甲基巴多索龙通过抑制NLRP3炎症小体活化缓解小鼠急性肝损伤

Bardoxolone methyl alleviates acute liver injury in mice by inhibiting NLRP3 inflammasome activation

摘要

目的 探究小分子化合物甲基巴多索隆（CDDO-Me）抑制NLRP3炎症小体活化并缓解急性肝损伤的作用机制。 方法 体外实验：CDDO-Me预处理小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）或人急性单核细胞白血病（THP-1）细胞后，利用多种NLRP3炎症小体活化剂（Nigericin、ATP、MSU、胞内LPS转染）活化NLRP3炎症小体，使用聚脱氧腺苷酸（poly A∶T）活化AIM2炎症小体，通过Western blotting和ELISA检测细胞培养上清中caspase-1和白细胞介素1β（IL-1β）的分泌水平，确定CDDO-Me对NLRP3炎症小体的抑制效果及其特异性。体内实验：将SPF级雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组，即空白对照组（Control组）、急性肝损伤组（APAP组）、CDDO-Me低剂量治疗组（APAP+CDDO-Me20 mg/kg组）和CDDO-Me高剂量治疗组（APAP+CDDO-Me40 m/kg组），ELISA检测小鼠血清中IL-1β、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）的表达水平，HE染色观察肝组织结构变化。 结果 CDDO-Me可剂量依赖性的抑制多种激动剂诱导的NLRP3炎症小体活化以及胞内转染LPS诱导非经典NLRP3炎症小体的活化（P<0.05），但对NLRP3炎症小体非依赖的相关炎性因子白细胞介素6（IL-6）、TNF-α的分泌无显著影响（P>0.05）。此外，CDDO-Me对AIM2炎症小体的活化无显著影响（P>0.05）。动物实验结果表明，相较急性肝损伤组（APAP组），CDDO-Me治疗组（APAP+CDDO-Me20 mg/kg组和APAP+CDDO-Me40 mg/kg组）小鼠血清IL-1β、AST和ALT的表达水平显著降低，肝组织HE染色结果显示CDDO-Me能明显改善ALI小鼠损伤的肝组织结构，减少炎性细胞浸润，且呈剂量依赖性（P<0.05）。 结论 CDDO-Me能够特异性抑制NLRP3炎症小体活化并缓解APAP诱导的小鼠急性肝损伤。

Abstract

Objective To investigate the inhibitory effect of bardoxolone methyl (CDDO-Me) on activation of NLRP3 inflammasome and its mechanism for alleviating acute liver injury (ALI). Methods Mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM) and THP-1 cells were pre-treated with CDDO-Me followed by treatment with Nigericin, ATP, MSU, intracellular LPS transfection for activation of NLRP3 inflammasomes, or poly A:T for activation of AIM2 inflammasomes. The levels of caspase-1 and IL-1β in the cell culture supernatant was determined with Western blotting and ELISA to assess the inhibitory effect of CDDO-Me on NLRP3 inflammasomes and its specificity. In the animalexperiment, male C57BL/6J mouse models of acetaminophen-induced ALI were treated with low-dose (20 mg/kg) and high-dose (40 mg/kg) CDDO-Me, and the changes in serum levels of IL-1β, TNF-α, AST and ALT were measured by ELISA and liver tissue pathology was observed using HE staining. Results In mouse BMDM and THP-1 cells, CDDO-Me dose-dependently inhibited the activation of NLRP3 inflammasomes without significantly affecting the secretion of non-inflammasome-related inflammatory factors IL-6 and TNF-α or AIM2 inflammasome activation. In the mouse models of ALI, CDDO-Me treatment at both the low and high doses significantly reduced serum levels of IL-1β, AST and ALT, ameliorated histological changes and reduced inflammatory cell infiltration in the liver tissue, and the effects exhibited a distinct dose dependence. Conclusion CDDO-Me can specifically inhibit the activation of NLRP3 inflammasomes to alleviate acetaminophen-induced ALI in mice.

Graphical abstract

关键词

甲基巴多索龙 / NLRP3炎症小体 / 炎症小体相关疾病 / 急性肝损伤

Key words

bardoxolone methyl / NLRP3 inflammasomes / inflammasome-related diseases / acute liver injury

急性肝损伤（ALI）是全球重要的公共卫生问题，可迅速发展为急性肝衰竭，严重危及患者生命安全^［1］，ALI的发病机制是由肝内大量细胞死亡引起的级联免疫反应^［2］。研究表明^［3］，核苷酸结合寡聚化结构域受体蛋白3（NLRP3）炎症小体的异常激活在ALI中起着重要作用，其由三个部分组成，即传感器蛋白NLRP3、接头蛋白凋亡相关斑点样蛋白（ASC）以及效应蛋白pro-caspase-1，主要通过活化丝氨酸蛋白酶（caspase-1）促进IL-1β、IL-18的成熟与分泌从而介导炎症反应，IL-1β是一种关键的促炎因子，在ALI期会大量增加，导致白细胞（尤其是嗜中性粒细胞）活化和募集进入肝脏而诱发肝实质细胞受损^{［4， 5］}。目前NLRP3炎症小体相关疾病的治疗方法主要是抑制其活化产物IL-1β从而减轻炎症反应，但存在非特异性、易影响其他细胞功能等局限性^［6］。靶向抑制NLRP3炎症小体是治疗炎性疾病的新思路，目前已经有多种小分子化合物在相关疾病动物模型中展现出良好的预防或治疗效果^{［7， 8］}，因此寻找一种高效且特异的NLRP3炎症小体活化抑制剂对治疗NLRP3炎症小体相关炎性疾病尤为重要。

甲基巴多索隆（CDDO-Me）是一种合成的三萜类化合物，具有抗感染和抗癌等作用^［9］，临床上用于治疗实体瘤、2型糖尿病和慢性肾脏疾病^［10-12］。研究表明，CDDO-Me可以通过抗氧化、抑制炎性反应以及调节细胞增殖和死亡发挥作用，这些作用主要依赖于不同细胞信号通路的调节如核因子（NF-κB）^［13］，信号转导和转录激活因子3（STAT3）路径^［14］，以及它作为核因子红细胞系2相关因子2（Nrf2）^［15］的激活剂能力。然而其抗感染功能与NLRP3炎症小体的作用机制尚不明确，更重要的是，目前尚无评价其对急性肝损伤治疗效果的报道。本研究拟通过在细胞水平和动物水平探究CDDO-Me对 NLRP3炎症小体活化的作用，以期为临床治疗NLRP3炎症小体相关疾病提供新思路与策略。

1 材料和方法

1.1 实验动物及细胞

6~10周龄，体质量18~24 g的SPF级C57BL/6J小鼠，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK（苏）2018-0008，小鼠饲养于SPF环境。人急性单核细胞白血病THP-1细胞系，受赠于蚌埠医科大学钱中清教授课题组。本研究所有动物实验操作及规程均经蚌埠医科大学伦理认证，并按照中国动物保护利用委员会发布的指导方针进行，本研究经蚌埠医科大学伦理委员会审核批准（伦动科批字［2023］第403号）。

1.2 药品与试剂

CDDO-Me（上海陶素生化）；对乙酰氨基酚（APAP；Aladdion ）；巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）（Novoprotein）；尼日利亚菌素（Nigericin，MCE；三 磷酸腺苷（ATP）、尿酸单钠晶 体（MSU）、佛波酯（PMA）、脂多糖（LPS）、聚脱氧腺苷酸（poly A∶T，Sigma；三酰脂肽Pam3CSK4、Lipofectamine2000（Invitrogen）；RPMI 1640培养基、高糖DMEM培养基、OPTI-MEM 培养基、胎牛血清（Gibco）；谷丙转氨酶（ALT/GPT）试剂盒，谷草转氨酶（AST/GPT）试剂盒，ELISA试剂盒（Mouse IL-1β、IL-6、TNF‑α，Human IL-1β、TNF‑α ELISA kit）（R&D）；人caspase-1（p20）、pro-caspase-1抗体（Human caspase-1）（Cell Signaling Technology）；鼠caspase-1（p20）、pro-caspase-1抗体（Mouse caspase-1）（AdipoGen）；β-actin抗体（Abmart）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG（Jackson IR）。

1.3 动物分组及处理

选取8~10周龄体质量相近的SPF级雄性C57BL/6J小鼠，随机分成空白对照组（Control组）、急性肝损伤组（APAP组）、CDDO-Me低剂量治疗组（APAP+CDDO-Me20 mg/kg组）和CDDO-Me高剂量治疗组（APAP+CDDO-Me40 m/kg组），6只/组，提前禁食16 h，空白对照组不给予APAP造模，CDDO-Me低剂量治疗组和CDDO-Me高剂量治疗组小鼠分别灌胃CDDO-Me溶液20 mg/kg和CDDO-Me溶液40 mg/kg，2 h后，APAP组和治疗组小鼠同时腹腔注射等剂量的APAP（400 mg/kg）溶液，空白对照组腹腔注射等体积的PBS溶液。6 h后，眼球摘除术取血，后颈椎脱臼法处死小鼠，解剖并剥离肝脏后于10%中性甲醛中固定，用于组织病理学检查，组织固定后、脱水，常规石蜡包埋切片。

1.4 细胞刺激分化

鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）诱导分化：选取7~8周龄雄性小鼠，颈椎脱臼处死后，剥离出小鼠的胫骨和股骨，无菌条件下用20 mL注射器吸取20 mL DMEM细胞培养基冲洗小鼠骨髓细胞，离心，加入2~3 mL红细胞裂解液吹打，用含有 M-CSF 的DMEM完全培养基重悬细胞，5% CO₂、37 ℃条件下分化4~6 d可获得贴壁生长的BMDM细胞。分化后的细胞呈细长梭形，通过流式细胞术鉴定巨噬细胞表面标志物（F4/80+CD11b+细胞亚群）。人THP-1细胞诱导分化：1×10⁶/mL THP-1细胞中加入含有400 ng/mL PMA的RPMI 1640完全培养基刺激过夜，细胞贴壁分化成梭形并用流式细胞术鉴定。

1.5 炎症小体活化刺激

分化完成的小鼠BMDM和人THP-1细胞按每孔 5×10⁵个细胞分别接种于12孔板中培养过夜，加入LPS（100 ng/mL）预刺激4 h后，分别加入多种经典的NLRP3 炎症小体活化剂，其中Nigericin（3 μmol/L）、ATP（2.5 mmol/L）活化细胞30 min，MSU（150 μg/mL）活化细胞3 h。加入Pam3CSK4（200 ng/mL）预刺激4 h后，胞内转染LPS活化非经典NLRP3炎症小体。加入 LPS（100 ng/mL）预刺激4 h后，转染poly A∶T（1 μg/mL）刺激4 h，活化黑色素瘤缺乏因子2（AIM2）炎症小体。

1.6 Western blotting

收集细胞培养上清，利用甲醇氯仿法提取上清中的蛋白，加入裂解液；12孔板中直接加入裂解液裂解细胞，转至1.5 mL EP管中，与上清蛋白裂解液一同金属浴100 ℃煮10 min。将收集的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，恒压90V转膜1 h，5% BSA室温封闭2 h，加入一抗抗体（1∶1000），4 ℃摇床上孵育过夜，PBST洗膜3次，10 min/次，随后加入二抗抗体（1∶10 000）室温孵育1 h 30 min，PBST洗膜3次后凝胶成像仪显影，并使用Image J软件对蛋白条带进行定量分析。

1.7 ELISA检测

收集细胞培养上清及小鼠血清，按照ELISA试剂盒说明书检测IL-1β、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）的分泌水平，主要步骤包括稀释捕获抗体包被至96孔酶标板，室温静置过夜，10% FBS封闭30 min，加入标准品和样本2 h，加入检测抗体1 h，加入HRP孵育20 min，加入底物TMB显色5~ 10 min，1 mol/L H₂SO₄终止反应，酶标仪测定吸光度值A_{450 nm}，绘制标准曲线计算样品浓度。

1.8 免疫组化染色

石蜡切片脱蜡至水：将切片依次放入二甲苯Ⅰ 15 min，然后放入二甲苯Ⅱ 15 min，继续放入无水乙醇Ⅰ 5 min后放置无水乙醇Ⅱ 5 min，最后放置95%酒精5 min及75%酒精5 min，结束后使用双蒸水清洗干净。染色：切片放入苏木素染液染3~10 min，水洗玻片上多余染液，1%盐酸酒精分化片刻，自来水漂洗，1%氨水水溶液返蓝1 min，自来水漂洗，切片放入伊红染液中染色1~3 min，自来水漂洗。脱水封片：石蜡切片依次放入无水乙醇Ⅰ 5 min，无水乙醇Ⅱ 5 min，二甲苯Ⅰ 5 min，二甲苯Ⅱ 5 min中脱水透明，稍晾干后中性树胶封片。结果判读：切片于荧光显微镜下观察并采集图像，细胞核为蓝色，细胞质为红色。

1.9 统计学分析

采用GraphPad Prism9.5软件进行数据的统计学分析，符合正态分布的数据采用均数±标准差描述，两组之间的比较采用独立样本t检验，多组比较采用方差分析，P<0.05表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDDO-Me抑制 Nigericin 诱导的经典NLRP3炎症小体活化

Western blotting检测结果显示，CDDO-Me剂量依赖性地抑制了p20的分泌（P<0.05，图1A、B），对pro-caspase-1（Pro-casp1）的表达无显著抑制（P>0.05，图1A、C）。ELISA检测结果显示，CDDO-Me剂量依赖性地抑制了细胞培养上清液中IL-1β的分泌水平（P<0.001，图1D），对核转录因子κB（NF-κB）信号通路活化产生的非炎症体依赖性细胞因子TNF-α、IL-6的分泌无明显影响（P>0.05，图1E、F）。

2.2 CDDO-Me抑制其他活化剂诱导的NLRP3炎症小体活化

Western blotting检测结果显示，CDDO-Me剂量依赖性地抑制了ATP和MSU活化NLRP3炎症小体诱导的p20的表达（P<0.05，图2A、B），但对pro-caspase-1的蛋白表达无显著影响（P>0.05，图2A、B）。ELISA检测结果显示，CDDO-Me剂量依赖性地抑制了ATP和MSU诱导的细胞培养上清液中IL-1β的分泌水平（P<0.001，图2C）。

2.3 CDDO-Me抑制非经典NLRP3炎症小体活化

Western blotting检测结果显示，CDDO-Me剂量依赖性地抑制了非经典NLRP3炎症小体活化产物p20的产生（P<0.05，图3A、B），但对pro-caspase-1的表达无显著影响（P>0.05，图3A、C）。ELISA检测结果显示，CDDO-Me剂量依赖性地抑制了胞内转染LPS诱导的细胞培养上清液中IL-1β的水平（P<0.001，图3D）。

2.4 CDDO-Me对AIM2炎症小体活化无影响

Western blotting检测结果显示，与CDDO-Me抑制nigericin活化NLRP3炎症小体相比，加入CDDO-Me并不抑制poly A∶T活化AIM2炎症小体介导的 p20的蛋白表达（P>0.05，图4A、B），同时CDDO-Me对pro-caspase-1的表达无显著影响（P>0.05，图4A、C）。ELISA检测结果显示，与CDDO-Me抑制nigericin诱导的IL-1β分泌相比，CDDO-Me对poly A∶T诱导的IL-1β分泌无显著抑制作用（P>0.05，图4D）。

2.5 CDDO-Me抑制人THP-1细胞中NLRP3炎症小体活化

Western blotting检测结果显示，nigericin 诱导了人THP-1细胞中NLRP3炎症小体活化，促进p20的表达，加入CDDO-Me可剂量依赖性地抑制细胞培养上清中p20的表达（P<0.05，图5A、B），但对细胞裂解液中pro-caspase-1的表达无显著影响（P>0.05，图5A、C）。ELISA检测结果显示，CDDO-Me剂量依赖性地抑制细胞培养上清中IL-1β的分泌（P<0.001，图5D），但对非炎症小体相关细胞因子TNF-α的分泌无显著抑制作用（P>0.05，图5E）。

2.6 CDDO-Me 明显改善AILI小鼠急性肝损伤

ELISA检测结果显示，与空白对照组（Control）相比，APAP作用24 h后，血清IL-1β、AST 和 ALT的的表达水平明显升高（P<0.001，图6A、C、D），AILI小鼠模型与人类AILI疾病具有相当高的一致性，表现为炎症小体活化，促炎因子表达升高，线粒体损伤和核DNA断裂造成的肝小叶坏死，这一结果提示，我们成功建立了AILI小鼠模型，但对非炎症小体相关细胞因子TNF-α的分泌无显著抑制作用（P>0.05，图6B），与APAP（24 h）模型组相比，CDDO-Me作用后显著抑制了APAP引起的IL-1β、ALT和AST表达水平的上调，且具有浓度依赖性（P<0.01，图6A、C、D）。HE染色结果显示，APAP（24 h）模型组肝组织结构遭到严重破坏，肝小叶不清晰，伴随大面积的炎性细胞浸润，肝细胞坏死充血（图6E），通过Image J软件统计分析得APAP（24 h）模型组坏死面积为（69.74±11.86）%，与Control组相比差异有统计学意义（P<0.001，图6F），而与APAP（24 h）模型组相比，CDDO-Me给药组的肝组织结构未遭受明显破坏，无大面积炎性细胞浸润，CDDO-Me（20、40 mg/kg）组坏死面积分别为（49.69±9.31）%和（20.88±4.03）%，差异有统计学意义（P<0.01，图6F）。

3 讨论

NLRP3炎症小体是一种细胞内监控的多分子平台^［16］，能够感知广泛的病原体衍生物、环境因素及内源性应激诱导因子，其异常激活与人类多种重大疾病的发生发展密切相关^{［17， 18］}。因此阻断NLRP3炎症小体活化成为治疗NLRP3炎症小体相关疾病的新策略，已有研究表明CDDO-Me具有抗感染作用^［19］，可抑制一些细菌和病毒病原体的细胞内复制，其抗感染与NLRP3炎症小体间的作用机制尚不清楚，本研究通过细胞实验和体内动物实验探究小分子化合物CDDO-Me对NLRP3炎症小体活化的影响。

多种病原相关分子信号^［20］、危险相关分子信号^［21］及环境因素^［22］能够触发NLRP3炎症小体的激活，剪切caspase-1，促进IL-1β分泌，本研究首先利用经典激活剂Nigericin活化炎症小体，初步证实了CDDO-Me能够抑制NLRP3炎症小体活化，相较于其他小分子化合物如WP1130^［23］和P22077^［24］，CDDO-Me具有抑制作用的浓度更低，效果更好的优势。MSU是最有效的促炎刺激之一，ATP通过激活免疫细胞中的嘌呤能P2X受体7（P2X7）均可被免疫系统识别为危险信号^{［25， 26］}，触发NLRP3炎症小体的激活，本研究发现CDDO-Me还可以抑制激动剂MSU、ATP诱导的经典炎症小体活化，进一步证实CDDO-Me可广谱的抑制NLRP3炎症小体活化，与Zhang等^［27］研究中发现CDDO-Me抑制TXNIP-NLRP3通路来减轻阿霉素诱导的心脏毒性相似。此外，NLRP3炎症小体活化还存在一种利用caspase-11识别细胞内LPS的非经典激活途径^［28］，本研究表明CDDO-Me也可以抑制NLRP3炎症小体非经典途径的活化。目前研究较多的其他经典炎症小体还包括AIM2炎症小体，其激活可清除病原体，保护机体免受感染。本研究表明CDDO-Me对AIM2炎症小体的激活并无影响，仅对抑制NLRP3炎症小体活化具有抑制性。同时进一步探究发现CDDO-Me不仅作用于小鼠细胞，还能在人THP-1细胞中对NLRP3炎症小体活化产生显著的抑制效果，为后续临床研究提供了实验依据。

NLRP3炎症小体的异常活化会导致大量炎性因子释放，从而引起多种急性炎症反应及慢性炎症疾病^［29］。NLRP3炎性小体是肝脏中研究较多的炎性小体^［30］，并已明确在ALI小鼠模型中发挥重要作用^［31］。高剂量的APAP是导致ALI发生的主要原因之一^［32］，以血清氨基转移酶升高为主要的病理学特征^［33］，在患者的肝组织中可见肝小叶中心坏死，伴随大面积的炎性细胞浸润，而周边区少见^［34］。本研究通过腹腔注射APAP构建小鼠急性肝损伤模型，结果表明CDDO-Me可显著抑制小鼠血清中ALT和AST的表达水平，且具有剂量依赖性，提示其对肝脏的保护作用。HE染色证实CDDO-Me能减少肝组织受损面积及程度，减轻炎性反应。以上结果提示CDDO-Me可在体内抑制NLRP3炎症小体活化，缓解APAP引起的肝组织破坏，但CDDO-Me抑制NLRP3炎症小体的具体作用机制还需后续研究去阐明。

综上所述，本研究证实CDDO-Me抑制多种激动剂诱导的NLRP3炎症小体活化，对NLRP3炎症小体的活化的抑制作用具有特异性，且在鼠和人细胞中均具有良好的抑制效果。通过阻断小鼠体内NLRP3炎症小体激活，缓解了APAP诱导的ALI肝组织破坏及炎性反应，本研究的发现为后续深入研究CDDO-Me抑制NLRP3炎症小体活化可能的作用机制提供了实验依据，另一方面丰富了在治疗APAP诱导ALI中的方案和分子机制，为设计与发现治疗ALI及其他NLRP3炎症小体相关疾病提供了新的方向和策略。

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基金资助

安徽省重点科研平台开放课题基金项目(KLICD-2022-D1)

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