节因子；运用免疫共沉淀实验探索RgpB和自噬调节因子TBC1D5之间的相互作用；采用蛋白免疫印迹法测定Pg感染对食管癌细胞膜受体分子Cx43表达的影响；使用细胞免疫荧光检测Lamp1、Cx43与TBC1D5的关系；利用自噬双荧光观察Pg感染对自噬小体与溶酶体融合的影响；使用平板克隆及CCK-8法检测Pg感染及Cx43抑制剂在使用化疗药后对食管癌细胞系增殖作用的影响。 结果 免疫沉淀-质谱联用技术筛选出与RgpB互作的自噬调节因子TBC1D5；免疫共沉淀结果显示，Pg分泌的毒力因子 RgpB可与自噬调节因子TBC1D5直接结合并相互作用；蛋白免疫印迹法结果显示，感染Pg后食管癌细胞膜Cx43表达量高于未感染组（P<0.05）；细胞免疫荧光结果显示，在感染Pg后，Cx43在细胞膜表面的表达量增加（P<0.05）；stubRFP-sensGFP-LC3自噬双荧光结果显示，在Pg感染时，自噬体与溶酶体融合受到阻断；平板克隆及CCK-8法结果显示，使用化疗药后，Cx43抑制剂能够逆转Pg感染对食管癌细胞系的促进作用。 结论 Pg入侵食管癌，其毒力因子RgpB阻碍自噬小体与溶酶体融合，从而使膜受体分子Cx43免受溶酶体降解，导致食管癌化疗耐药。

Abstract

Objective To investigate the mechanism through which RgpB, a virulence factor of Porphyromonas gingivalis (Pg), induces chemoresistance in esophageal squamous carcinoma. Methods The autophagy-regulating factors that interact with RgpB were screened by immunoprecipitation-mass spectrometry. The interaction between RgpB and the autophagy regulator TBC1D5 was investigated using co-immunoprecipitation. The impact of Pg infection on the expression of esophageal cancer cell membrane receptor molecule Cx43 was assessed using Western blotting. Immunofluorescence assay was used to analyze the relationship among Lamp1, Cx43 and TBC1D5. The effect of Pg infection on autophagosome-lysosome fusion was evaluated using autophagy double fluorescence technique. The effects of Pg infection and a Cx43 inhibitor on proliferation of esophageal cancer cells after chemotherapy were examined with plate cloning assay and CCK-8 method. Results Immunoprecipitation-mass spectrometry identified TBC1D5 as an autophagy regulator interacting with RgpB, and co-immunoprecipitation suggested that RgpB could directly bind to TBC1D5. In Pg-infected esophageal cancer cells, the expression of Cx43 on the cell membrane was significantly higher than that in non-infected cells. Immunofluorescence assay showed that the expression of Cx43 on the membrane of esophageal cancer cells increased significantly after Pg infection, which blocked autophagosome-lysosome fusion as shown by stubRFP-sensGFP-LC3 lentivirus study. Plate cloning assay and CCK-8 assay showed that the Cx43 inhibitor significantly attenuated the effect of Pg infection for promoting proliferation of esophageal cancer cells after chemotherapy. Conclusion Pg infection in esophageal cancer blocked autophagosome-lysosome fusion in the tumor cells, thereby preventing Cx43 from lysosomal degradation and leading to chemoresistance of esophageal cancer.

Graphical abstract

关键词

食管鳞状细胞癌 / 牙龈卟啉单胞菌 / RgpB / Cx43 / 化疗耐药

Key words

esophageal squamous cell carcinoma / Porphyromonas gingivalis / RgpB / Cx43 / chemotherapy resistance

食管癌属于消化系统恶性肿瘤，发生率极高^［1］。食管鳞状细胞癌（ESCC）占食管癌每年发病率的近90%，已成为全球第6大常见癌症相关死亡原因^{［2， 3］}。尽管当前医疗水平不断提高，但ESCC仍是全球性挑战，其治疗需要多学科交叉融合，包括外科手术、放射治疗及化学治疗^{［4， 5］}。牙龈卟啉单胞菌（Pg）是一种革兰氏阴性厌氧菌，其相关的多种毒力因子已被报道^［6-9］，包括精氨酸和赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶^［10］。精氨酸-牙龈蛋白酶是降解各种宿主蛋白的最终毒力因子之一，可导致细胞完整性和功能受损^［9］。RgpA和RgpB是编码精氨酸-牙龈蛋白酶的两个主要基因^{［11， 12］}，其中RgpB可编码催化结构域和前肽，只需在这两个结构域Arg230-Tyr231的连接处进行相应处理，即可释放活性单体酶。Pg是食管鳞癌的一个显著高危因素^［13］。Pg显著干扰宿主细胞的炎症、凋亡和自噬等关键生物学通路。

缝隙连接蛋白43（Cx43）主要分布于细胞膜表面，在人体中的表达最为丰富^［14-16］。Cx43在细胞间形成缝隙连接，为相邻细胞的信息交流提供必要通道，细胞通过缝隙连接所产生的细胞间通讯在控制细胞生长和维持组织内稳态方面起着重要作用。Cx43通常在不同组织类型的背景下发挥特定功能^［17-19］，目前报道Cx43在食管癌中发挥作用的研究有限。有研究评估Cx43在ESCC患者中的表达状态，发现Cx43在食管鳞状细胞癌患者中表达频率较高，Cx43高表达患者的生存率明显低于Cx43低表达患者^［20］。有研究发现Cx43可能是食管癌的潜在预后标志物和治疗靶点^［21］，在食管癌的发生、发展和耐药性调控中发挥重要作用。但目前，病原体通过调节自噬融合来增强食管癌治疗抗药性的机制研究尚未见报道。基于此，本研究通过联合应用免疫沉淀-质谱联用技术及细胞生物学方法，对Pg毒力因子RgpB影响自噬小体与溶酶体的融合进行探究，拟探明RgpB促使Cx43逃避溶酶体降解及细胞表面异常蓄积导致食管癌细胞化疗抵抗的具体作用机制，从而为食管癌相关治疗策略的制定提供重要科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞及质粒

人食管鳞状细胞癌细胞KYSE150（河南省肿瘤表观遗传重点实验室提供），人胚肾HEK293T细胞（BNCC），质粒（GeneCopoeia和广州易锦生物技术有限公司联合提供）。

1.1.2 主要试剂

BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；Cx43抗体、HA抗体（CST）；Lamp1抗体、免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒（Ther-mofisher）；Flag抗体、TBC1D5抗体（Abcam）。

1.1.3 主要仪器

凝胶成像分析仪（Bio-rad），TE2000倒置荧光显微镜（Nikon），C2 SI高分辨率激光共聚焦显微镜（Nikon）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与转染

使用RPMI 1640培养基、DMEM高糖培养基（细胞培养基中添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗溶液）培养KYSE150细胞和HEK293T细胞，放置于5% CO₂、37 ℃恒温培养箱中，根据细胞生长状态定期换液并传代。当细胞处于对数生长期时，使用胰酶进行消化，离心后收集细胞。转染前1 d换成基础培养基，按1×10⁶/孔均匀铺于6孔板内。用对数生长期细胞进行细胞转染，将预先构建好的RgpB、TBC1D5质粒转染至HEK293T 细胞中，10 h后换液，24 h后处理细胞，留存细胞蛋白用于后续实验。

1.2.2 菌株培养与感染

用BHI（肉汤）培养基对标准菌株Pg进行培养。将细菌放置于含有5% CO₂、10% H₂、85% N₂、37 ℃厌氧培养箱内，当细菌处于对数生长期时，吸取少量菌液，测定其在600 nm处的吸光度值，使用吸光度值为1~2的菌液用于细胞感染。取浓度为1×10⁹ CFU/mL的菌液，离心、去上清液后重悬。根据感染复数（MOI）=10，在细胞培养基中加入相应体积的菌液进行细胞感染。

1.2.3 蛋白银染实验

实验分为对照组和RgpB感染组。室温下将蛋白凝胶先后放入固定液、敏化液中各30 min。去离子水清洗后，放入银染液、显色液中各30 min、5 min，去除显色液，加入终止液。用凝胶成像仪进行拍照，以便进一步数据分析。

1.2.4 免疫共沉淀（Co-IP）

向培养皿中加入IP裂解液后，置于冰上裂解细胞10 min，用刮板刮取细胞并收集到离心管中，在12 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，收集上清；加入2~10 μg抗体进行孵育，加入25 μL的蛋白A/G磁珠，置于摇床上缓慢摇晃，4 ℃过夜。加入IP洗涤液轻轻混匀，用磁力架收集磁珠，小心吸去上清液。加入SDS加样缓冲液，煮沸10 min。最终所得蛋白用于蛋白免疫印迹实验，并使用凝胶成像仪进行检测分析。

1.2.5 Western blotting检测

加入配制的裂解液，将不同组的细胞放至冰上裂解、刮取、振荡、离心后，收集上清。采用BCA法对上述所得蛋白进行定量，蛋白按照测定结果加入Loading Buffer，沸水煮10 min。制胶（SDS-PAGE）、上样、电泳、转膜后，放入5%的脱脂奶粉中封闭1 h，然后使用含吐温的Tris缓冲液（TBST）洗膜。TBST稀释抗体至相应浓度，加入一抗，4 ℃孵育过夜。TBST清洗，加入二抗，室温孵育1 h，TBST清洗后，加入显影液对图像进行曝光分析。

1.2.6 细胞免疫荧光实验

对KYSE150进行消化、重悬、计数后，于玻璃底共聚焦小皿接种1×10³细胞进行培养，4%多聚甲醛固定1 h，0.2% TritonX-100透化10 min，5%BSA封闭1 h，1%BSA稀释抗体至相应浓度，加入一抗Lamp1、Cx43、TBC1D5后在4 ℃条件下过夜，PBS洗涤后加入荧光二抗，在室温避光孵育1 h，PBS洗涤后加入DAPI进行核染色，使用激光共聚焦显微镜拍照。

1.2.7 stubRFP-sensGFP-LC3自噬双荧光病毒实验

KYSE150经不同处理后，以5×10⁴/孔的细胞密度铺于6孔板，1 d后加入10 μL/孔 stubRFP-sensGFP-LC3慢病毒，放入恒温培养箱中培养，换液后再使用嘌呤霉素筛选稳转株，观察转染效率，于100倍激光共聚焦显微镜下观察细胞内绿光和红光的变化。

1.2.8 平板克隆实验

对食管癌细胞进行消化、重悬、计数后，以1×10³/孔的密度均匀接种于6孔板中，将细胞分为Pg阴性+紫杉醇（PTX）组、Pg阳性+PTX组及Pg阳性+PTX+Cx43抑制剂组，放入恒温培养箱中培养并换液，在细胞长到肉眼可见的克隆密度时，使用4%多聚甲醛固定，用结晶紫染色，PBS清洗后进行拍照。

1.2.9 CCK-8实验

对食管癌细胞进行消化、重悬、计数后，以1×10³/孔均匀接种于96孔板，将细胞分为Pg阴性+PTX组、Pg阳性+PTX组及Pg阳性+PTX+Cx43抑制剂组，分别在0、12、24、36、48 h向加入10 μL/孔 CCK-8溶液，每组设置3个复孔，用多功能酶标仪在450 nm处检测并记录吸光度值。

1.3 统计学方法

利用GraphPad Prism（9.5.1）进行图表绘制，采用SPSS 26.0进行统计分析。计量资料采用均数±标准差表示，采用t检验比较两组差异，多组比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫共沉淀联合质谱技术鉴定RgpB互作蛋白

2.1.1 RgpB互作蛋白的筛选

免疫共沉淀技术对食管癌细胞KYSE150中RgpB的互作蛋白进行富集，结果显示，感染组与对照组存在显著差异（图1），存在结合RgpB的潜在互作蛋白。

2.1.2 RgpB互作蛋白网络的构建

免疫共沉淀联合质谱（IP-MS）结果显示，多个蛋白均与RgpB存在复杂的相互作用关系（图2）。

2.2 自噬调节因子TBC1D5与毒力因子RgpB互作使Cx43逃避溶酶体降解

2.2.1 RgpB和TBC1D5的相互作用

Co-IP技术验证了RgpB与TBC1D5的蛋白结合作用；在HEK293T细胞中转染了Flag-RgpB质粒和Myc-TBC1D5质粒；Western blotting检测结果显示，外源性RgpB能够与外源性TBC1D5结合形成复合物，发生相互作用，而这一现象在空白对照中并未观察到（图3）。

2.2.2 Pg感染对食管癌细胞膜受体分子Cx43表达的影响

Western blotting结果显示，在食管癌细胞KYSE150中，与未感染Pg组相比，Pg、RgpB、Pg+si-TBC1D5组中的Cx43表达量提高（P<0.001），蛋白相对分子质量约为43 000（图4）。

2.2.3 Lamp1、Cx43与TBC1D5之间的关系

在未感染Pg的KYSE150细胞中，结合绿色荧光的Lamp1、结合红色荧光的Cx43和结合橙色荧光的TBC1D5在溶酶体中出现共定位现象，在感染Pg的KYSE150细胞中，可观察到被红色荧光标记的Cx43在膜上表达（图5）。

2.2.4 Pg感染对自噬小体与溶酶体融合的影响

检测 stubRFP-sensGFP-LC3-KYSE150细胞株转染效率（图6A），发现未发生Pg感染的KYSE150细胞中，绿色荧光弱于红色荧光，所以Merge后黄色荧光强度减弱；在Pg感染的KYSE150细胞中，Merge后黄色荧光强度上升（图6B）。

2.3 Pg感染食管癌对化疗存在抵抗性

2.3.1 Pg感染及Cx43抑制剂对KYSE150细胞克隆形成的影响

平板克隆实验结果显示，与Pg阴性+PTX组相比，Pg阳性+PTX组细胞增殖能力明显增强，而加入Cx43抑制剂后细胞增殖能力减弱（图7）。

2.3.2 Pg感染及Cx43抑制剂对KYSE150细胞增殖抑制的影响

CCK-8检测结果显示，在3组都加入PTX时，Pg感染对KYSE150增殖具有促进作用（P<0.001）；而加入Cx43抑制剂后，Pg感染对KYSE150增殖的促进作用发生逆转（图8）。

3 讨论

在肿瘤发展过程中，多种病原微生物包括病毒、细菌等可通过其毒力因子发挥作用。但关于病原微生物导致肿瘤化疗耐药的作用机制较少被探讨。尽管病原微生物感染对肿瘤的作用机制尚未被完全揭示，但清除病原微生物在控制肿瘤的恶性进展方面可能具有积极作用^［22］。

自噬能够将细胞质成分，包括入侵的病原微生物，通过自噬体捕获并最终与溶酶体融合进行降解^［23］。研究表明，很多病原微生物的感染过程和自噬密切相关。病原微生物在长期的进化过程中形成了不同的分子策略，从而逃避或利用自噬。自噬体与溶酶体的融合是自噬过程中很关键的一步，病原微生物可干扰这一过程从而破坏完全自噬的发生。有研究证明Pg分泌的牙龈蛋白酶能够阻断自噬体与溶酶体的融合，通过毒力因子侵入心肌细胞，并对其造成严重损害^［24］。这表明，牙龈蛋白酶在Pg致病性中的作用，可通过干扰自噬融合来增强其在宿主细胞中的存活。Pg感染作为食管癌的危险因素之一，可促进食管癌的恶性进展^［25］。本研究探讨Pg毒力因子影响食管癌细胞自噬的融合机制，通过IP-MS技术发现Pg毒力因子RgpB与自噬调节因子TBC1D5之间的相互作用。有研究表明，细菌在肿瘤的发展和化疗耐药中扮演着不可忽视的角色^{［26， 27］}。Pg感染与食管癌预后恶化、化疗效果降低有关，并可能加剧食管癌细胞的侵袭性行为^［25］。本文探究了Pg感染如何参与食管癌的化疗耐药，Co-IP、Western blotting及荧光实验显示Pg进入食管癌细胞后，RgpB能够与TBC1D5互相结合，影响自噬体与溶酶体融合，Cx43表达增加。此外，平板克隆及CCK-8结果表明，在Pg感染食管癌细胞时，加入化疗药后食管癌细胞的增殖能力仍然增强，而当Cx43被抑制时，食管癌细胞对化疗的敏感性提高，表明Cx43在Pg感染的食管癌细胞中对化疗耐药发挥作用。本研究显示Pg可以通过进入食管癌细胞阻碍自噬融合从而引起Cx43的高水平表达，导致食管癌化疗耐药，说明在Pg感染期间特定的膜受体分子对化疗抵抗药物的作用显著。

综上所述，本研究对Pg在食管癌化疗耐药中的作用和相关机制做了探索，初步提出Pg的毒力因子RgpB可以通过与TBC1D5结合来影响自噬小体与溶酶体融合，Cx43逃避溶酶体降解从而导致食管癌化疗抵抗，因此Cx43可能成为Pg阳性食管癌患者一个潜在的治疗靶点。未来持续挖掘食管癌发生发展的危险因素、分子机制和新的治疗靶点，对于提高食管癌患者的整体预后水平具有重要意义，明确Cx43在食管癌转移中的作用有利于其临床推广应用。

参考文献

[1] Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin, 2018, 68(6): 394-424.

[2] Smyth EC, Lagergren J, Fitzgerald RC, et al. Oesophageal cancer[J]. Nat Rev Dis Primers, 2017, 3: 17048-57.

[3] Burki TK. Definitions of oesophageal cancer[J]. Lancet Oncol, 2017, 18(2): e71-9.

[4] Thrift AP. Global burden and epidemiology of Barrett oesophagus and oesophageal cancer[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2021, 18(6): 432-43.

[5] Shah MA, Kennedy EB, Catenacci DV, et al. Treatment of locally advanced esophageal carcinoma: ASCO guideline[J]. J Clin Oncol, 2020, 38(23): 2677-94.

[6] O’Brien-Simpson NM, Veith PD, Dashper SG, et al. Antigens of bacteria associated with periodontitis[J]. Periodontol 2000, 2004, 35: 101-34.

[7] Nakayama K, Yoshimura F, Kadowaki T, et al. Involvement of arginine-specific cysteine proteinase (arg-gingipain) in fimbriation of Porphyromonas gingivalis [J]. J Bacteriol, 1996, 178(10): 2818-24.

[8] Genco CA, van Dyke T, Amar S. Animal models for Porphyromonas gingivalis-mediated periodontal disease[J]. Trends Microbiol, 1998, 6(11): 444-9.

[9] Xu WZ, Zhou W, Wang HZ, et al. Roles of Porphyromonas gingivalis and its virulence factors in periodontitis[J]. Adv Protein Chem Struct Biol, 2020, 120: 45-84.

[10] Kadowaki T, Nakayama K, Okamoto K, et al. Porphyromonas gingivalis proteinases as virulence determinants in progression of periodontal diseases[J]. J Biochem, 2000, 128(2): 153-9.

[11] Chen WA, Dou YT, Fletcher HM, et al. Local and systemic effects of Porphyromonas gingivalis infection[J]. Microorganisms, 2023, 11(2): 470-8.

[12] Kadowaki T. Enzymatic characteristics and activities of gingipains from Porphyromonas gingivalis [J]. Methods Mol Biol, 2021, 2210: 97-112.

[13] Gao SG, Li SG, Ma ZK, et al. Presence of Porphyromonas gingivalis in esophagus and its association with the clinicopathological characteristics and survival in patients with esophageal cancer[J]. Infect Agent Cancer, 2016, 11: 3-15.

[14] Ableser MJ, Penuela S, Lee J, et al. Connexin43 reduces melanoma growth within a keratinocyte microenvironment and during tumorigenesis in vivo [J]. J Biol Chem, 2014, 289(3): 1592-603.

[15] 王丽娟, 李 静, 耿美玉. 间隙连接分子Cx43相关蛋白及其功能研究进展[J]. 现代生物医学进展, 2008, 8(10): 1967-71.

[16] Totland MZ, Bergsland CH, Fykerud TA, et al. The E3 ubiquitin ligase NEDD4 induces endocytosis and lysosomal sorting of connexin 43 to promote loss of gap junctions[J]. J Cell Sci, 2017, 130(17): 2867-82.

[17] Solan JL, Lampe PD. Specific Cx43 phosphorylation events regulate gap junction turnover in vivo [J]. FEBS Lett, 2014, 588(8): 1423-9.

[18] Bigelow K, Nguyen TA. Increase of gap junction activities in SW480 human colorectal cancer cells[J]. BMC Cancer, 2014, 14: 502.

[19] Tang B, Peng ZH, Yu PW, et al. Aberrant expression of Cx43 is associated with the peritoneal metastasis of gastric cancer and Cx43-mediated gap junction enhances gastric cancer cell diapedesis from peritoneal mesothelium[J]. PLoS One, 2013, 8(9): e74527.

[20] Garber SA, Fernstrom MJ, Stoner GD, et al. Altered gap junctional intercellular communication in neoplastic rat esophageal epithelial cells[J]. Carcinogenesis, 1997, 18(6): 1149-53.

[21] Tanaka T, Kimura M, Ishiguro H, et al. Connexin 43 expression is associated with poor survival in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J]. Mol Clin Oncol, 2016, 4(6): 989-93.

[22] Picardo SL, Coburn B, Hansen AR. The microbiome and cancer for clinicians[J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2019, 141: 1-12.

[23] Ding BB, Zhang GY, Yang XD, et al. Phosphoprotein of human parainfluenza virus type 3 blocks autophagosome-lysosome fusion to increase virus production[J]. Cell Host Microbe, 2014, 15(5): 564-77.

[24] Shiheido-Watanabe Y, Maejima Y, Nakagama S, et al. Porphyromonas gingivalis, a periodontal pathogen, impairs post-infarcted myocardium by inhibiting autophagosome-lysosome fusion[J]. Int J Oral Sci, 2023, 15(1): 42.

[25] Gao SG, Liu YW, Duan XX, et al. Porphyromonas gingivalis infection exacerbates oesophageal cancer and promotes resistance to neoadjuvant chemotherapy[J]. Br J Cancer, 2021, 125(3): 433-44.

[26] Johnston CD, Bullman S. Bacteria-derived L-lactate fuels cervical cancer chemoradiotherapy resistance[J]. Trends Cancer, 2024, 10(2): 97-9.

[27] Amanati A, Sajedianfard S, Khajeh S, et al. Bloodstream infections in adult patients with malignancy, epidemiology, microbiology, and risk factors associated with mortality and multi-drug resistance[J]. BMC Infect Dis, 2021, 21(1): 636.

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