慢性间歇低氧和复氧对大鼠胰岛素抵抗及骨骼肌miR-27a-3p/PPARγ/IRS1/PI3K/AKT表达的影响

Effects of chronic intermittent hypoxia and reoxygenation on insulin resistance and skeletal muscle miR-27a-3p/PPARγ/IRS1/PI3K/AKT expressions in rats

摘要

目的 探讨慢性间歇低氧（CIH）和复氧对大鼠胰岛素抵抗（IR）及骨骼肌miR-27a-3p/PPARγ/IRS1/PI3K/AKT表达的影响。 方法 从基因表达数据库（GEO）中下载CIH条件下miRNA数据集，运用DESeq2筛选差异表达最显著的miRNA作为研究对象，使用miRNA walk网站对差异miRNA的靶基因进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，并Cytoscape软件构建miRNA-mRNA-pathway调控网络。将48只雄性SD大鼠随机分为对照（CON）组和CIH组，24只/组，CON组常氧环境饲养12周，CIH组先予CIH环境饲养8周，再恢复常氧饲养4周。两组均在基线、8周、12周时留取血样和骨骼肌组织，检测空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）水平，HE染色观察骨骼肌病理改变并计算肌纤维横截面积，实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和Western blotting法检测骨骼肌miR-27a-3p、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）、胰岛素受体1（IRS1）、p-IRS1、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、磷酸激酶B（AKT）、p-AKT表达，比较组间差异。 结果 生信分析发现，GEO数据库未筛选出CIH状态下肌肉组织相关的miRNA数据集，仅得到肾脏组织差异表达miRNA的GSE202480数据集，从CON组和CIH组样本中筛选出165个差异表达的miRNA，选最显著miR-27a-3p作为研究对象。GO和KEGG分析显示，差异miRNA的靶基因主要参与肌肉调节和胰岛素信号传导。miRNA-mRNA-pathway调控网络显示miR-27a-3p是PPAR信号通路和PI3K/AKT信号通路的关键调控因子。动物实验发现，基线时，两组各项观察指标均无统计学意义（P>0.05）；8周时，与CON组相比， CIH组FBG、FINS、HOMA-IR、PPARγ显著升高 （P<0.05或P<0.01），肌纤维排列疏松，肌纤维横截面积、miR-27a-3p、p-IRS1/IRS1、PI3K、p-AKT/AKT显著降低 （P<0.05或P<0.01），GLUT4表达呈升高趋势但无统计学意义（P>0.05）；12周时，两组各项观察指标均无统计学意义（P>0.05）。 结论 CIH可导致大鼠IR增加和骨骼肌病理改变，而复氧可以逆转；CIH可致骨骼肌miR-27a-3p表达下调，PPARγ表达上调，IRS1/PI3K/AKT胰岛素信号转导受到抑制，而复氧干预可以逆转；miR-27a-3p可能 通过调控PPARγ/IRS1/PI3K/AKT信号通路参与了CIH所致的IR。

Abstract

Objective To investigate the effects of chronic intermittent hypoxia (CIH) and reoxygenation on insulin resistance (IR) and expressions of miR-27a-3p/PPARγ/IRS1/PI3K/AKT in rat skeletal muscle. Methods GEO database was used for screening the differentially expressed miRNAs in CIH, and their target genes were subjected to GO and KEGG enrichment analysis followed by construction of the miRNA-mRNA-pathway regulatory network using Cytoscape. In the animal experiment, 48 male SD rats were randomly divided into normoxia group and CIH group (8 weeks of CIH followed by 4 weeks of normoxic recovery). Blood and skeletal muscle samples were collected at baseline, 8 weeks, and 12 weeks to evaluate the changes in fasting blood glucose (FBG) and fasting insulin (FINS) levels and muscular pathology. RT-qPCR and Western blotting were used to detect the changes in the expressions of miR-27a-3p, PPARγ, GLUT4, IRS1, p-IRS1, PI3K, p-AKT and AKT in the muscular tissues. Results No muscular miRNA datasets for CIH were available in GEO database, from which only a kidney-related dataset (GSE202480) was obtained, based on which a total of 165 differentially expressed miRNAs were identified. GO/KEGG analysis suggested that these miRNAs were involved in muscular regulation and insulin signaling. The miRNA-mRNA-pathway network highlighted miR-27a-3p as a crucial regulator in the PPAR and PI3K/AKT pathway. In the animal experiment, the rats subjected to CIH for 8 weeks showed significantly increased FBG, FINS, HOMA-IR, and PPARγ levels, loose muscle fiber arrangement, decreased cross-sectional area of the muscle fibers, and lowered expressions of miR-27a-3p, p-IRS1/IRS1, PI3K, and p-AKT/AKT in the skeletal muscles. Conclusion CIH increases IR, causes skeletal muscle pathology, downregulates miR-27a-3p expression, upregulates PPARγ expression, and inhibits IRS1/PI3K/AKT insulin signaling in the skeletal muscles of rats, and these changes can be reversed by reoxygenation. MiR-27a-3p may participate in CIH-induced IR by modulating the PPAR γ/IRS1/PI3K/AKT signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

慢性间歇低氧-复氧 / 胰岛素抵抗 / GEO / miR-27a-3p / IRS1/PI3K/AKT通路

Key words

chronic intermittent hypoxia-reoxygenation / Insulin resistance / GEO database / miR-27a-3p / IRS1/PI3K/AKT pathway

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）是一种以慢性间歇性低氧（CIH）为核心病理生理机制的睡眠障碍性疾病，其在人群中的患病率为9%~38%^［1-3］，被认为是一个全球性的健康和社会问题。研究表明，OSAS是高血压^［4］、血脂异常^［5］、脑卒中^［6］和胰岛素抵抗（IR）^{［7， 8］}的独立危险因素。然而，OSAS合并IR发病机制复杂，相关机制仍未完全阐明。

OSAS患者间歇性低氧（IH）引起的氧化应激和炎症可能是IR发生的关键因素^［9］。Murphy^［10］研究表明，炎症反应通过抑制胰岛素受体1/磷酸激酶B（IRS1/AKT）胰岛素信号通路参与了CIH诱导的IR。OSAS相关肺动脉高压大鼠模型中，肺动脉平滑肌细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）表达减少，增加了活性氧（ROS）的产生和促炎细胞因子的表达^［11］。研究也发现，小鼠肌肉中PPARγ的表达降低可以出现IR^［12］。然而，这些研究主要集中在脂肪组织和血管组织。骨骼肌是发生IR最早和最重要的部位，但在CIH动物模型中尚未报道。

微小RNA （miRNAs）存在于真核生物细胞中，它们可在基因转录后水平调节基因表达和翻译，参与各种生命过程，如细胞增殖和分化、肿瘤及肌肉疾病^［13］。多种miRNAs可调控骨骼肌葡萄糖摄取、胰岛素信号通路及线粒体生物合成，从而参与骨骼肌IR的调控，miR-29家族^［14］、miR-106b、miR-27a和miR-30d^［15］在骨骼肌细胞葡萄糖转运及其胰岛素信号传导中具有重要作用。研究也发现，多种miRNA可以影响CIH过程^［16］。例如，miR-26b-5p的上调和miR-207的下调通过增加海马中Bcl-2相关X蛋白（Bax）和裂解的胱天蛋白酶-3（CASP3）的表达以及减少B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）的表达而参与IH诱导的认知障碍^［17］。miR-155通过抑制靶叉头盒蛋白O3（FOXO3a）基因来促进氧化并增强IH介导的NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体途径^［18］。在精准医学时代，miRNA被认为是理想的生物标志物，测序分析表明，OSAS患者中miR-199-3p、107和485-5p的表达下调，而miR-574-5p表达上调，这表明差异表达的miRNA与OSAS密切相关^［19］。但目前CIH诱导IR的过程中，骨骼肌中miR-27a-3p的表达情况仍未确定。

基于此，本研究采用生信分析和动物实验相结合的方法，旨在通过观察CIH暴露（模拟人类重度OSAS）是否会影响大鼠IR、骨骼肌横截面积、miR-27a-3p及PPARγ/IRS1/PI3K/AKT的表达，并观察复氧（模拟临床无创正压通气治疗）后上述分子的变化，探讨CIH诱发IR的可能机制，为临床OSAS患者继发IR的诊疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

48只雄性SD大鼠，5周龄，体质量150~180 g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（京）2019-0010。实验前大鼠适应性饲养1周，饲养条件：温度22~23 ℃、湿度42%~45%和12 h∶12 h光/暗循环。动物实验内容已获包头医学院动物研究伦理委员会的批准（伦理审批号：［2023］74号）。

1.1.2 主要试剂及仪器

血糖氧化酶法试剂盒（深圳雷杜生命科学股份有限公司），大鼠胰岛素ELISA试剂盒（杭州联科生物技术有限公司）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、AKT抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司），GLUT4抗体、IRS1抗体、PI3K抗体（武汉三鹰公司）；PPARγ抗体（北京博奥森有限公司）；p-IRS1（ABCLONAL）；p-AKT抗体（Affinity）；正置白光拍照显微镜（Nikon）；实时定量分析仪（Bio-rad）。

1.2 方法

1.2.1 miR-27a-3p的筛选及生物信息学分析

从GEO数据库中下载CIH的miRNA数据集，安装R语言和DESeq2包，使用DESeq2包进行miRNA表达差异计算，根据设定的标准（P<0.05，logFC>1或logFC<-1）筛选得到miRNA，选择差异表达最为显著的miR-27a-3p作为研究对象，用plotMA函数生成火山图，用pheatmap包生成聚类热图；利用数据库TargetScan、miRTarbase和miRDB分别预测差异miRNAs的靶基因，取3个数据库的交集，用ClusterProfiler软件对最终的靶基因进行GO、KEGG富集分析，获取生物过程（BP）、细胞组成（CC）、分子功能（MF）数据及关键信号通路。将miR-27a-3p的靶基因与IR相关的KEGG信号通路取交集，绘制韦恩图并使用Cytoscape软件构建miRNA-mRNA-pathway调控网络。

1.2.2 动物分组及造模

将48只5周龄的雄性SD大鼠随机分为CON组和CIH组，24只/组。①基线阶段：两组大鼠各随机选取8只处死并取样，即CON-0组和CIH-0组，剩余大鼠进入慢性间歇性低氧阶段。②慢性间歇性低氧阶段：CON组置于常氧中，CIH组置于全自动间歇低氧舱中，通入25 s氮气，将舱内的氧气浓度保持在6%~8%，维持10 s，加入氧气55 s，氧气浓度增加到20%~21%，维持30 s，每天9∶00~17∶00循环120 s，实验期间大鼠无法获得食物和水，铺干燥垫料吸收舱内水分，共持续8周。8周时每组随机选取8只并取样，即CON-8组和CIH-8组。在间歇低氧舱内部氧浓度达到7%及恢复至20%时，经腹主动脉采血进行血气分析，动脉血氧饱和度分别为72%、96%，提示间歇低氧造模成功。③复氧阶段：CON组继续常氧饲养，CIH组剩余大鼠进行复氧干预处理，12周时取样，即CON-12组和CIH-12组。

1.2.3 取材

空腹12 h后，麻醉大鼠，取两组大鼠内眦静脉血，离心分离获得血清样本，留取骨骼肌组织备用。

1.2.4 血清指标水平检测

按ELISA试剂盒说明书操作，分别检测血清中空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）水平。计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=FBG×FINS/22.5。

1.2.5 骨骼肌组织HE染色和肌纤维横截面积比较

大鼠骨骼肌组织4%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋，切片HE染色。封膜后于光学显微镜下采集图像，使用Image-Pro Plus 6.0软件，统一以mm作为标准单位，测量每张400倍图片中的肌纤维总面积和总数，计算单个肌纤维的面积（mm²）=肌纤维总面积（mm²）/肌纤维总数（个）。

1.2.6 RT-qPCR检测骨骼肌组织miR-27a-3p和PPARγ mRNA表达

大鼠取材后，组织匀浆并按制造商指南提取总RNA，利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，条件如下：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性15 s，60 ℃退火、延伸60 s，40个循环。GAPDH和U6分别用作mRNA和miRNA的内部参考。使用溶解曲线测定PCR结果的可靠性，并用2^-ΔΔCt方法进行分析。引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成（表1）。

1.2.7 Western blotting

骨骼肌组织在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中裂解，通过BCA蛋白定量检测试剂盒检测总蛋白浓度，取等量蛋白经5%SDS-PAGE电泳分离蛋白，并将其转移至PVDF膜上，与一抗PPARγ（1∶1000）、GLUT4（1∶1000）、p-IRS1（1∶500）、IRS1 （1∶500）、PI3K（1∶1000）、p-AKT（1∶1000）、AKT（1∶1000）和GAPDH（1∶1000）在4 ℃下孵育过夜。用TBST缓冲液洗涤3次后，加入二抗（1∶3000）孵育，用ECL进行化学发光成像，运用ImageJ软件对灰度值进行量化。

1.3 统计学分析

应用 SPSS 26.0和GraphPad Prism 8软件进行统计学分析并制图，计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较使用独立样本t检验，非正态分布数据比较采用非参数秩和检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-27a-3p的筛选及生物信息学分析

从GEO数据库中未筛选出CIH条件下肌肉相关的miRNAs表达谱数据集，仅得到CIH模型小鼠肾脏miRNAs数据集“GSE202480”，该数据库包含CIH组样本3例，CON组样本3例，对miRNA表达水平进行分析，与CON组相比，CIH组肾脏中差异miRNA有165个，其中有59个上调，有106个下调，综合GSE202480表达谱中各miRNAs的表达结果、P值及logFC值（图1A、B），发现miR-27a-3p的组间差异性最显著，考虑CIH致IR的发生可能与miR-27a-3p表达下调有关。这些差异miRNA的靶基因GO分析显示，主要包括细胞分解代谢的正向调控、轴突生成、mRNA分解代谢正向调控等生物过程；参与肌动蛋白细胞骨架、突触后膜、应力纤维、可收缩肌动蛋白丝束等细胞组成；显示转录辅助因子活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、蛋白激酶活性等分子功能（图1C）。KEGG结果显示，预测的miRNA靶基因其可能参与的前20条信号通路，其中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、PI3K/AKT信号通路、胰岛素信号通路、Wnt信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路差异较显著（图1D）。miR-27a-3p的靶基因与IR相关的KEGG通路交叉分析得到23个共同的靶基因（图1E）。建立的miRNA-mRNA-pathway调控网络结果提示，miR-27a-3p调控的关键信号通路有PPAR信号通路、PI3K/AKT信号通路等（图1F）。

2.2 CIH和复氧对大鼠FBG、FINS、HOMA-IR的影响

0周时，两组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR差异无统计学意义（P>0.05），8周时，与CON组相比，CIH组FBG、HOMA-IR、FINS均明显升高（P<0.01，P<0.05），12周时，两组大鼠以上指标差异无统计学意义（P>0.05，表2）。

2.3 CIH和复氧对大鼠骨骼肌组织病理学及肌纤维横截面积的影响

0周时，两组大鼠骨骼肌横切面肌细胞排列紧密，其核呈蓝色位于细胞的边缘，肌束界限整齐清晰，未见明显异常。8周时，CIH组肌细胞排列相对疏松，间隙增大，肌细胞呈萎缩样改变，肌间未见明显的脂肪浸润；CON组肌细胞排列相对紧密，未见明显异常。12周时，CIH组大鼠骨骼肌细胞萎缩等病理改变有所减轻。定量分析比较发现，0周和12周时，两组大鼠肌细胞面积差异无统计学意义（P>0.05）。8周时，CIH组较CON组大鼠肌细胞面积显著减小（P<0.05，图2）。

2.4 CIH和复氧对大鼠骨骼肌中miR-27a-3p、PPARγmRNA表达水平的影响

0周时，大鼠骨骼肌中miR-27a-3p、PPARγmRNA表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；8周时，miR-27a-3p在CIH组较CON组明显降低（P<0.05），而PPARγmRNA明显升高（P<0.05）；12周时，组间差异均无统计学意义（P>0.05，图3）。使用microRNA靶基因预测网站TargetScan进行了生物信息学分析，发现PPARγ、IRS1与miR-27a-3p存在靶向关系（图4）。

2.5 CIH和复氧对大鼠骨骼肌中PPARγ、p-IRS1/IRS1、PI3K、p-AKT/AKT、GLUT4蛋白表达的影响

0周时，两组大鼠骨骼肌中PPARγ、p-IRS1/IRS1、PI3K、p-AKT/AKT、GLUT4表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；8周时，p-IRS1/IRS1、PI3K、p-AKT/AKT表达在CIH组较CON组明显降低（P<0.05，P<0.01），而PPARγ明显升高（P<0.05），GLUT4在CON组和CIH组表达水平差异无统计学意义（P>0.05），但呈升高趋势；12周时，与CON组比，CIH组PPARγ、p-IRS1/IRS1、PI3K、p-AKT/AKT、GLUT4表达水平差异均无统计学意义（P>0.05，图5）。

3 讨论

OSAS与糖脂代谢紊乱密切相关，其中可能的机制与间歇低氧、交感神经功能障碍、炎性反应、表观遗传调控等相关，这些机制在非酒精性脂肪肝、T2DM、心血管疾病中也发挥了重要作用^［20］。T2DM的发病率与OSAS的严重程度有关^［21］，这表明OSAS可能是T2DM发展的有力因素。近几十年来，已经对OSAS患者的外周IR和动物模型进行了深入的研究。当外周组织出现IR时，胰岛素分泌会代偿性增加以维持血糖的正常水平^［22］。骨骼肌发生IR可使游离脂肪酸和血糖水平升高，可引起骨骼肌葡萄糖摄取和胰岛素信号通路受损^［23］。研究发现，在诊断T2DM之前，骨骼肌IR是可以被检测到的^［24］，早期发现可能会阻止T2DM的进展。然而，骨骼肌中CIH诱导的IR具体机制尚未阐明。阅读大量文献发现，miRNA在各种组织和细胞中会表达失调，提示miRNA在许多疾病中具有调节作用^{［25， 26］}。Han ^［27］发现，糖尿病肾病患者的尿液外泌体miR-145-5p和miR-27a-3p显著增加，并与T2DM患者肾损伤的进展和糖脂代谢失调有关。另一项研究发现，miR-27a-3p在糖尿病前期患者中显著下调，其表达与糖尿病前期患者的FBG水平呈负相关^［28］。miR-27a-3p也被证实是骨骼肌代谢的调节因子^［29］。本研究通过建立CIH的动物模型来模拟人类重度OSAS，观察到大鼠经CIH干预8周后，FBG、FINS、HOMA-IR均高于CON组，提示CIH参与大鼠IR的发生；首次发现骨骼肌中miR-27a-3p表达下调，PPARγ表达上调，肌细胞排列疏松且面积减小，IRS1/PI3K/AKT胰岛素信号转导受到抑制，而复氧（模拟无创正压通气治疗状态）4周后CIH组大鼠IR有所改善，肌细胞结构与CON组无明显差异，推测CIH致IR发生的机制可能与激活miR-27a-3p/PPARγ/IRS1/PI3K/AKT信号分子的表达水平有关。

到目前为止，许多miRNA已被确定通过调节β细胞分化、葡萄糖代谢和胰岛素合成参与T2DM的发病机制^［30］，miRNA也可以用作T2DM的诊断标志物。研究证明，miR-145、miR-7-5p和miR-33a-5p的表达水平在糖尿病和糖尿病前期中失调，miR-145-5p、miR-33a-5p可以显著区分糖尿病患者与健康受试者，这表明miRNA在检测2型糖尿病中具有潜在的诊断用途^{［31， 32］}。鉴于此，本研究生物信息学分析表明，miR-27a-3p在CIH模型小鼠肾脏组织中表达下调，推测其可能在肌肉组织中也有表达。我们通过动物实验验证，发现CIH组大鼠骨骼肌组织中miR-27a-3p表达量较CON组显著降低，这有利于区分CIH组和CON组，表明miR-27a-3p可能是疾病早期诊断的生物标志物。

本研究生信分析显示，与miR-27a-3p相关的信号通路有PPAR信号通路和PI3K/AKT信号通路。PPARγ作为配体诱导的转录因子，主要在脂肪组织表达，肌肉组织也有表达。PPARγ可加快脂肪组织中脂质分解和脂肪酸清除，减少游离脂肪酸在肌肉中的蓄积，增加对葡萄糖的利用，以减轻和改善IR。在IRS1/PI3K/AKT信号通路中，骨骼肌细胞上的胰岛素受体（INSR）与胰岛素结合会通过IRS1磷酸化使PI3K被激活，进而使激活的PI3K和AKT结合，磷酸化且激活AKT^［33］，是骨骼肌发生IR的经典途径。然而，PPARγ和IRS1/PI3K/AKT信号通路对CIH诱导的骨骼肌IR的调控机制未被阐述。本研究动物实验首次发现，CIH暴露大鼠骨骼肌中PPARγ表达上调，IRS1/PI3K/AKT通路蛋白表达下调，而复氧后上述信号分子表达水平与对照组差异无统计学意义，提示CIH诱导IR的机制可能与PPARγ和IRS1/PI3K/AKT信号通路共同调控有关。本研究发现大鼠骨骼肌中GLUT4经CIH暴露后有表达上调趋势，这与另一项研究结果相悖^［34］，可能由于CIH动物模型建立条件不一致导致的。

研究表明，快慢肌差异分泌的外泌体携带的miR-27a-3p可以靶向PPARγ抑制FAPs成脂分化，减少甘油诱导的肌间脂肪浸润^［35］。同样，有研究表明miR-27a-3p通过靶向INSR影响了PI3K/AKT胰岛素信号通路传导，进而调控糖脂代谢关键基因丝氨酸/苏氨酸激酶（GSK-3β）和激素敏感性脂肪酶（HSL），参与奶牛肝细胞糖脂代谢过程^［36］。本研究通过靶基因预测网站发现miR-27a-3p与PPARγ和IRS1存在靶向关系。因此，进一步推测CIH诱导IR机制可能与骨骼肌内miR-27a-3p靶向调控PPARγ和IRS1/PI3K/AKT表达异常有关。

研究报道，CIH组和高脂饮食组较对照组腓肠肌略不规则，肌纤维排列空隙稍增加，肌纤维数目和骨骼肌横截面积无明显变化^［37］。另一项研究发现CIH模型大鼠骨骼肌的结构变化，与对照组相比，CIH组大鼠骨骼肌细胞形态模糊，肌束明显细弱，肌束之间空隙较大，部分可见横向断裂，细胞形态呈现异常，细胞核变形^［38］。而在我们的实验中观察到，CIH暴露下大鼠骨骼肌肌细胞间隙增大，数量减少，肌间未见明显的脂肪浸润，提示CIH对骨骼肌肌纤维有一定的损伤。

总之，CIH可导致大鼠外周IR，大鼠IR与骨骼肌内miR-27a-3p、IRS1、PI3K等胰岛素信号分子表达降低有关，复氧干预后，大鼠FBG、FINS、骨骼肌损伤、miR-27a-3p、IRS1等都改善，这些发现揭示了一种新的CIH诱导IR机制，即miR-27a-3p可能通过调控PPARγ/IRS1/PI3K/AKT信号通路参与了CIH所致的IR，同时提示miR-27a-3p可能是早期疾病诊断的生物标志物和新的治疗靶点。但本研究也存在一定的局限性，仅通过生信分析和动物实验初步探讨CIH致IR的作用机制，也没有解决哪些上游信号会影响miR-27a-3p表达，缺乏相关细胞实验的定位和靶向证据，后期还需要进一步通过细胞实验来阐明miR-27a-3p在CIH致IR中的调控机制。

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