CREM在胃癌中高表达并与患者的不良预后相关

High expression of CREM is associated with poor prognosis in gastric cancer patients

摘要

目的 分析CREM在胃癌中的表达及其与临床预后的相关性。 方法 利用TCGA和GEO数据库分析胃癌和癌旁组织CREM mRNA表达差异，免疫组化染色（IHC）分析43例胃癌和配对癌旁组织的CREM蛋白表达差异，分析CREM表达与胃癌患者临床病理特征之间的关系；采用Kaplan-Meier生存分析探讨CREM表达水平与胃癌患者生存期之间的关系；利用LinkedOmics数据库注释CREM相关基因的GO功能和KEGG通路的富集情况。 结果 数据库分析显示，CREM在胃癌组织中高表达（P<0.05），与胃癌患者的不良预后正相关（P=0.01）。IHC结果显示，与癌旁组织相比，胃癌组织中CREM高表达（P<0.0001），CREM表达水平与T分期和N分期有关（P<0.05），CREM高表达的胃癌患者总生存期更短（RR=4.02，P=0.0046）。基因富集分析显示，CREM可能通过细胞黏附分子介导的信号通路促进胃癌发生发展。 结论 CREM在胃癌中高表达提示不良预后，CREM可作为候选的胃癌预后指标。

Abstract

Objective To analyze the expression of CREM in gastric cancer (GC) and its correlation with prognosis of the patients. Methods TCGA and GEO databases were used to analyze the expression levels of CREM mRNA in GC and adjacent tissues. Immunohistochemistry was used to examine the expression of CREM protein in 43 pairs of GC and adjacent tissues, and the correlation of CREM expression with clinicopathological features of the patients was analyzed. Kaplan-Meier survival analysis was used to explore the relationship between CREM expression and survival of GC patients. LinkedOmics database was used to annotate the GO function and KEGG pathway enrichment of CREM-related genes. Results Database analysis showed that CREM was highly expressed in GC tissues (P<0.05) and positively correlated with poor prognosis in GC patients (P=0.01). Immunohistochemistry results showed significantly higher CREM expression in GC tissues than in paired adjacent tissues (P<0.0001), and its expression level was correlated with T-stage and N-stage of the tumor (P<0.05). The overall survival of GC patients with high expression of CREM was shorter (RR=4.02, P=0.0046). Gene enrichment analysis showed that high CREM expression promotes occurrence and progression of GC very likely through the cell adhesion signaling pathway. Conclusion CREM is highly expressed in GC, and its high expression is associated with a poor prognosis of GC patients, suggesting the potential of CREM to serve as a prognostic indicator for GC.

Graphical abstract

关键词

胃癌 / CREM / 免疫组化 / 生物信息学 / 预后

Key words

gastric cancer / CREM / bioinformatics / immunohistochemistry / prognosis

2020年，我国胃癌发病率和死亡率在全球范围内分别占44.0%和48.6%^［1-4］。胃癌作为第5大常见癌症和第4大癌症死因^［5］，大多数患者在确诊时已是中晚期，手术治疗后复发率高且预后不佳^［6］。由于胃癌的组织学和病因学异质性^［7］，靶向治疗和免疫治疗逐渐应用于临床。转录因子在肿瘤发展过程中的细胞信号传导和基因调控中起关键作用^［8］。前期通过对胃癌样本单细胞测序发现，CREM可能是重要的胃癌进展相关分子，CREM、CREB和ATF1构成了亮氨酸拉链（bZIP）转录因子超家族中的CREB家族。CREB家族对细胞的存活、凋亡和增殖起重要作用，可作为转录激活因子或阻遏因子^{［9， 10］}。CREM的表达与组织的生理或病理状态密切相关，如在睾丸中高表达对精子的发育至关重要^{［11， 12］}；神经系统损伤后CREM表达增加与神经损伤修复有关^［13］；黑色素瘤细胞中CREM低表达可减弱肿瘤细胞增殖能力^［14］；食管鳞癌中CREM低表达反而增强肿瘤细胞侵袭转移能力，提示不良预后^［15］。上述研究表明，CREM在不同疾病中的表达水平存在明显差异，仅有少数研究报道了肿瘤中CREM的表达及作用。

目前CREM在胃癌中的表达、预后及作用机制尚无明确定论，仅有一项研究利用GENT2数据库分析认为胃肿瘤组织与癌旁组织的CREM表达水平不存在显著差异^［16］，该研究所用数据库数量较少且缺乏实验验证。因此，本研究综合多个公共数据库进行生物信息学分析，并通过免疫组化染色验证探讨CREM在胃癌中的表达水平及其与预后的相关性，同时采用KEGG和GO富集分析预测CREM在胃癌中参与的信号通路和生物学功能，为进一步研究CREM在胃癌发生发展的分子机制提供理论依据。

1 资料和方法

1.1 生物信息学分析

从UCSC（https：//xenabrowser.net/）数据库下载经统一标准化的TCGA_GTEx数据集，其中包括TCGA样本和正常组织样本的基因表达矩阵。同时从癌症基因图谱（TCGA）数据库（https：//tcga-data.nci.nih.gov/）获取胃癌和癌旁组织的RNA-seq表达谱数据和相关临床信息，包括年龄、性别、生存状态、肿瘤等级和肿瘤分期。从GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载GSE54129、GSE63089和GSE65801的基因芯片数据集，分析胃癌和癌旁组织中CREM mRNA表达差异。

利用Kaplan-Meier Plotter数据库（http：//kmplot.com/analysis/）分析CREM基因表达与胃癌患者预后的相关性。利用SangerBox数据库（http：//sangerbox.com/）分析胃癌中CREM基因表达水平与免疫浸润评分的皮尔逊相关系数^［17］。利用LinkedOmics数据库（https：//www.linkedomics.org/）分析TCGA胃癌数据集中与CREM基因表达呈正相关或负相关的基因，筛选|r|≥0.3的基因进行KEGG通路富集及GO富集分析。

1.2 患者及组织标本收集

收集2016年1~11月在广东省人民医院接受治疗的43例胃癌患者的临床病理数据。纳入标准：确诊为原发性胃癌；手术前未接受其他治疗。排除标准：无法进行随访的患者；合并其他系统肿瘤的患者。收集的组织标本在经过石蜡包埋固定后，进行病理切片染色，由两名资深病理学家独立完成组织学分类和转移的判定。患者预后情况通过定期电话或门诊随访进行评估，总生存时间（OS）定义为第一次临床评估至死亡、最终随访或最后一次联系之间的时间间隔。本研究已得到广东省人民医院伦理委员会的批准（伦理编号：KY2023-204-01）。

1.3 免疫组织化学染色

胃癌和癌旁组织蜡块制成4 μm切片，75 ℃烘干1 h。切片依次在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中处理10 min，随后经梯度乙醇溶液（依次为100%、95%、80%、70%）分别处理2 min、PBS洗3次，使用柠檬酸钠抗原修复液高压修复8 min后，3%过氧化氢孵育10 min除去内源性过氧化物酶，10%山羊血清封闭1 h，4 ℃孵育CREM抗体（1∶3000；Proteintech）过夜。第2天进行酶标二抗（山羊抗兔IgG聚合物；中杉金桥）孵育1 h，DAB显色3 min。随后使用苏木素复染细胞核，盐酸乙醇分化、脱水处理、中性树脂封片和采集图片。

1.4 结果判定

染色结果由2名病理学专家独立评估，通过分析阳性染色细胞的比例和染色的强度来确定蛋白表达水平。阳性细胞百分比评分为0~4分（0分为0%~5%，1分为5%~24%，2分为25%~49%，3分为50%~74%，4分为75%~100%）。染色强度评分为0~3分（0分为阴性染色，1分为弱染色，2分为中度染色，3分为强染色）。免疫组织化学总评分=染色强度评分×阳性细胞百分比评分，<6分为低表达，≥6分为高表达。

1.5 统计学分析

通过SPSS 26.0软件进行统计学处理，使用Graph-Pad Prism 8.0软件进行图形绘制。在正态分布的情况下，计量资料以均数±标准差表示。组间比较采用独立样本t检验，配对样本则采用配对t检验，多组间的比较使用单因素方差分析。计数资料以百分比表示，组间比较行χ²检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CREM在多种恶性肿瘤中的表达

TCGA_GTEx数据库分析显示，CREM在下列11种肿瘤中上调（图1A）：多形成性胶质细胞瘤（P<0.001）、胶质瘤（P<0.001）、脑低级别胶质瘤（P<0.001）、胃和食管癌（P=0.01）、胃癌（P<0.001）、头颈鳞状细胞癌（P<0.001）、肝细胞肝癌（LIHC，P<0.001）、皮肤黑色素瘤（P<0.001）、胰腺癌（P<0.001）、急性髓细胞样白血病（P<0.001）。TCGA数据库同样发现CREM在胃癌和头颈鳞状细胞癌中高表达（P<0.01，图1B）。

2.2 CREM与肿瘤免疫浸润的关系

利用SangerBox数据库对TCGA胃癌数据集进行Estimate免疫浸润评分的相关性分析，结果显示，CREM的表达水平与胃癌的基质评分及免疫基质联合评分均呈正相关（r>0.3，P<0.0001，图2）。

2.3 CREM在胃癌组织中高表达

TCGA胃癌数据库分析显示，CREM在胃癌组织中的表达高于癌旁组织（P<0.05，图3A）。在肿瘤T分期中，T₃-T₄期的肿瘤中CREM表达高于T₁-T₂期（P<0.05，图3B）。GEO胃癌数据集GSE65801、GSE63089和GSE54129分析同样显示CREM在胃癌组织中高表达（P<0.05，图3C~E）。

免疫组织化学染色结果显示，CREM主要在胃癌组织的细胞核中表达（图3F），且胃癌组织中CREM的染色强度和阳性细胞数量高于癌旁组织（P<0.0001，图3G）。

2.4 CREM与胃癌患者临床病理特征的关系

CREM表达与T分期（P=0.001）、N分期（P=0.036）显著相关，CREM高表达组T₃-T₄期及N₁-N₃期的胃癌患者比例高于低表达组（表1）。

2.5 CREM高表达与胃癌患者不良预后相关

Kaplan-Meier Plotter数据库分析显示，CREM高表达与胃癌患者的不良预后呈正相关（图4A~C）。CREM高表达组的患者具有较差的FP（HR=1.71，95% CI：1.29-2.27，P=0.00 016）、OS（HR=1.74，95% CI：1.33-2.27，P<0.001）和PPS（HR=1.85，95% CI：1.39-2.46，P<0.001）。生存分析结果显示，CREM高表达的胃癌患者术后OS低于CREM低表达患者（RR=4.027，P=0.0046，图4D）。

2.6 CREM在胃癌中的GO及KEGG富集分析结果

LinkedOmics数据库筛选出TCGA胃癌数据集中与CREM基因表达呈正相关和负相关的基因，其中CREM与GNG11、RHOQ、EMCN、NR4A3等基因呈正相关（P<0.05，图5A），与CDC42BPG、PKP3、PLCB3、LETM1等基因呈负相关（P<0.05，图5B）。GO分析和KEGG富集分析显示，CREM主要参与调控细胞黏附等生物学过程，并与细胞连接、细胞外基质等成分有关（图5C），可能调控PI3K-Akt、细胞黏附分子和细胞外基质受体相互作用等介导的信号通路（图5D）。

3 讨论

癌症因其复杂的分子特征、肿瘤微环境、免疫豁免和转移能力，成为主要健康挑战之一^［18］，胃癌的分子分型为个性化的靶向治疗和免疫治疗提供了可能性。HER2阳性的胃癌患者可以接受靶向疗法^{［19， 20］}，但我国HER2阳性率仅为12%左右，且治疗后易出现获得性肿瘤耐药^［21］。PD-1/PD-L1抑制剂主要针对晚期、复发性或转移性胃癌患者，在胃癌中的获益人群有限。其他生物标志物如EGFR、VEGFR、CLDN18.2、Trop2等^［22-25］仍处于临床试验阶段。因此，探寻新的治疗靶点以扩大获益人群成为临床迫切需要。课题组前期通过单细胞RNA测序发现，CREM可能在胃癌进展中发挥重要作用。本研究通过TCGA、GEO公共数据库、胃癌患者临床样本和GO、KEGG富集分析，发现CREM高表达与胃癌患者不良预后相关，可能通过调控细胞黏附分子介导的信号通路影响胃癌细胞的增殖和转移。

既往研究表明，CREM低表达与食管鳞癌不良预后显著相关，并与食管癌细胞的迁移侵袭以及对顺铂的敏感性相关^［15］。CREM在黑色素瘤细胞中高表达并通过调控细胞周期增强肿瘤细胞的增殖能力^［14］。此外，CREM是肝脏再生的关键调节因子^［26］。CREM可与c-fos的CRE位点结合，并与CREB异源二聚化，从而阻断cAMP诱导的生殖细胞凋亡^［27］。在前列腺癌中，CREM被认为是凋亡和癌变的调节因子^［28］。CREM存在多个启动子和替代剪接形式，可编码多种蛋白质异构体，进而增强或抑制靶基因的转录。然而，CREM在胃癌中的表达、预后及分子机制尚不清楚。

本研究通过公共数据库分析和免疫组化染色检测发现，胃癌组织中CREM的mRNA和蛋白表达均明显高于癌旁组织，进一步分析显示，T₃-T₄期的肿瘤CREM表达高于T₁-T₂期。这提示CREM可能作为癌基因促进胃癌的发生发展。本研究生存分析显示，CREM高表达的胃癌患者临床预后明显较差，生存时间更短，表明CREM可能是胃癌治疗中的一个潜在生物标志物，检测CREM的表达水平有助于评估胃癌患者的疾病进展阶段和预后情况。

为进一步探究CREM在胃癌细胞中的作用机制，本研究通过KEGG和GO富集分析发现CREM基因主要参与细胞黏附等生物学过程，并与细胞连接和细胞外基质相关，表明CREM可能通过调控细胞黏附分子介导的信号通路影响胃癌细胞的增殖和转移。细胞黏附分子在细胞间和细胞外基质间的黏附中起重要作用^［29］。有研究表明，CREM表达下调可降低E-cadherin（上皮细胞中负责细胞间相互作用的跨膜黏附分子）的表达导致上皮间质转化，进而促进食管鳞癌细胞转移和侵袭^［15］。另有研究发现，特异性过表达CREM的小鼠心房样本中，细胞-基质黏附和细胞外基质结构成分显著上调，而与心房功能相关的基因显著下调^［30］。以上结果均提示，CREM可能通过激活细胞黏附分子介导的信号通路来促进胃癌细胞的增殖和迁移。

有研究认为CREM mRNA在胃肿瘤组织和癌旁组织中不存在显著差异^［16］，与本研究结果不同。由于该研究仅分析了1个数据集，为进一步明确结论，本研究在TCGA_GTEx、TCGA数据库以及GEO数据库集中分析CREM mRNA表达差异，同时收集了43例胃癌和配对癌旁组织样本检测CREM蛋白表达水平。综合生信分析和免疫组化结果，最终明确CREM在胃癌组织的表达显著高于癌旁组织，本研究还通过生存分析发现CREM高表达与胃癌患者不良预后显著相关。

本研究仍存在一定的局限性：需进一步在细胞和动物实验中探讨CREM促进胃癌进展的分子机制；研究样本量相对较小，未来应开展前瞻性大样本对照研究加以证实。综上所述，本研究表明CREM在胃癌中的高表达与肿瘤的发生发展密切相关，对胃癌患者的预后评估具有一定临床应用价值，可能成为潜在的胃癌诊断和分子治疗靶点。

参考文献

[1] Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin, 2021, 71(3): 209-49.

[2] Qiu HB, Cao SM, Xu RH. Cancer incidence, mortality, and burden in China: a time-trend analysis and comparison with the United States and United Kingdom based on the global epidemiological data released in 2020[J]. Cancer Commun, 2021, 41(10): 1037-48.

[3] 赫 捷, 陈万青, 李兆申, 等. 中国胃癌筛查与早诊早治指南(2022，北京)[J]. 中华肿瘤杂志, 2022, 44(7): 634-66.

[4] Cao W, Chen HD, Yu YW, et al. Changing profiles of cancer burden worldwide and in China: a secondary analysis of the global cancer statistics 2020[J]. Chin Med J, 2021, 134(7): 783-91.

[5] Thrift AP, Wenker TN, El-Serag HB. Global burden of gastric cancer: epidemiological trends, risk factors, screening and prevention[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2023, 20(5): 338-49.

[6] Shitara K, Chin K, Yoshikawa T, et al. Phase II study of adjuvant chemotherapy of S-1 plus oxaliplatin for patients with stage III gastric cancer after D2 gastrectomy[J]. Gastric Cancer, 2017, 20(1): 175-81.

[7] Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma[J]. Nature, 2014, 513(7517): 202-9.

[8] Canale M, Casadei-Gardini A, Ulivi P, et al. Epigenetic mechanisms in gastric cancer: potential new therapeutic opportunities[J]. Int J Mol Sci, 2020, 21(15): 5500-9.

[9] Persengiev SP, Green MR. The role of ATF/CREB family members in cell growth, survival and apoptosis[J]. Apoptosis, 2003, 8(3): 225-8.

[10] Brindle PK, Montminy MR. The CREB family of transcription activators[J]. Curr Opin Genet Dev, 1992, 2(2): 199-204.

[11] Sassone-Corsi P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM[J]. Int J Biochem Cell Biol, 1998, 30(1): 27-38.

[12] Sánchez-Jasso DE, López-Guzmán SF, Bermúdez-Cruz RM, et al. Novel aspects of cAMP-response element modulator (CREM) role in spermatogenesis and male fertility[J]. Int J Mol Sci, 2023, 24(16): 12558-67.

[13] Wu XM, Jin W, Liu XJ, et al. Cyclic AMP response element modulator-1 (CREM-1) involves in neuronal apoptosis after traumatic brain injury[J]. J Mol Neurosci, 2012, 47(2): 357-67.

[14] Kaprio H, Siddiqui A, Saustila L, et al. The oncogenic properties of the EWSR1: CREM fusion gene are associated with polyamine metabolism[J]. Sci Rep, 2023, 13(1): 4884-93.

[15] Wang YC, Zhou SH, Yang XJ, et al. Low expression of cyclic AMP response element modulator-1 can increase the migration and invasion of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Tumour Biol, 2013, 34(6): 3649-57.

[16] Kaprio H, Heuser VD, Orte K, et al. Expression of transcription factor CREM in human tissues[J]. J Histochem Cytochem, 2021, 69(8): 495-509.

[17] Shen WT, Song ZG, Zhong X, et al. Sangerbox: a comprehensive, interaction-friendly clinical bioinformatics analysis platform[J]. Imeta, 2022, 1(3): e36.

[18] Hanahan D. Hallmarks of cancer: new dimensions[J]. Cancer Discov, 2022, 12(1): 31-46.

[19] Alsina M, Arrazubi V, Diez M, et al. Current developments in gastric cancer: from molecular profiling to treatment strategy[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2023, 20(3): 155-70.

[20] Sun JM, Shen L, Shah MA, et al. Pembrolizumab plus chemotherapy versus chemotherapy alone for first-line treatment of advanced oesophageal cancer (KEYNOTE-590): a randomised, placebo-controlled, phase 3 study[J]. Lancet, 2021, 398(10302): 759-71.

[21] Augustin JE, Soussan P, Bass AJ. Targeting the complexity of ERBB2 biology in gastroesophageal carcinoma[J]. Ann Oncol, 2022, 33(11): 1134-48.

[22] Kawazoe A, Fukuoka S, Nakamura Y, et al. Lenvatinib plus pembrolizumab in patients with advanced gastric cancer in the first-line or second-line setting (EPOC1706): an open-label, single-arm, phase 2 trial[J]. Lancet Oncol, 2020, 21(8): 1057-65.

[23] Wainberg ZA, Enzinger PC, Kang YK, et al. Bemarituzumab in patients with FGFR2b-selected gastric or gastro-oesophageal junction adenocarcinoma (FIGHT): a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 study[J]. Lancet Oncol, 2022, 23(11): 1430-40.

[24] Qi CS, Gong JF, Li J, et al. Claudin18.2-specific CAR T cells in gastrointestinal cancers: phase 1 trial interim results[J]. Nat Med, 2022, 28(6): 1189-98.

[25] Bardia A, Messersmith WA, Kio EA, et al. Sacituzumab govitecan, a Trop-2-directed antibody-drug conjugate, for patients with epithelial cancer: final safety and efficacy results from the phase I/II IMMU-132-01 basket trial[J]. Ann Oncol, 2021, 32(6): 746-56.

[26] Servillo G, Della Fazia MA, Sassone-Corsi P. Coupling cAMP signaling to transcription in the liver: pivotal role of CREB and CREM[J]. Exp Cell Res, 2002, 275(2): 143-54.

[27] Behr R, Weinbauer GF. cAMP response element modulator (CREM): an essential factor for spermatogenesis in Primates?[J]. Int J Androl, 2001, 24(3): 126-35.

[28] Feng F, Wu JT, Gao ZL, et al. Screening the key microRNAs and transcription factors in prostate cancer based on microRNA functional synergistic relationships[J]. Medicine, 2017, 96(1): e5679.

[29] Janiszewska M, Primi MC, Izard T. Cell adhesion in cancer: beyond the migration of single cells[J]. J Biol Chem, 2020, 295(8): 2495-505.

[30] Chen JZ, Qin HY, Hao JZ, et al. Cardiac-specific overexpression of CREM-IbΔC-X via CRISPR/Cas9 in mice presents a new model of atrial cardiomyopathy with spontaneous atrial fibrillation[J]. Transl Res, 2024, 267: 54-66.

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