ABI2在胃癌进展和预后中的作用及其调控机制

Role of Abelson interactor 2 in progression and prognosis of gastric cancer and its regulatory mechanisms

摘要

目的 探讨Abelson相互作用因子2（ABI2）在胃癌进展和预后中的作用及机制。 方法 通过TIMER2.0和GEPIA数据库分析ABI2在泛癌和胃癌中的表达，采用Kaplan-Meier Plotter数据库分析ABI2表达水平与胃癌预后的关系，通过DAVID数据库预测ABI2在生物系统中的功能。纳入在我院于2016年1月~2018年10月接受胃癌根治术治疗的120例胃癌患者，检测胃癌及癌旁组织中ABI2的表达水平，分析其与疾病进展的联系，并通过Cox单因素和多因素分析影响患者预后的危险因素。构建胃癌细胞系（MGC-803）ABI2干扰及过表达模型并构建裸鼠移植瘤模型，联合CCK-8、划痕、Transwell和免疫印迹实验分析ABI2对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结合体内外研究分析ABI2影响胃癌细胞恶性生物学行为的可能分子机理。 结果 生信分析和本院胃癌组织检测结果表明ABI2在胃癌组织中高表达（P<0.05）。Kaplan-Meier Plotter数据库分析表明ABI2低表达患者的术后生存率优于高表达患者（P<0.0001）。本院患者的生存分析结果显示，胃癌组织中ABI2高表达患者术后5年生存率降低（P<0.0001），Cox单因素和多因素生存分析进一步表明，ABI2高表达是影响胃癌患者预后的独立危险因素（P=0.022，HR=1.887，95% CI：1.096~3.249）。富集分析提示，ABI2的作用可能与Wnt信号通路相关。上调ABI2促进裸鼠移植瘤和胃癌细胞的增殖能力（P<0.05），并增加Vimentin和N-cadherin的表达，同时降低E-cadherin的表达（P<0.05）；下调ABI2则相反（P<0.05）。机制分析发现上调ABI2促进移植瘤组织和胃癌细胞中Wnt2和β-catenin的表达（P<0.05），下调ABI2则相反（P<0.05）。 结论 ABI2在胃癌中表达升高并影响疾病远期预后，其可能与调控Wnt信号通路进而促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力有关。

Abstract

Objective To explore the regulatory role of Abelson interactor 2 (ABI2) in progression and prognosis of gastric cancer. Methods TIMER2.0, GEPIA, Kaplan-Meier Plotter and DAVID databases were used to analyze ABI2 expression in pan-cancer and its association with the prognosis of gastric cancer. Gastric cancer and adjacent tissues from 120 patients undergoing radical gastrectomy in our hospital between January, 2016 and October, 2018 were examined for ABI2 expression and its correlation with disease progression and prognosis. MGC-803 cell models of ABI2 knockdown and overexpression were established for observing the changes in cell proliferation, migration, and invasion, and the impact of ABI2 expression modulation on xenograft growth was evaluated in nude mice. Results Database analysis and examination of the clinical samples showed that ABI2 was highly expressed in gastric cancer tissues. Survival analysis suggested that gastric cancer patients with a high expression of ABI2 had a reduced postoperative 5-year survival rate (P<0.0001), and further Cox univariate and multivariate survival analyses indicated that a high ABI2 expression was an independent risk factor affecting the patients survival outcomes (P=0.022, HR=1.887, 95% CI: 1.096-3.249). Enrichment analysis suggested the involvement of ABI2 in Wnt signaling. In MGC-803 cells, ABI2 overexpression promoted cell proliferation and xenograft growth in nude mice, increased the expressions of vimentin and N-cadherin, and lowered E-cadherin expression, while ABI2 knockdown produced the opposite effects. Mechanistic analysis revealed that ABI2 overexpression promoted the expressions of Wnt2 and β-catenin in both MGC-803 cells and the xenografts, and their expressions were significantly lowered by ABI2 knockdown. Conclusion ABI2 is highly expressed in gastric cancer, which affects long-term prognosis of the patients, possible due to its regulatory effect on Wnt signaling to promote proliferation, migration and invasion of gastric cancer cells.

Graphical abstract

关键词

胃癌 / ABI2 / 预后 / 增殖 / 迁移 / 侵袭 / Wnt信号通路

Key words

gastric cancer / ABI2 / prognosis / proliferation / migration / invasion / Wnt signaling pathway

胃癌在全球范围内的发病率和死亡率均居高位，分别排名第5和第3^［1］。而在中国，胃癌的发病率和死亡率均高居第3，并呈逐年上升趋势^［2］。尽管目前胃癌的诊疗技术不断进步，但传统诊疗技术灵敏度和特异度仍然较低，难以做到对胃癌的早期发现、早期诊断和早期治疗，胃癌患者的长期生存率并未显著提高^{［3， 4］}。因此，深入研究胃癌相关分子机制，寻找具有更高灵敏度和特异性的生物标记物具有重要意义。Abelson相互作用因子（ABI）是Abelson非受体酪氨酸激酶（c-ABL）的作用底物^［5］，其包括ABI1、ABI2和ABI3三种类型^［6］。既往研究显示，ABI在肌动蛋白细胞骨架的动态重组中发挥重要调控作用，其可调节细胞的运动和迁移^{［5， 7-12］}。Jensen等^［13］研究发现，在前列腺癌中ABI2表达升高并与癌细胞的运动和侵袭能力增强相关。此外，既往研究显示，ABI2在肝细胞癌中高表达并与癌细胞的增殖、耐药能力提高和不良预后密切相关^［14］。然而关于ABI2在胃癌中的表达情况及其对胃癌患者预后的影响未见报道。基于此，本研究尝试探讨ABI2在胃癌进展和预后中的作用，并分析其可能的作用机制。

1 资料和方法

1.1 临床资料

选取2016年1月~2018年10月在本院接受胃癌根治术治疗的患者，共计120例。所选取患者均为原发性胃癌，且术前未接受过放疗、化疗和免疫治疗，病例资料完整。收集患者临床病例信息；通过电话随访了解患者术后5年的生存情况，随访截至2023年10月；从本院病理科获取患者的病理组织蜡块。本研究通过蚌埠医科大学第一附属医院伦理委员会审查（伦科批字［2023］KY028号）。

1.2 材料与试剂

人胃癌细胞系MGC-803（国家实验资源共享平台）；胎牛血清（FBS）和RPMI 1640培养基（Gibco）；一抗ABI2、Wnt2和β-catenin（武汉三鹰）；一抗Vimentin、N-cadherin、E-cadherin（CST），一抗β-actin（Abcam）；二抗HRP 标记山羊抗兔/鼠IgG聚合物（中杉金桥）。ABI2慢病毒工具（上海吉凯基因）；CCK-8试剂盒（北京索莱宝科技）；基质胶和Transwell小室（Corning）；裸鼠从江苏集萃药康生物科技股份有限公司购买（SCXK苏2018-0008）。

1.3 检测方法

1.3.1 生物信息学分析

通过TIMER2.0数据库分析ABI2在泛癌中的表达情况。通过GEPIA数据库查询分析胃癌组织与癌旁非肿瘤组织中ABI2表达水平的差异情况。Kaplan-Meier Plotter数据库分析评估胃癌组织中ABI2表达水平与患者生存期之间的关联。通过cBioPortal数据库获取ABI2在胃癌组织中具有相关性的基因，并于DAVID数据库平台进行KEGG和GO富集分析，以预测ABI2在细胞或生物系统中的功能调控和参与的生物学过程。

1.3.2 免疫组织化学检测胃癌和癌旁组织中ABI2表达水平

将收集的120例胃癌及癌旁组织蜡块制备成切片，脱蜡水化后进行抗原修复，3% H₂O₂孵育去除内源性过氧化物酶活性，随后进行血清封闭、一抗ABI2（1∶200）孵育过夜、加二抗（HRP 标记山羊抗兔IgG聚合物，1∶1）及DAB显色、苏木素复染细胞核，最后封片并拍照。使用ImageJ软件分析计算ABI2相对积分光密度（IOD）值。

1.3.3 细胞转染技术调控胃癌细胞ABI2表达

用完全培养基制备MGC-803细胞悬液，将细胞分为ABI2上调组（LV-ABI2）、ABI2下调组（Si-ABI2）和空白对照组（Control）分别接种于6孔板中，待细胞生长至80%左右，加入ABI2过表达载体和ABI2的特异性干扰载体（siRNA：GCGAGAACAACTACATACAGTCA），轻柔混匀，转染6 h后更换新鲜完全培养基，培养48 h后使用嘌呤霉素筛选出ABI2稳定表达的细胞株用于后续实验。

1.3.4 蛋白质免疫印迹法验证胃癌细胞ABI2调控效果

将转染成功的MGC-803细胞使用RIPA裂解液裂解30 min，并从中提取总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度，随后将所得蛋白变性，进行SDS-PAGE电泳、湿法转膜、封闭，加入一抗ABI2（1∶1000）和β-actin（1∶1000）4 ℃孵育过夜，再经TBST洗膜、二抗（HRP 标记山羊抗兔/鼠IgG聚合物，1∶3000）孵育、显影剂显影，最后上机拍摄并使用ImageJ软件对结果进行分析。

1.3.5 CCK-8法测定ABI2对胃癌细胞增殖的影响

取上述3组中生长良好的MGC-803细胞，消化后按适当比例重悬，吸取100 μL分别接种于96孔板中（1×10³/孔），于5% CO₂、37 ℃环境中培养，分别在第1、2、3、4、5天取出，选取目的孔室加入CCK8溶液（10 μL/孔），继续孵育2 h后取出孔板，使用酶联免疫检测仪，测定目的孔室细胞在450 nm波长处的吸光度值。

1.3.6 细胞划痕迁移实验和Transwell实验检测ABI2对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响

细胞划痕迁移实验：将MGC-803细胞于RPMI 1640培养基中培养至80%左右的密度，使用无菌枪头尖端在培养皿中的细胞单层上划出均匀的直线，随后用PBS冲洗，去除游离细胞和细胞碎片，加入新鲜培养液进行培养，分别在划线后0 h和24 h选取同一视野拍照记录。

Transwell侵袭实验：将50 μL基质胶铺在Transwell小室上层，使用无血清培养基重悬各组MGC-803细胞（已提前饥饿处理12 h），将细胞浓度稀释为1×10⁵ /mL，取200 μL滴加到上室中，取600 μL含10%FBS的RPMI 1640完全培养基加入下室，于细胞培养箱中培养48 h，取出小室，PBS淋洗，再经多聚甲醛（4%）固定和结晶紫（0.2%）染色处理，于显微镜下观察并拍照，计算侵袭细胞数量。Transwell迁移实验除不加基质胶外，其他同侵袭实验。

1.3.7 蛋白质免疫印迹法检测胃癌细胞上皮间充质转化相关蛋白及Wnt通路蛋白表达水平

一抗为：Vimentin，N-cadherin，E-cadherin，Wnt2，β-catenin和β-actin，所有抗体稀释比例为1∶1000，实验操作同1.3.4。

1.3.8 构建裸鼠移植瘤模型

选取BALB/c-Nude裸鼠（6~8周龄、雌性、体质量20~22 g），于我校动物房环境适应1周后，随机分成3组：ABI2上调组（LV-ABI2）、ABI2下调组（Si-ABI2）和空白对照组（Control），3只/组。选取上述3组生长良好的MGC-803细胞消化重悬（1×10⁸/mL），各取100 μL细胞重悬液接种于对应实验组裸鼠皮下，继续饲养裸鼠，于接种后第5、10、15、20、25天使用游标卡尺测量肿瘤长径（L）和短径（W），成瘤体积（V）按照公式V=（L×W²）/2计算，25 d后对裸鼠安乐死，取出瘤体，并对瘤体进行下一步处理。

1.3.9 蛋白质免疫印迹法检测胃癌瘤体组织上皮间充质转化相关蛋白及Wnt通路蛋白表达水平

将移植瘤组织进行破碎匀浆，使用RIPA裂解液于冰上裂解提取蛋白。其余步骤和抗体同1.3.7。

1.4 统计学方法

采用SPSS26.0和GraphPad Prism 9软件进行相应统计学处理和绘图。使用χ ² 检验、t检验和单因素方差分析评估组间差异。通过Spearman检验进行相关性分析，运用K-M生存曲线分析ABI2表达水平与患者术后5年生存率的关系，使用Cox回归模型分析对预后产生影响的危险因子。当P<0.05时，认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ABI2在胃癌组织中的表达水平升高

通过TIMER2.0数据库分析显示，相比于正常组织，ABI2在包括胃癌在内的多种癌组织中高表达（图1A，P<0.01）。GEPIA数据库也表明，ABI2在胃癌组织中表达水平升高（图1B，P<0.05）。使用免疫组化对本院120例胃癌患者病理组织进行IOD值检测，发现胃癌组织中的ABI2表达水平显著高于癌旁非肿瘤组织（图1C、D，P<0.05）。

2.2 胃癌组织中ABI2表达水平与疾病恶性进展相关

胃癌组织中ABI2表达水平与外周血CEA（P=0.017）和CA19-9水平（P<0.001）、病理分级（P=0.003）、T分期（P=0.006）和N分期（P=0.028）相关（表1）。并且CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37 kU/L、G3-G4期、T3-T4期和N2-N3期的患者在ABI2高表达组中的比例更高。随后对以上指标进行相关性分析发现，ABI2的表达水平与患者外周血CEA（r=0.5528，P<0.0001）和CA19-9（r=0.5944，P<0.0001）的水平呈正相关（图2）。

2.3 胃癌组织中ABI2表达水平影响胃癌患者预后

通过KM Plotter数据库（n=631）分析发现：胃癌组织中ABI2高表达患者的总体生存期明显低于低表达患者（图3A，P<0.0001）。此外，对本院120例胃癌患者术后5年生存率进行分析发现，与ABI2低表达胃癌患者相比，高表达患者的术后5年生存率明显更低（图3B，P<0.0001）。

2.4 胃癌组织中ABI2表达水平是胃癌患者的独立预后因素

对本院120例患者生存数据进行Cox单因素和多因素分析发现，ABI2表达水平、病理分级、CEA、CA19-9、T分期和N分期为影响胃癌患者5年生存率的独立预后因素（图4）。

2.5 ABI2在胃癌中的作用可能与Wnt通路相关

KEGG和GO富集分析发现，ABI2在胃癌中的调控作用可能与Wnt通路相关（图5）。

2.6 ABI2在体外实验中促进胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间充质转化

通过慢病毒转染构建ABI2干扰及过表达模型，免疫印迹结果表明上调组（LV-ABI2）中胃癌细胞的ABI2基因表达水平明显升高，下调组（Si-ABI2）中的ABI2基因表达水平明显下降（图6A、B，P<0.05）。CCK8实验结果显示，ABI2上调组胃癌细胞的增殖能力显著高于对照组，而ABI2下调组的胃癌细胞增殖能力显著低于对照组（图6C、D，P<0.05）。划痕和Transwell实验显示，相较于对照组，ABI2上调组的胃癌细胞表现出更强的迁移和侵袭能力，而ABI2下调组的迁移和侵袭能力则下降（图6G~L，P<0.05）。免疫印迹结果表明，ABI2上调组胃癌细胞的Vimentin，N-cadherin蛋白表达升高，E-cadherin蛋白表达水平下降，而ABI2下调组的蛋白表达情况与上调组相反（图6E、F，P<0.05）。

2.7 ABI2在体内实验中促进胃癌细胞增殖和上皮间充质转化

裸鼠皮下成瘤结果表明，ABI2上调组的肿瘤体积显著高于对照组，ABI2下调组的肿瘤体积显著低于对照组（图7A~C，P<0.05）。同时，免疫印迹结果表明，ABI2上调组胃癌瘤体组织的Vimentin，N-cadherin蛋白表达升高，E-cadherin蛋白表达水平下降，而ABI2下调组的蛋白表达情况与上调组相反（图7D、E，P<0.05）。

2.8 ABI2对胃癌细胞恶性生物学行为的影响可能与Wnt通路相关

体内外实验的免疫印迹结果显示，Wnt信号通路关键信号分子Wnt2和β-catenin在ABI2上调组中的表达水平显著升高，而在ABI2下调组中则显著降低（图8，P<0.05）。

3 讨论

胃癌是一种高发病率和高死亡率的恶性肿瘤^［1］。尽管其发病率较高，但由于早期胃癌病程隐匿，缺乏鉴别指征，大多数患者在明确诊断时已发展到中晚期，从而预后不佳^［15］。因此，寻找和确定新的分子靶点对于胃癌的诊断和预后至关重要。ABI2是一种SH3结构域结合蛋白^［16］，其可通过SH3结构域与ABL1和ABL2相互作用来影响细胞信号的传导^{［6， 17］}，进而参与调节细胞增殖、凋亡和细胞骨架动力学等过程^{［5-7， 9， 18］}。既往报道显示，ABI2在推动细胞运动和形态变化^{［7， 11， 13］}，以及细胞迁移和细胞黏附过程中也发挥重要作用^{［10-12， 14， 19］}。并且已有文献报道证实ABI2在前列腺癌和肝癌中的表达异常增高，且影响肿瘤细胞的迁移和侵袭能力^［13］，提示其可能成为胃癌诊断和评估预后的新分子靶点^{［13， 14］}。

TIMER2.0、GEPIA数据库分析显示，相较于癌旁组织，胃癌组织中ABI2基因处于高表达水平，且KM Plotter数据库的分析结果表明ABI2高表达与患者的不良生存结果相关。此外，本院120例胃癌患者病理组织免疫组化结果显示胃癌组织中的ABI2表达水平显著高于癌旁非肿瘤组织。随后我们对本院胃癌患者临床数据与ABI2表达水平之间的关系进行了分析，发现胃癌组织中ABI2表达水平与CEA水平、CA19-9水平、病理分级、T分期和N分期相关，并且ABI2表达水平与外周血CEA和CA19-9水平表现为正相关。进一步对本院120例胃癌患者的术后生存情况进行分析发现，胃癌组织中ABI2高表达的患者术后5年生存率明显低于低表达组，且Cox单因素和多因素分析表明ABI2表达水平是胃癌患者的独立预后因素。以上数据表明，ABI2在胃癌细胞中表现为高表达，并参与了胃癌的恶性进展，影响患者预后。然而，ABI2在胃癌中的作用途径和机制尚不明确。

通过KEGG和GO富集分析，我们发现ABI2在胃癌中的作用可能与Wnt信号通路有关，GO富集分析结果显示ABI2与胃癌细胞内活动纤毛和Wnt蛋白结合有相关性。既往研究显示，Wnt信号通路参与基因表达、细胞行为、细胞粘附和细胞极性的控制^［20］，对于组织再生和细胞分化等过程起着关键作用^［21-26］。该通路以Wnt蛋白为信号分子，通过细胞表面受体和细胞内信号转导分子传递信号^{［21， 22， 24， 25， 27］}。有研究发现，Wnt信号通路在结肠癌中常常被过度激活，使β-catenin降解减缓并在核周积累，随后转运入细胞核并与LEF/TCF转录因子家族相互作用，促进下游多个癌基因的表达，导致结肠癌的恶性转化和复发^{［22， 28-34］}。此外，有文献报道Wnt信号通路过度激活可以诱导肿瘤细胞表现出干细胞样特征，使其具有自我更新、增殖和多向分化能力^{［21， 24， 25］}。这种干细胞特征的表达有助于肿瘤的生成和转移^［35］。以上研究成果提示ABI2可能通过调控胃癌细胞的Wnt信号通路，进而增强胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。为了验证这种假设，我们采用慢病毒转染构建ABI2低表达和高表达胃癌细胞系，并构建裸鼠移植瘤模型，进行体内外实验。体外实验的CCK8结果显示，上调ABI2表达水平可以促进胃癌细胞增殖，同时划痕实验和Transwell实验结果表明，ABI2上调的胃癌细胞具有更强的迁移和侵袭能力。裸鼠皮下成瘤的结果也表明，上调ABI2可以增强胃癌细胞的增殖能力。在对体内外实验标本进行免疫印迹检测显示，上调ABI2可以促进胃癌细胞的上皮间充质转化进程以及促进Wnt信号通路关键蛋白Wnt2和β-catenin的表达^［36］。因此，ABI2高表达可以促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，且其作用机制可能与调控Wnt信号通路有关。

本研究发现ABI2在胃癌组织中处于高表达水平，并证实ABI2高表达与胃癌进展及患者不良预后相关，为ABI2作为胃癌诊治新的分子靶点提供了重要实验依据。并通过体外研究发现胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的增强与ABI2调控Wnt信号通路有关，因此有望通过对Wnt信号通路的干预，实现对胃癌更有效的临床诊治。

综上所述，本研究证明ABI2在胃癌组织中高表达，并参与疾病的恶性进展及患者不良预后，其机制可能与调控Wnt信号来影响胃癌细胞增殖、迁移和侵袭有关。

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基金资助

安徽省卫生健康科研项目(AHWJ2022a019)

蚌埠医学院第一附属医院杰出青年基金(2019byyfyjq01)

安徽省高校优秀青年人才支持计划重点项目(gxyqZD2022066)

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