过劳诱导小鼠血管内皮屏障功能障碍

Overwork induces vascular endothelial barrier dysfunction in mice

摘要

目的 研究过劳对小鼠血管内皮屏障功能的影响。 方法 将30只KM小鼠随机分为3组（n=10）：对照（CON）组、过劳2周（W2）组、过劳4周（W4）组。W2组和W4组采用水中站立+束缚实验分别连续造模2周和4周，观察小鼠一般情况。造模结束后，每组选取4只小鼠腹腔注射Evans蓝染料，检测血管通透性。另6只小鼠采取ELISA法检测血清IL-1β含量，获取动脉组织行切片观察，RT-qPCR法检测内皮细胞间紧密连接中occludin、claudin-5、ZO-1、JAM-A和黏附连接中VE-cadherin的mRNA表达水平；免疫荧光法检测内皮细胞间连接复合物中claudin-5、ZO-1、VE-cadherin和血管内皮糖萼中Syndecan-1的蛋白表达情况。 结果 与CON组相比，W2和W4组小鼠体质量增长缓慢，毛发脱落，活动减少。与CON组相比，W4组血管通透性明显增加。与CON组相比，W2和W4组血清IL-1β含量增加（P<0.05）。与CON组相比，W2组内皮细胞肿胀、脱落，内膜粗糙不规则，W4组出现内膜断裂现象。与CON组相比，W2组动脉组织中occludin、claudin-5、ZO-1、JAM-A的mRNA表达量增加，W4表达均降低（P<0.05）；W2和W4组VE-cadherin的mRNA表达量下降（P<0.05）。与CON组相比，W4组claudin-5、ZO-1、VE-cadherin和Syndecan-1蛋白表达减少（P<0.05）。 结论 过劳随时间的延长可对动脉内皮细胞间连接复合物以及内皮糖萼造成损伤，破坏其屏障功能，导致血管通透性增加。

Abstract

Objective To investigate the impact of overwork on vascular endothelial barrier function in mice. Methods Thirty KM mice were randomized equally into control, overwork for 2 weeks (W2) group and 4 weeks (W4) group. In the latter two groups, the mice were subjected to continuous standing in water for 8 h followed by restraint for 3 h to simulate overwork on a daily basis for 2 and 4 weeks. After modeling, 4 mice from each group were intraperitoneally injected with Evans blue dye to assess vascular permeability. In the other 6 mice, serum IL-1β levels were measured using ELISA, and arterial tissues were collected for histological examination and detection of mRNA expressions of occludin, claudin-5, ZO-1, JAM-A and VE-cadherin; immunofluorescence assay was used to detect the protein expressions of claudin-5, ZO-1, VE-cadherin, and Syndecan-1. Results The mice in W2 and W4 groups exhibited slower weight gain, hair loss, reduced activity, and significantly increased serum IL-1β levels. Vascular permeability was significantly increased in W4 group. In W2 group, the endothelial cells were swollen and dissociated, and the intima was rough and irregular; arterial intimal rupture was observed in W4 group. The mRNA expressions of occludin, claudin-5, ZO-1 and JAM-A in the arterial tissues were significantly increased in W2 group but decreased in W4 group, while VE-cadherin mRNA expression were reduced in both groups (P<0.05). The protein expressions of claudin-5, ZO-1, VE-cadherin, and Syndecan-1 were all significantly reduced in W4 group. Conclusion Prolonged overwork can cause damage of the intercellular junction complexes in arterial endothelial cells and the endothelial glycocalyx to result in impaired barrier function and increased vascular permeability in mice.

Graphical abstract

关键词

过劳 / 内皮屏障功能 / 内皮细胞间连接复合物 / 血管内皮糖萼

Key words

overwork / endothelial barrier function / endothelial intercellular junction complexes / vascular endothelial glycocalyx

2019年5月世界卫生组织（WHO）首次将“过劳”纳入《国际疾病分类》，认为它是一种慢性病。在医疗行业，过劳已成为损害医务人员身心健康的主要因素^［1］，一项关于2007~2018年中国医生过劳死的统计分析发现，因过劳致死的案例呈逐年增多的趋势，且造成过劳死的主要原因是心脑血管疾病^［2］。

目前研究认为，过度劳累和过大的工作压力会造成全身炎症标志物的增加^{［3， 4］}以及机体氧化应激的发生^［5，6］，这些慢性刺激会影响机体各个器官包括心脑血管的生理功能。有研究证明，慢性疲劳综合征的大鼠存在血管内皮收缩和舒张功能障碍^［7］；本课题组前期研究发现过劳会对大鼠动脉血管中层平滑肌细胞以及动脉血管壁细胞外基质造成损伤，从而破坏血管结构和功能^{［8， 9］}。过劳是否能够直接损伤血管内皮屏障功能，成为心脑血管病变的基础，目前尚无相关研究。

血管内皮屏障是血管腔面的一层选择性半透屏障，控制血管内外液体和溶质以及细胞的交换。这一过程与内皮细胞间连接复合物（主要包括紧密连接和黏附连接）以及血管内皮糖萼介导的细胞旁途径密切相关，这些结构会受到机体各种炎症物质的影响，对其屏障功能造成损伤。内皮屏障功能受损不仅是多种疾病过程的起始因素^［10］，也与多种病理状况密切相关，如中风、冠状病毒病（COVID-19）、败血症、血管性水肿和内脏水肿等^［11］。本研究通过水中站立+束缚实验建立小鼠过劳模型，检测小鼠血管通透性、内皮细胞间连接复合物以及血管内皮糖萼相关指标，探究过劳对血管内皮屏障功能的影响。本研究的意义在于探索过劳相关的血管病变的可能机制，为后续寻找过劳对机体损伤的预测指标和治疗靶点提供一定的方向和思路。

1 材料和方法

1.1 实验仪器与试剂

病理切片机、组织摊片机、生物组织冷冻包埋机（金华市益迪医疗设备有限公司）；载玻片及盖玻片（江苏世泰实验器材有限公司），显微拍照系统（山东志盈医学科技有限公司，SN100680221）。二甲苯、无水乙醇（天津大茂化学试剂厂），Evans蓝染料（0.5%）、伊红、苏木素、BSA（北京索莱宝生物科技有限公司），IL-1β试剂盒（江苏酶免实业有限公司），荧光一抗ZO-1（GeneTex），荧光一抗claudin-5、VE-cadherin、Syndecan-1和荧光二抗（Immunoway）。

1.2 实验动物与分组

SPF级健康雄性KM小鼠30只，体质量29~33 g，由兰州大学实验动物中心提供。采用随机数字表法将30只小鼠分为3组（10只/组）：对照组（CON组）、过劳2周（W2）组、过劳4周（W4）组。实验前小鼠适应性喂养1周，饲养环境为室温24±1 ℃、湿度（45±10）%，明暗交替12 h，喂食标准饲料，自由饮水。本研究经兰州大学第一医院伦理委员会批准（伦理批号：LDYYLL2024-378）。

1.3 模型建立

每天上午10∶00将W2组和W4组小鼠放入水深为1±0.2 cm、水温为25±1 ℃的水盒，当天下午18∶00将其拿出擦干，再装进束缚筒中，21∶00结束后放回笼中，水中站立以及结束后的时段不限制饮食。W2组和W4组分别连续造模2周、4周，CON组正常饲养，不做特殊处理。每天造模前测量每只小鼠的体质量以及观察其活动能力。

1.4 标本获取与处理

造模结束后，每组选取4只小鼠腹腔注射Evans蓝溶液（50 μL/只），1 h后采用丙泊酚腹腔注射（100 mg/kg）麻醉处死小鼠，分离切取主动脉，PBS缓冲液充分清洗后，剥离血管外周结缔组织，将其置于多聚甲醛溶液中固定，常温保存，用于血管通透性的检测。其余小鼠麻醉后眼球取血并获取主动脉标本，每组取3只小鼠的动脉组织1 cm，用于HE染色以观察动脉内膜形态学变化和免疫荧光蛋白含量测定；剩余小鼠动脉组织剥离干净后置于-80 ℃保存备用，用于RT-qPCR检测目的基因mRNA的表达。

1.5 血管通透性检测

取多聚甲醛溶液固定的动脉组织，PBS冲洗多聚甲醛固定液，先拍摄血管大体图像。利用Evans蓝染料的红色荧光，将动脉组织进行脱水、包埋、切片、脱蜡，使用荧光显微镜观察采集图像，使用Image J软件分析动脉横切面Evans蓝荧光强度。

1.6 ELISA定量检测

小鼠眼球取血，注入试管中凝结后，室温下离心20 min左右（2000~3000 r/min），分离血清，采用ELISA法测定血清IL-1β含量，按试剂盒说明书进行操作。酶标仪在450 nm处测吸光度， 并通过标准曲线测定各组样品中IL-1β浓度。

1.7 HE染色观察血管内皮细胞形态学变化

取多聚甲醛溶液固定的动脉组织，PBS冲洗多聚甲醛固定液，采用酒精、二甲苯脱水透明后，石蜡包埋，制作3~5 μm厚切片。二甲苯与梯度酒精脱蜡后进行HE染色，脱水透明后滴加适量中性树脂封片。切片置于光学显微镜下观察，采集图像进行分析。

1.8 RT-qPCR检测mRNA表达

根据试剂盒说明书要求，取出保存于-80 ℃的血管标本，提取各组小鼠动脉组织中总RNA；配置反转录体系对RNA进行反转录，获得cDNA；而后配制RT-qPCR反应体系，并在荧光定量PCR仪上完成扩增，扩增采用三步法：预变性（95 ℃，5 min，循环1次）；变性（95 ℃，10 s），退火（55~60 ℃，20 s），延伸（72 ℃，20 s），变性-退火-延伸循环40次；溶解曲线阶段。2^{－ΔΔＣｔ}法对结果进行分析处理。各基因引物序列见表1（引物由博迈德生物科技公司合成）。

1.9 免疫荧光染色

将制备好的石蜡切片依次放入二甲苯和梯度酒精中脱蜡脱水，组织切片置于盛满柠檬酸（pH6.0）抗原修复液的高压锅内进行抗原修复，BSA 封闭后与相应一抗claudin-5（1∶200）、ZO-1（1∶200）、VE-cadherin（1∶100）、Syndecan-1（1∶150）放于湿盒内4 ℃孵育12 h。PBS清洗切片3次，加荧光二抗：羊抗小鼠IgG（1∶500），37 ℃避光孵育2 h，PBS清洗切片3次。DAPI染核后甘油封片，荧光显微镜拍照观察，使用Image J软件对蛋白荧光表达进行半定量分析。

1.10 统计学分析

采用SPSS26.0及Graphpad prism 8.0软件进行统计学分析，数据用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般情况的比较

各组小鼠体质量变化情况如表1。与CON组相比，W2和W4组小鼠体质量增长缓慢。与CON组相比，W2和W4组小鼠活动能力差，毛发有脱落。

2.2 血管通透性检测

与CON组和W2组相比，W4组小鼠动脉有部分明显蓝染节段（图1）。横截面Evans蓝荧光显微镜下可见W4组染料渗透整个血管壁；用Image J软件对血管横截面Evans蓝荧光强度进行测量分析，与CON组相比，W2组无明显差异（P>0.05），W4组荧光强度明显增加（P<0.05）。

2.3 ELISA检测血清IL-1β含量

与CON组相比，W2和W4组血清IL-1β含量明显增加（P<0.05）。与W2组相比， W4组血清IL-1β含量增加（P<0.05，图2）。

2.4 HE染色分析

与CON组相比，W2组动脉内皮细胞出现增生、肿胀、脱落，内膜粗糙不规则（图3），W4组内膜出现断裂现象（箭头所示）。

2.5 内皮细胞间连接复合物相关基因表达水平

与CON组相比，W2组紧密连接中occludin、claudin-5、ZO-1、JAM-A基因表达上调（P<0.05），W4组上述基因表达降低（P<0.05）。与CON组相比，W2组黏附连接中VE-cadherin基因表达降低（P<0.05）；与W2组相比，W4组VE-cadherin基因表达降低（P<0.05，表3）。

2.6 免疫荧光法分析动脉组织中各蛋白的表达

与CON组相比，W2组各蛋白的表达无明显变化（P>0.05），W4组claudin-5、ZO-1、VE-cadherin和Syndecan-1蛋白表达明显减少（P<0.05，图4）。

3 讨论

过度疲劳是工作中生理和心理长期接受不良刺激和压力的结果，本实验参考刘艳艳等^［12］的小鼠水中站立模型和Park等^［13］的小鼠束缚实验，使用强迫小鼠水中站立结合束缚筒的方法建立小鼠过度疲劳模型。该模型利用小鼠对水的惧怕以及其昼伏夜出的生活习性，造成小鼠的躯体疲劳与心理应激，同时影响其睡眠时间及质量。邓三春等^［14］的过劳相关实验采用了与本实验完全一致的动物模型，通过观测该模型小鼠活动能力、体质量以及心肌细胞缝隙连接蛋白Cx45等指标证明，模型的建立是确切有效的。

Evans蓝（EB）染料是一种结合白蛋白的染料，与白蛋白结合的EB染料在血液中保持稳定，并分布在整个身体血管中。由于内皮屏障的存在，EB染料在血液循环中受到限制，无法穿过该屏障^［15］。因此，EB染料被广泛用于评估各种模型中的血管通透性。本实验通过腹腔注射EB染料，循环1 h后获取动脉观察并检测横截面EB染料的荧光强度。结果显示，过劳2周小鼠血管通透性没有明显改变，4周后小鼠动脉出现明显蓝染节段，同时血管壁横截面荧光强度的显著增加，表明过劳4周会增加小鼠血管通透性。动脉组织横截面的组织切片也表明，在连续过劳2周后，血管内皮细胞明显增生、肿胀，血管内膜粗糙不规则，4周后内膜甚至出现断裂现象。这说明过劳时间的延长会对小鼠血管的内膜造成不同程度的破坏，从微观证明了过劳对血管内皮屏障功能的损伤。

内皮屏障是控制血管内外液体和溶质以及细胞交换的动态结构。液体、溶质和细胞的外渗可通过跨细胞或细胞旁途径介导，大多数受调节的物质跨内皮转运主要通过细胞旁途径发生，这也是炎症病理引起内皮细胞屏障功能障碍的主要通路^［16］。细胞旁途径的维持主要与内皮细胞间的黏附连接和紧密连接以及内皮糖萼功能有关^［17］。

黏附连接是形成细胞间相互作用的蛋白质复合物，并通过细胞质部分连接到肌动蛋白细胞骨架，从而连接相邻细胞。血管内皮钙粘蛋白（VE-cadherin）在结构和功能上都是黏附连接的主要成分， 对维持内皮屏障至关重要^［18］。紧密连接是由多个分子构成的复合物，主要包括claudins、occludin、JAMs、闭锁带蛋白（ZOs）。紧密连接是调控内皮细胞渗透性的重要因素^［19］，其表达和分布在不同血管中有较大差异，例如在脑血管内皮中非常丰富并发育良好，有助于血脑屏障的完整；此外，大小动脉的内皮也具有相对较多的紧密连接^［20］。本实验结果显示，编码紧密连接蛋白的基因occludin、claudin-5、ZO-1、JAM-A过劳2周后表达上调，4周后表达明显降低；编码黏附连接中VE-cadherin的基因2周后表达降低，4周较2周表达水平进一步降低。免疫荧光结果显示，过劳4周后动脉内膜层claudin-5、ZO-1和VE-cadherin蛋白表达明显减少，证明过劳会影响血管内皮细胞间紧密连接和黏附连接组成蛋白的表达，破坏血管内皮屏障功能。

糖萼是位于内皮细胞表面的复杂的糖蛋白结构，在调节血管的通透性、炎症反应、血小板形成等方面具有重要作用^［21］，主要由蛋白聚糖、糖胺聚糖侧链组成，也包括一些糖蛋白和血浆蛋白。多配体聚糖-1（Syndecan-1）作为蛋白聚糖的核心蛋白通过跨膜结构域依附在血管内皮上，且被作为糖萼损伤的经典标志物之一^［22］。本实验检测到连续过劳4周小鼠动脉内膜Syndecan-1蛋白明显减少，说明过劳会破坏内膜糖萼的完整性，降低糖萼对血管内皮功能的保护作用。

长时间工作后会导致全身炎症反应水平增加，其原因主要包括睡眠不足、皮质类固醇分泌、氧化应激和高危健康行为等^［23］。其中睡眠剥夺可影响多个生物学途径，如心血管自主神经控制、氧化应激、炎症反应和内皮功能^［24-26］，这些途径都被认为与睡眠剥夺促进心血管疾病风险增加有关，如高血压、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病和心律失常，以及代谢紊乱（糖尿病和肥胖）等^［27］。在机体发生炎症反应时，会通过多个途径影响内皮细胞间连接复合物和血管内皮糖萼来破坏血管内皮屏障功能。潘舟等^［28］综述了具体的机制，其中包括TNF-α和脂多糖可导致内皮细胞的环磷酸腺苷的下调，导致内皮细胞屏障功能破坏；氧化磷酸化和内化的VE-cadherin也可以减少VE-cadherin水平，进而破坏内皮屏障功能；某些细胞因子可以通过直接影响紧密连接的claudin-5来增加血管通透性^［29］。其中IL-1β不仅参与发热、摄食、睡眠等的调节，而且还可诱导疲劳感、抑郁等精神症状^［30］。本实验观察到在小鼠过度疲劳以及睡眠被限制后，小鼠体内炎症水平增加，血管内皮细胞间连接复合物以及表面糖萼明显减少，从而影响内皮屏障功能，造成血管通透性的增加。

本实验不足之处在于仅通过机体炎症水平增加方面讨论了过劳诱导内皮损伤的可能机制之一，未进一步验证其具体通路；造模过程中未发现小鼠发生过劳相关猝死，可能是过劳时间较短或强度不足的原因。

综上所述，长期过劳会增加机体炎症水平，破坏动脉血管内皮细胞间紧密连接、黏附连接和细胞表面糖萼，造成内皮屏障功能受损，这可能是过劳引起相关心血管疾病的原因之一。本研究补充了过劳损伤血管的病理生理基础内容，为将来发现过劳对血管损伤的预测因子从而早期识别猝死高风险人群提供了思路。

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