开心散通过减轻前额叶皮质铁死亡缓解小鼠的阿霉素化疗性抑郁

Kaixinsan alleviates adriamycin-induced depression-like behaviors in mice by reducing ferroptosis in the prefrontal cortex

摘要

目的 明确中药复方开心散缓解乳腺癌阿霉素化疗性抑郁的疗效，并分析其药理机制。 方法 将40只雌性BALB/c小鼠通过原位注射4T1细胞建立乳腺癌小鼠模型，将小鼠随机分为对照组、模型组、开心散低剂量组和开心散高剂量组，10只/组。通过旷场试验和高架十字迷宫实验行为学分析、抑郁相关因子血清学检测、转录组学分析、透射电镜病理分析和铁死亡相关因子检测分析阿霉素诱导的化疗性抑郁产生的病因以及开心散的作用机制。利用SH-SY5Y细胞系构建体外模型并使用铁死亡抑制剂Fer-1进行阳性对照，验证动物实验结果。 结果 开心散显著逆转阿霉素化疗所致的抑郁样行为（P<0.001）、逆转抑郁相关血清学的改变（P<0.05）；转录组学结果显示，开心散缓解化疗性抑郁与调控前额叶皮质组织氧化应激、脂质代谢和铁离子结合等过程有关；病理学分析、铁死亡相关因子检测结果显示，开心散能减轻阿霉素化疗所致的前额叶皮质组织铁死亡（P<0.01）。体外实验结果也显示，开心散含药血清和铁死亡抑制剂均能逆转阿霉素诱导的神经细胞铁死亡（P<0.001）。 结论 开心散通过减轻乳腺癌阿霉素化疗所致的大脑前额叶皮质组织铁死亡，进而缓解化疗性抑郁。

Abstract

Objective To investigate the effect of Kaixinsan (KXS, a traditional Chinese medicine formula) for alleviating adriamycin-induced depression-like behaviors in mice bearing breast cancer xenografts and explore the pharmacological mechanism. Methods Forty female BALB/c mice were randomized equally into control group, model group, and low- and high-dose KXS treatment groups, and in the latter 3 groups, mouse models bearing orthotopic breast cancer 4T1 cell xenografts were established and treated with adriamycin along with saline or KXS via gavage. Depression-like behaviors of the mice were assessed using open field test and elevated plus-maze test, and the changes in serum levels of depression-related factors were examined. RNA-seq analysis and transmission electron microscopy were used and ferroptosis-related factors were detected to explore the mechanisms of adriamycin-induced depression and the therapeutic mechanism of KXS. The results were verified in SH-SY5Y cells using ferroptosis inhibitor Fer-1 as the positive control. Results KXS significantly alleviated depression-like behaviors and depression-related serological changes induced by adriamycin in the mouse models. RNA-seq results suggested that KXS alleviated chemotherapy-induced depression by regulating oxidative stress, lipid metabolism and iron ion binding in the prefrontal cortex. Pathological analysis and detection of ferroptosis-related factors showed that KXS significantly reduced ferroptosis in the prefrontal cortex of adriamycin-treated mice. In SH-SY5Y cells, both KXS-medicated serum and the ferroptosis inhibitor were capable of attenuating adriamycin-induced cell ferroptosis. Conclusion KXS alleviates adriamycin-induced depression-like behaviors in mice by reducing ferroptosis in the prefrontal cortex of breast cancer-bearing mice.

Graphical abstract

关键词

开心散 / 乳腺癌 / 化疗 / 抑郁 / 铁死亡

Key words

Kaixinsan / breast cancer / chemotherapy / depression / ferroptosis

2024年4月公布的全球癌症流行病学最新数据显示，女性乳腺癌位居2022年癌症新增病例数第2位，占比11.6%；死亡数位居癌症死亡病例第3位，占比6.9%^{［1， 2］}。目前全球女性乳腺癌的疾病负担仍然较重，乳腺癌的防治方法仍然需要改进。三阴性乳腺癌在乳腺癌中恶性程度最高，其治疗主要以化疗为主^［3-5］。在中国晚期三阴性乳腺癌临床诊疗指南（2024版）推荐的治疗方案中，以阿霉素为代表的蒽环类药物是三阴性乳腺癌化疗的一线用药^［6］。阿霉素在临床治疗中虽有确切疗效，但其毒副作用也不容忽视，如神经毒性^［7］、心脏毒性^［8］和骨髓抑制^［9］等，限制了阿霉素的临床应用^{［10， 11］}。但过往研究主要集中于阿霉素的心脏毒性，对于阿霉素的神经毒性反应缺乏深入研究，目前仍没有较好防治阿霉素神经毒性的临床治疗方案。因此，现需深入研究阿霉素神经毒性的病理机制并寻找有效缓解阿霉素神经毒性反应的治疗方案。

有研究表明，阿霉素化疗能显著地引起多种动物的抑郁样反应^［12-14］，这可能与化疗导致中枢神经系统神经元损伤有关^［15-19］。临床研究表明，中医中药在肿瘤化疗过程中有确切的增效减毒作用^［20］，体现为减轻神经毒性^［21-24］、血液毒性^{［23， 24］}和脏器毒性^［23］等，可以提高肿瘤患者化疗的安全性和舒适度^{［25， 26］}。开心散是中医治疗情志类疾病的经典名方，临床上广泛用于治疗抑郁^［27-29］、失眠^［30］和痴呆^［31］等。有动物研究表明，开心散能显著缓解阿霉素化疗引起的精神症状^［32］，但该研究并未分析阿霉素在其中的作用机制。阿霉素的毒副作用主要是由于其导致正常组织细胞的铁死亡所致^［2-4］，开心散是否通过减轻阿霉素所致的组织铁死亡进而缓解阿霉素化疗性抑郁这一科学问题有待探讨。因此，本研究评估开心散缓解乳腺癌阿霉素化疗性抑郁的疗效，并分析其药理机制，明确开心散通过减轻阿霉素所致的神经细胞铁死亡缓解化疗性抑郁症状，可为后续优化乳腺癌的防治策略和开发改善化疗毒副作用的药物提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

40只6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠（广东维通利华实验动物技术有限公司），体质量19±1 g，饲养于暨南大学实验动物管理中心，实验动物使用许可证号：SCXK（粤）2017-0174。本动物实验方案经暨南大学实验动物福利伦理委员会审核（伦理批号：IACUC-20220526-03），符合动物保护、动物福利和伦理原则，符合国家实验动物福利伦理的相关规定。

1.2 药物

开心散（KXP）购于暨南大学附属第一医院（广州华侨医院），全方由人参（Panax ginseng C.A.Mey.）、茯苓［Poria cocos （Schw.）Wolf］、远志（Polygala tenuifolia Willd.）、石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott）组成，组成比例为3∶3∶2∶2，剂型为中药配方颗粒；阿霉素（Adriamycin，阿拉丁）；铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1，Sigma-Aldrich）。

1.3 细胞培养

小鼠4T1三阴性乳腺癌细胞和人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞由广东省中医院陈前军主任医师课题组提供，细胞在含10%胎牛血清（Gibco）、100 U·mL^-1青霉素和100 µg·mL^-1链霉素（Gibco）的RPMI 1640培养基（Gibco）中培养，置于含5% CO₂的三气培养箱（Thermo Fisher Scientific）中，在37 ℃潮湿环境下恒温培养。每48 h更换一次培养基，待细胞生长密度达到90%时进行常规传代培养，采用对数生长期的细胞进行后续实验。使用小鼠血清代替胎牛血清培养体外细胞模型，含药血清以及药物处理时间为48 h，使用MTT比色法检测细胞活力。

1.4 动物模型的建立、分组与给药

荷瘤动物建模方法参照团队前期研究^［32］，40只BALB/c适应性喂养1周后，在右侧第4乳腺脂肪垫处注射1×10⁵个4T1细胞，建立荷瘤乳腺癌模型。注射乳腺癌细胞7 d后，将40只荷瘤小鼠随机均分为4组，分别为对照组、模型组、开心散低剂量组（KXS-L）和开心散高剂量组（KXS-H），10只/组。模型组和开心散组每周予以阿霉素腹腔注射处理（5 mg/kg，第1、7、14、21天，共4次），开心散低剂量组予以低剂量开心散灌胃处理（0.5 g·kg^-1·d^-1，共21次），开心散高剂量组予以高剂量开心散灌胃处理（1 g·kg^-1·d^-1，共21次），其余对照性操作均用生理盐水代替药品进行处理。在给药结束后第2天进行行为学试验。

1.5 行为学分析

1.5.1 旷场试验

使用旷场试验评价小鼠的抑郁焦虑情绪，参照团队前期研究^［33］，将小鼠放入旷场实验箱中（40 cm×40 cm×30 cm），使用摄像机记录其自发运动情况，试验在昏暗的光线下进行，记录时长为5 min。采用EthoVision XT 14软件［诺达思（北京）信息技术有限责任公司］分析运动轨迹，以显示总运动路程和中央区（20 cm×20 cm）停留时间比。

1.5.2 高架十字迷宫实验

使用高架十字迷宫实验评价小鼠的抑郁焦虑情绪，将小鼠放入中央平台（5 cm×5 cm），使用摄像机记录其5 min内自由探索测试场地的情况，场地包含两条开臂（30 cm×5 cm×0.5 cm）和两条闭臂（30 cm×5 cm×15 cm）。采用EthoVision软件包分析头部进入开臂区的次数。

1.6 小鼠处死和样品收集

在小鼠给药治疗和行为学全部完成后，腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉小鼠，收集全血后颈椎脱臼处死，立即切除全脑组织，并合理保存样品进行后续实验。全血使用非抗凝管进行收集，在4 ℃环境下静置4 h后吸取上层血清，血清在12 000×g、4 ℃离心机中离心30 min后再次吸取上清，使用0.22 μm的针头式过滤器过滤得到含药血清，含药血清置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.7 小鼠血清学分析

使用小鼠促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）ELISA试剂盒（新赛美）、小鼠促肾上腺皮质激素（ATCH）ELISA试剂盒（迈瑞达）、小鼠内源性糖皮质激素（GC）ELISA试剂盒（Dogesce）、小鼠皮质酮（CORT）ELISA试剂盒（Ainnob）、小鼠5-羟色胺（5-HT）ELISA试剂盒（奇松生物）、小鼠神经肽Y（NPY）ELISA试剂盒（ELK Biotechnology）、小鼠去甲肾上腺素（NE）ELISA试剂盒（迈瑞达）和小鼠脑源性神经营养因子（BDNF）ELISA科研试剂盒（酶标生物），按照试剂盒说明书的检测步骤，分别检测小鼠血清中抑郁相关因子的含量。

1.8 转录组学分析

参照团队前期研究^［34］，小鼠新鲜前额叶皮质组织立即置于液氮中冷冻保存，干冰运输，转录组学测序及后续的相关数据分析均由北京诺禾致源科技股份有限公司负责完成。使用STRING数据构建蛋白-蛋白相互作用网络图，使用Cytoscape 3.9.0软件绘制网络度值图。

1.9 透射电子显微镜

参照团队前期研究^［35］，新鲜小鼠前额叶皮质组织用2.5%戊二醛浸泡固定4 h，然后用0.01 mol/L的PBS漂洗3次，15 min/次，1%锇酸浸泡固定2 h，0.01 mol/L的PBS漂洗干净，再经进行丙酮梯度脱水，Epon812浸脂，树脂包埋，按37 ℃（6 h）、45 ℃（12 h）和63 ℃（24 h）的顺序进行聚合，制成电子显微镜标本。70 nm超薄切片，常规醋酸双氧釉和枸橼酸铅染色，透射电子显微镜观察各组前额叶皮质各层的超微结构。

1.10 铁死亡生化分析

使用组织活性氧（ROS）检测试剂盒（贝博），按照试剂盒说明书的检测步骤，检测小鼠前额叶皮质组织活性氧的含量；使用脂质过氧化传感器试剂盒（Invitrogen），按照试剂盒说明书的检测步骤，检测体外培养细胞中脂质活性氧的含量。使用铁含量检测试剂盒（Sigma-Aldrich）、还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）检测试剂盒（碧云天）和脂质氧化（MDA）检测试剂盒（碧云天），按照试剂盒说明书的检测步骤，检测小鼠前额叶皮质组织和体外培养细胞中其余铁死亡相关生化指标的含量。

1.11 统计学方法

本研究为探索性研究，基于文献^［36］确定小鼠样本量；利用SPSS 13.0进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较先进行方差齐性检验，方差齐者采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，方差不齐者采用Dunnett's T₃检验，P<0.05为差异有统计学意义。利用GraphPad Prism 9软件进行数据图像化。

2 结果

2.1 开心散缓解阿霉素引起的抑郁样行为

行为学试验结果显示，阿霉素化疗导致小鼠旷场试验和高架十字迷宫试验的运动距离减少、旷场试验中央区停留时间比下降、高架十字迷宫试验进入开臂区次数减少，开心散可有效改善化疗所致的上述行为学改变，且具有明显的剂量效应（P<0.001，图1）。

2.2 开心散逆转阿霉素引起的抑郁相关血清学改变

血清学分析结果显示，阿霉素化疗改变了抑郁相关因子在血液中的含量，开心散治疗能明显逆转这些指标的改变，且开心散对血清GC、5-HT、NPY、NE和BDNF具有剂量效应（P<0.05，图2）。

2.3 开心散缓解阿霉素引起的抑郁情绪的转录组学数据及靶点互作分析

转录组学的PCA图显示，对照组和开心散组在空间位置上较为接近，而模型组则较为远离对照组和开心散组（图3A）。差异表达基因的火山图显示，相比于对照组，模型组中有612个转录本表达上调、759个转录本表达下调（图3B）；相比于模型组，开心散组中有699个转录本表达上调、597个转录本表达下调（图3C）。组间差异表达基因的韦恩图显示，组间共同表达差异的转录本有568个（图3D）。共同表达差异基因的双向聚类热图显示，对照组和开心散组的转录本表达趋势较为一致，而模型组则表现出与对照组和开心散组的显著差异（图3E）。将568个共同表达差异基因导入String数据库，获取蛋白-蛋白相互作用网络图（图3F），再将得到的数据导入Cytoscape 3.9.0软件绘制相互作用网络度值图，度值最大的10个节点依次是Gapdh、Nr1h4、Plg、Adh4、Serpinb2、Brca2、Fkbp6、Gabra6、Cd5l、Clca1（图3G）。

2.4 开心散缓解阿霉素引起的抑郁情绪靶点的富集分析

GO富集结果显示，差异表达基因在氧化还原酶、铁离子结合、过氧物酶体、离子传输、细胞脂质分解代谢过程等通路被富集（图4A）。KEGG通路富集结果显示，差异表达基因在脂肪酸降解、过氧物酶体、泛素介导的蛋白降解等通路被富集（图4B）。Reactome通路富集结果显示，差异表达基因在生物氧化、脂肪酸代谢等通路被富集（图4C）。

2.5 开心散抑制阿霉素引起的脑组织铁死亡

透射电镜结果显示，模型组前额叶皮质组织出现线粒体变小、膜密度变大、嵴减少甚至消失等典型的铁死亡特征，开心散治疗显著恢复了线粒体的正常形态（图5A）。生化分析结果显示，阿霉素化疗改变了铁死亡相关因子在前额叶皮质中的含量，开心散治疗能明显逆转这些指标的改变，且具有剂量效应（P<0.01，图5B~E）。

2.6 开心散含药血清可以抑制阿霉素诱导的神经细胞铁死亡

体外模型显示（图6A），阿霉素明显抑制SH-SY5Y细胞的聚团、成簇生长，开心散含药血清和铁死亡抑制剂Fer-1均能恢复阿霉素处理后的聚团、成簇生长抑制。MTT比色法结果显示，阿霉素抑制了SH-SY5Y细胞的细胞活力，开心散含药血清和Fer-1均能明显恢复被抑制的细胞活力且具有剂量效应（图6B）。生化分析结果显示，阿霉素处理改变了铁死亡相关因子在SH-SY5Y细胞的含量，开心散治疗能明显逆转这些指标的改变，且具有剂量依赖效应（图6C~F）。

3 讨论

抑郁在中医学称为“郁证”，其病因病机多为痰蒙心神、心失所养，病位在脑^［37］。化疗导致气血不畅、脏腑功能失调，痰阻脑络、气血不能上荣，从而引起心境低落、忧伤愁苦，悲观绝望等抑郁症状。开心散全方由4味中药组成，石菖蒲与茯苓意在“开窍除湿”，人参与远志功可“补益心气”，若心气足，“湿邪”便没有机会阻塞“心窍”，抑郁等情志疾患也就无从患生^［38］。如若“湿阻清窍”，那么在“开窍除湿”的同时，还不能忘记“补益心气”，正所谓“正气存内，邪不可干”^［39］。本研究明确中药复方开心散缓解乳腺癌阿霉素化疗性抑郁的疗效，证实了在中医益气除痰理论指导下治疗该类治病的有效性。

既往临床前研究证实，阿霉素可引起正常组织产生过量的活性氧、丙二醛等脂质过氧化代谢产物，进而使正常组织出现铁死亡等病理改变^{［40， 41］}。研究表明，前额叶皮质组织的铁死亡是抑郁产生的重要因素^{［42， 43］}。我们从高通量测序结果发现，阿霉素导致的前额叶皮质病变与脂质过氧化密切相关，并且开心散能干预此病变过程。脑科学与内分泌学研究证实，抑郁状态下，边缘系统-下丘脑-垂体-肾上腺（LHPA）轴的功能存在异常激活^{［44， 45］}，导致外周糖皮质激素、皮质酮等含量异常升高^［46］。由于此时LHPA轴存在功能异常，糖皮质激素和皮质酮等激素失去了对上游调控中枢的负反馈调节作用^{［47， 48］}，导致人体正常的自我调节功能失调，因此，该状态下需要借助外界的干预治疗以恢复人体的正常功能水平。本研究证实，开心散能有效恢复HPA轴的功能，这可能是开心散减轻前额叶皮质铁死亡性组织损伤的结果。

为进一步证明开心散能直接减轻阿霉素导致的神经细胞的铁死亡，本研究使用SH-SY5Y细胞研究开心散含药血清对体外模型细胞活力和铁死亡标志物的影响，并且使用铁死亡抑制剂Fer-1作用为阳性对照，结果证实开心散能直接减轻阿霉素诱导的神经细胞铁死亡，而不是主要通过其他途径。鉴于Fer-1在人体内的安全性和有效性尚不确定，而开心散已有大量临床研究证明其安全性和有效性^［27-29］。因此，选择开心散治疗阿霉素化疗引起的抑郁似乎更符合实际临床需要。

本研究表明阿霉素导致的化疗性抑郁可能是由于前额叶皮质组织发生铁死亡所致，同时我们发现开心散可以减轻阿霉素导致的前额叶皮质组织铁死亡并减轻化疗所致的抑郁样行为。LHPA轴可能在组织病变和行为改变这两者中充当了重要的角色，但抑郁产生的原因非常复杂^［49］，是否有其他神经环路在其中起关键的调控作用，仍需要后续研究探讨。由于血脑屏障的存在，开心散中的多数成分并不能通过血脑屏障进入大脑中直接起到治疗作用。因此，后续需要进一步运用计算机辅助药物设计和人工智能药物设计等网络药理学的方法，从开心散中筛选出具有高药用潜力的先导化合物，为进一步的药理学验证和后续的药物开发提供数据支持。

综上所述，开心散可能通过减轻阿霉素引起的前额叶皮质组织铁死亡，恢复小鼠LHPA轴的功能，从而缓解乳腺癌化疗引起的抑郁症状。

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