高表达RNF7增强非小细胞肺癌细胞的PD-1耐药：基于活化NF-kB通路促进CXCL1表达和髓源性抑制细胞的募集

High RNF7 expression enhances PD-1 resistance of non-small cell lung cancer cells by promoting CXCL1 expression and myeloid-derived suppressor cell recruitment via activating NF-κB signaling

摘要

目的 探讨RNF7在非小细胞肺癌（NSCLC）中调控髓源性抑制细胞（MDSCs）的作用机制。 方法 采用TIMER2.0数据库和免疫组织化学染色分析（IHC）分析RNF7在NSCLC中表达水平。Kaplan-Meier曲线分析RNF7对肺癌患者预后的影响。通过TIMER2.0数据库和多重免疫荧光分析评估RNF7的表达与肿瘤免疫细胞浸润水平之间的相关性。通过C57BL/6小鼠建立皮下移植瘤模型，将RNF7过表达对照组（lenti-GFP，n=10）和RNF7过表达组（lenti-RNF7，n=10），RNF7敲低对照组（Ctrl，n=12）和RNF7敲低组（shRNF7，n=12）的CMT-167细胞分别种植到小鼠皮下，对于RNF7敲低对照组和RNF7敲低组的小鼠7 d后给予anti-PD-1治疗或同型IgG治疗，30 d后获取肿瘤组织，观察皮下瘤体积。通过IHC检测肿瘤组织中S100A8+A9、Gr-1的表达水平，流式细胞术检测肿瘤组织中MDSCs的浸润程度。基因集富集分析（GSEA）RNF7在非小细胞肺癌中可能的调控通路。Western blotting和荧光素酶检测RNF7对NF-κB信号通路的影响。ELISA和RT-qPCR观察趋化因子（C-X-C基序）配体1的表达情况。 结果 TCGA数据库分析显示RNF7在NSCLC中的表达水平显著上调，生存分析显示，肺癌患者中RNF7的表达水平越高，患者的预后越差（P<0.001），TIMER2.0数据库显示RNF7的表达与MDSCs的浸润程度呈正相关（P<0.001）。GESA分析提示，在NSCLC中，RNF7高表达富集于NF-κB信号通路。Western blotting实验显示，RNF7低表达能够抑制NF-κB信号通路激活。通过ELISA和RT-qPCR结果显示，敲除RNF7可显著降低CXCL1的转录和翻译（P<0.01）。小鼠皮下移植瘤实验显示，与对照组相比，过表达RNF7可增加MDSCs的浸润程度，敲除RNF7减少MDSCs的浸润程度（P<0.001）。并减轻MDSCs对效应细胞的免疫抑制功能，从而增强了抗PD-1的功效。 结论 RNF7通过激活NF-κB信号通路，促进CXCL1的表达，从而使MDSCs趋化募集，使肿瘤产生抗PD-1耐药。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of RNF7 for regulating myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods TIMER2.0 database and immunohistochemistry were used to analyze RNF7 expression level and its correlation with immune cell infiltration in non-small cell lung cancer. The impact of RNF7 expression levels on prognosis of lung cancer patients was analyzed using Kaplan-Meier survival analysis. CMT-167 cells with RNF7 overexpression or knockdown were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice, and the mice in RNF7 knockdown group were treated with anti-PD-1 or IgG isotype control 7 days after the inoculation. The tumor tissues were harvested after 30 days for tumor volume measurement, detection of S100A8+A9 and Gr-1 expressions with immunohistochemistry, and analysis of MDSC infiltration. Gene set enrichment analysis (GSEA) was performed to identify the potential pathways regulated by RNF7 in NSCLC. Western blotting and luciferase assays were used to assess the impact of RNF7 on the NF‑κB signaling pathway. ELISA and RT-qPCR were used to measure chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (CXCL1) expression. Results RNF7 expression was significantly upregulated in NSCLC, and high RNF7 expression levels were associated with poor prognosis of the patients (P<0.001). TIMER2.0 analysis revealed a positive correlation between RNF7 expression and MDSC infiltration (P<0.001). GSEA suggested that RNF7 was enriched in the NF-κB signaling pathway. In NSCLC cells, RNF7 knockdown significantly inhibited NF-κB activation and reduced CXCL1 expression. In the tumor-bearing mice, RNF7 overexpression significantly increased MDSC infiltration in the tumor tissue, and RNF7 knockdown obviously reduced MDSC infiltration and enhanced the efficacy of anti-PD-1 therapy. Conclusion High expression of RNF7 in NSCLC cells promotes CXCL1 expression by activating the NF-κB signaling pathway, thus leading to the chemotactic recruitment of MDSCs, which contributes to tumor resistance to anti-PD-1 therapy.

Graphical abstract

关键词

RNF7 / 非小细胞肺癌 / NF-κB通路 / MDSCs / 抗PD-1治疗

Key words

RNF7 / non-small cell lung cancer / nuclear factor-κB signaling pathway / myeloid-derived suppressor cells / anti-PD-1

肺癌是最常见的癌症之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占85%，在过去的几年里，中国肺癌发病率和死亡率呈上升趋势^{［1， 2］}。随着免疫治疗及靶向治疗的不断深入，改善了晚期肺癌患者的治疗前景^［3］。但由于肿瘤微环境（TME）的高度复杂性，肿瘤细胞可通过编辑免疫微环境进行免疫逃逸，肺癌的治疗过程仍具有挑战性。因此，深入探索肺癌的潜在机制和治疗靶点尤为重要。

RNF7，也称为SAG、ROC2、RBX2，是一种氧化还原诱导的抗氧化蛋白，同时是Cullin-RING型泛素连接酶的重要亚基，参与蛋白质泛素化和降解，在细胞周期和信号传导等过程起重要作用^［4］。有研究表明RNF7作为E3泛素连接酶，可以作为启动子或抑制子积极参与免疫反应和炎症信号传导，因此被认为是提高抗肿瘤免疫和阻断促肿瘤炎症的新治疗靶点^［5］。同时，研究表明RNF7在多种恶性肿瘤高表达，并且在肿瘤病理分期和分级、拷贝数变异和免疫成分等方面表现出特异性^{［6， 7］}。然而在NSCLC中，RNF7调控肿瘤免疫微环境中的具体机制仍然需要进一步研究。

肿瘤微环境中存在不同的免疫细胞调控肿瘤的进展^［8］。其中，髓源性抑制细胞（MDSCs）作为影响肿瘤微环境的重要免疫细胞之一，可促使肿瘤免疫逃逸^［9］。尽管MDSCs是一个特定的群体，但在不同物种表型存在不同，人类MDSCs可共同表达CD33⁺，CD11b⁺，HLA-DR低表达或不表达。而在小鼠中的表型被定义为CD11b⁺，Gr1^+［10］。随着对MDSCs的不断研究，人们发现有多种信号通路和细胞因子参与MDSCs的调控，其中大多数因子通过JAK-STAT和NF-κB信号通路调控骨髓细胞的分化和成熟，进而影响MDSCs的产生和活化^［11］。本研究探讨RNF7在NSCLC中表达水平以与患者预后关系。在分子机制方面，本研究旨在探讨RNF7是否能够通过激活NF-κB通路，促使趋化因子CXCL1释放，募集MDSCs抑制T细胞，从而成为NSCLC免疫治疗的一个新的靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系

人肺癌细胞株H1299，小鼠肺癌细胞CMT-167，人胚胎肾细胞HEK293T均来源于中国科学细胞库。

1.1.2 组织芯片

肺癌组织芯片来源于上海芯超公司，芯片编号为HLugA180Su12，芯片纳入了90例癌和配对的90例癌旁。患者的临床病理资料和随访数据完整。

1.1.3 实验动物

C57BL/6雄性小鼠，6~8周，SPF级，购买于南京青龙山动物繁殖场。分笼喂养，自由摄食饮水。动物实验通过皖南医学院医学伦理委员会审查批准（2023082）。

1.1.4 主要试剂

RPMI 1640培养基、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒（Beyotime），胎牛血清（Gibco），SP Rabbit&Mouse HRP Kit（DAB）（CoWin Biosciences），柠檬酸抗原修复液（Beyotim），免疫沉淀试剂盒（Protein A+G磁珠法），Percoll试剂（P1644），MG132（Sigma），RNF7抗体（1∶1000）、p-IκBα（1∶1000，CST）、IκBα（1∶1000）、p-IKKα/β（1∶1000）、IKKα （1∶1000）、IKKβ（1∶1000）、p-p65（1∶1000）、p65（1∶1000）、 anti-Ubiquitin （1∶1000）、β-actin（1∶1000）、HRP标记二抗（1∶5000，CST），CD33，mouse CXCL1 ELISA kit、human CXCL1/GRO alpha ELISA kit （R&D Systems）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染

使用含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基，37 ℃、CO₂体积分数为5%的孵育箱中培养。取适量H1299或CMT-167细胞接种在六孔板中，待细胞生长密度达60%左右，根据MOI值进行转染。感染48 h后通过荧光显微镜观察GFP表达效率，加入氨苄青霉素进行筛选。最终获得RNF7过表达组（Lenti-RNF7）、控制对照组（Lenti-GFP）；RNF7敲低组（shRNF7）、控制对照组（shCtrl）的肺癌细胞。

1.2.2 免疫组化（IHC）

肿瘤组织包埋，切片，烤片1 h，梯度乙醇水化，抗原修复，封闭，一抗包括 anti-CD8、 anti-S100A8+S100A9（abcam），anti-Gr1（Biosciences）在湿盒4 ℃孵育过夜，室温下生物素标记羊抗兔/鼠二抗工作液孵育30 min，HRP标记的链霉亲和素孵育10 min，DAB显色。根据阳性细胞的百分比分为4组：0（0%~≤25%）、1（25%~≤50%）、2（50%~≤75%）和3（>75%），0组和1组定义为低表达，2组和3组定义为高表达。

1.2.3 多重免疫荧光

肿瘤组织包埋，切片，烤片1 h，用二甲苯和梯度酒精脱蜡，抗原修复，封闭，加入一抗RNF7、CD33在湿盒4 ℃孵育过夜，室温下滴加荧光二抗孵育2 h，用DAPI 复染细胞核，加抗荧光淬灭剂封片后，用共聚焦显微镜进行拍照。沿肿瘤和基质区域（每个样本3~5个20倍视野，每个视野10~15个区域）进行分析。分别测量RNF7和CD33的平均荧光强度（MFIs），单位为Arbitrary Units。

1.2.4 蛋白印迹法检测

使用含PMSF的RIPA裂解液裂解30 min，离心后取上清，通过BCA检测试剂盒检测蛋白浓度。高温煮沸使蛋白变性。通过SDS-PAGE分离蛋白，转膜至PVDF膜上。用5% BSA封闭2 h，一抗在4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次后，加入二抗室温孵育2 h，再次TBST洗膜3次。使用ECL化学发光底物曝光显影。

1.2.5 免疫沉淀

取适量磁珠，用TBS吹打重悬，置于磁力架上分离3次，配制浓度5 μg/mL的抗体工作液，置于冰上备用。将磁珠加入抗体工作液后在室温翻转混合仪上翻转孵育1 h，配置含抑制剂的裂解液，样品充分裂解后，14 000×g在4 ℃离心5 min，取上清，将蛋白样品与结合了抗体的Protein A+G磁珠孵育过夜。变性洗脱后，进行 SDS-PAGE电泳或Western检测。

1.2.6 流式细胞术

将肿瘤组织剪碎后，置于IV型胶原酶和DNA酶消化30 min。筛网过滤，用36% Percoll重悬富集免疫细胞，红细胞裂解液（Beyotime）裂解红细胞，抗CD16/32单克隆抗体封闭30 min。流式抗体进行染色，使用以下抗体（BD Biosciences）：CD45 APC-Cyanine7，CD11b PE-Cyanine7，Gr1 FITC，避光孵育30 min。在流式细胞仪上检测。并通过FlowJo 9.0软件分析数据。

1.2.7 RT-qPCR

使用Trizol提取细胞中的总RNA，根据逆转录试剂盒逆转录成 cDNA，RT-PCR检测。GAPDH为内参。引物序列：CXCL1（Mus musculus）：F： TCCAGAGCTTGAAGGTGTTGCC，R：AACCAA GGGAGCTTCAGGGTCA。CXCL1（Homo sapiens）：F：CACTCAAGAATGGGCGGAAA，R：CCTTCTGGT CAGTTGGATTTGT。引物由Sangon Biotech（Shanghai）合成。

1.2.8 ELISA检测

根据说明书取细胞上清测CXCL1，使用酶标仪进行检测。

1.2.9 荧光素酶检测

使用NF-κB Luc萤光素酶报告基因质粒或pRL-TK报告基因质粒共转染至细胞中。48 h后收集并裂解细胞，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega）测定荧光素酶活性。

1.3 构建同系小鼠肿瘤模型

将24只C57BL/6小鼠随机分组，分为：Ctrl+IgG组，shRNF7+IgG 组，Ctrl+anti-PD-1组，shRNF7+anti-PD-1组，6只/组。在小鼠右腋皮下注射肺癌细胞悬液，接种细胞数为2×10⁶，1周后通过腹腔注射200 µg/只的抗PD-1 （Bio X cell），对照组给予200 µg/只的IgG（Bio X Cell）治疗。使用游标卡尺在第7、10、14、18、22、26、30天分别测量小鼠肿瘤的长径和短径，计算方式肿瘤体积，计算公式：体积=（长径×短径²）/2。在第30天后处死小鼠。取皮下肿瘤拍照并计算肿瘤体积。

1.4 基因集富集分析（GSEA）

从MsigDB数据库下载基因集以评估肿瘤相关通路，使用R软件中“ggplot2” 软件包进行生物学功能分析。当 False discovery rate（FDR）<0.25且P<0.05被认为RNF7在此信号通路上显著富集。

1.5 统计学方法

采用 SPSS 18.0和 GraphPad Prism 7 统计软件进行数据分析和绘图。计量数据以均数±标准差表示。两组之间比较采用独立样本t检验，多组之间比较采用单因素方差分析。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线。P<0.05显示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNF7促进肺腺癌进展

TIMER2.0数据库结果显示，与癌旁组织相比，RNF7在多数肿瘤组织中表达水平上调。在肺腺癌和肺鳞癌中，RNF7的表达水平显著高于正常组织（图1A）。KM plotters数据库的生存分析表明，与RNF7低表达的患者相比，RNF7高表达患者的总生存期显著降低（P<0.001，图1B）。免疫组化结果表明，与癌旁组织相比，肿瘤组织中RNF7高表达（图1C）。通过90例样本K-M生存分析显示，高表达RNF7的患者其总生存期较低表达RNF7的患者差（P<0.001，图1D）。

2.2 RNF7的表达与MDSCs的浸润呈正相关

TIMER2.0数据库泛癌分析（数据来自TCGA数据库）显示，肿瘤细胞RNF7的表达水平与肿瘤微环境中的MDSCs的浸润水平呈正相关（图2A），其中在肺腺癌和肺鳞癌组织中，RNF7的表达与MDSCs的浸润呈正相关（图2B）。在RNF7高表达患者中，高MDSCs浸润组的生存期显著低于低MDSCs浸润组（P<0.01，图2C）。在人肺腺癌组织中进行了多重免疫荧光染色，在高表达RNF7的肺腺癌组织中，CD33⁺细胞数量增多（图2D）。在同系肿瘤小鼠模型中，免疫组化分析表明，高表达RNF7促进了肿瘤微环境中MDSCs的浸润（图2E）。与此一致，流式细胞结果同样表明，与对照组相比，过表达RNF7促使MDSCs的迁移募集 （图2F）。

2.3 RNF7通过促进NF-κB信号通路激活诱导MDSCs的趋化募集

通过基因富集分析发现，RNF7显著富集于NF-κB信号通路（图3A）。在CMT-167细胞和H1299细胞分别转染shRNF7后，通过Western blotting检测，与对照组相比，p-IκBα蛋白水平升高，p-IκBα泛素化减少（图3B、C）。与shCtrl组相比，敲除RNF7降低了p65蛋白的表达，尤其是核p65的表达（图3D）。RT-qPCR和ELISA实验结果表明，敲除RNF7可抑制CXCL1的转录和翻译（P<0.01，图3E）。荧光素酶实验表明，在RNF7敲低的细胞中，NF-κB荧光素酶报告基因的活性减少（P<0.01，图3F）。

2.4 RNF7是NSCLC免疫治疗的潜在治疗靶点

在同系肿瘤小鼠模型中，与Ctrl+IgG组相比，shRNF7+IgG组的肿瘤的体积明显降低（P<0.01）。与Ctrl+anti-PD-1组相比，shRNF7+anti-PD-1组能够进一步抑制肿瘤的生长（P<0.01，图4A、B）。通过免疫组化分析表明，与Ctrl+IgG组相比，shRNF7+anti-PD-1组的肿瘤组织的MDSCs浸润水平显著降低，而抗肿瘤的CD8⁺T细胞浸润水平上调（P<0.01，图4C、D）。流式细胞结果也同样证明，敲除RNF7导致肿瘤组织中MDSCs浸润数量减少（P<0.001，图4E）。

3 讨论

我国肺癌一直是发病率和死亡率较高，高比例的晚期肺癌患者使得探索新的治疗策略成为迫切需求^［12］。多项研究表明RNF7在多个恶性肿瘤中异常表达，可以通过操作Cullin E3连接酶促使底物的泛素化和降解，导致一系列分子途径失调，促进肿瘤的形成^［13］。因此，确定RNF7在肿瘤中的调控机制非常必要。本研究通过使用TIMER2.0数据库和Kaplan-Meier生存分析表明RNF7在肺癌组织高表达并且与患者的不良预后有关。免疫组化结果显示，与癌旁组织相比，肺腺癌组织中RNF7的表达增加。这些数据初步提示RNF7在NSCLC的发生发展中发挥着重要作用。

MDSCs是肿瘤微环境的重要组成部分，是一种未成熟骨髓细胞的异质性群体。MDSCs可以通过免疫抑制、支持血管生成、促进肿瘤细胞的干性，促进上皮-间充质转化等多种机制促进肿瘤的发生发展，在肿瘤微环境中显示强大的免疫抑制和促肿瘤功能^［14-16］。既往研究表明，MDSCs在血液和脾脏中显著积聚，并浸润肺部肿瘤组织，参与肺癌的发生发展^［17］。RNF7与免疫应答也密切相关，有报道表明，RNF7可通过细胞因子调节巨噬细胞、中性粒细胞^［18］。在本研究中，我们发现在NSCLC中，RNF7的表达与MDSCs的浸润程度呈正比，RNF7 高表达可能促进免疫抑制微环境的形成。目前RNF7调控非小细胞肺癌免疫细胞的相关机制尚未有研究报道。在构建的同系小鼠肿瘤模型中，通过对肿瘤组织进行免疫组化及流式分析证明了过表达RNF7可促进NSCLC中MDSCs招募。因此，深入探索RNF7对MDSCs的调控机制研究尤为重要。

研究表明，肿瘤细胞可通过产生各类趋化因子与MDSCs细胞表面受体相互作用以触发单核细胞和粒细胞MDSCs募集至肿瘤部位^{［19， 25］}。而在Kras驱动的小鼠肺癌模型中，RNF7的敲低能够抑制NF-κB和mTOR信号通路相关蛋白的活性^［20］。本文GESA富集分析提示在非小细胞肺癌中，RNF7高表达富集于NF-κB信号通路。其中NF-κB信号通路的激活在趋化因子CXCL1的表达和分泌中起到决定性作用^{［21， 22］}。因此，我们推测RNF7可能通过促进NF-κB信号通路的激活，进而诱导CXCL1的表达，从而促进MDSCs的趋化募集。在NF-κB信号通路中IκBɑ作为抑制蛋白，与细胞质中p65结合，阻止p65的核易位和DNA结合^［23］。RNF7敲除后，p-IκBα缺乏降解，p65蛋白水平下降，NF-κB通路受抑制。荧光素酶实验表明NF-κB转录活性在RNF7敲低后显著下降。这些数据表明RNF7可调控NF-κB信号通路的激活。同时敲低RNF7后可使CXCL1转录水平及翻译水平降低。

上述数据初步表明，RNF7通过促进NF-κB信号通路的激活诱导MDSCs的趋化作用。有研究报道示，MDSCs除了促进肺癌的生长和进展，也会降低抗肿瘤免疫治疗的疗效^［24］。在使用针对MDSCs的药物或生物抑制剂时，这些抑制剂可能干扰MDSCs形成、成熟、扩增或迁移，从而减轻肿瘤免疫抑制^{［26， 27］}。因此在肿瘤治疗中，靶向MDSCs是一种有前途的和耐受性良好的治疗方法。体内实验结果显示，敲除RNF7可显著抑制肿瘤的生长，减少MDSCs的浸润，而敲除RNF7联合抗PD-1联合治疗显示出更好的抗肿瘤效果。明确在肿瘤微环境发挥作用的关键分子可有助于解决NSCLC免疫治疗的局限性。本研究着重观察RNF7对非小细胞肺癌中MDSCs的调控作用，并进一步阐释了其可能的调控机制，提示了RNF7用于NSCLC免疫治疗的前景。

综上所述，本研究表明，RNF7在NSCLC中高表达且与患者的不良预后相关。机制分析表明RNF7通过调节NF-κB通路促使趋化因子CXCL1释放，从而募集MDSCs抑制T细胞。靶向RNF7对肺癌有良好的抗肿瘤疗效。这些结果，为NSCLC的免疫治疗提供了一个新的方向。

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