基线水平CCL19⁺树突状细胞可有效预测肺腺癌患者免疫治疗的敏感性

Assessment of baseline CCL19⁺ dendritic cell infiltration for predicting responses to immunotherapy in lung adenocarcinoma patients

摘要

目的 探讨肺腺癌微环境基线水平CCL19⁺ 树突状细胞（CCL19⁺ DC）与肺腺癌患者接受免疫治疗疗效及肺腺癌患者CD8⁺ T细胞浸润的相关性。 方法 回顾性分析2020年1月~2023年12月在河南科技大学第一附属医院住院的肺腺癌患者资料，并收集行免疫治疗的肺腺癌患者组织标本96例。应用免疫荧光法检测96例肺腺癌组织中CCL19⁺ DC及CD8⁺ T细胞的浸润状况。受试者工作特征（ROC）曲线评估基线水平CCL19⁺DC对肺腺癌免疫治疗疗效预测价值，并进行敏感性分析。采用卡方检验分析肺腺癌组织中基线水平CCL19⁺ DC与免疫疗效及CD8⁺T细胞浸润的相关性。采用Pearson相关性分析评价基线水平CCL19⁺ DC表达与细胞毒性T细胞（CTL）浸润相关性。将PC9肺腺癌细胞、CD8⁺ T细胞及DC（过表达CCL19和/或抗PD-1处理）进行分组体外共培养，采用流式细胞学方法检测T细胞各表面分子（GranzymeB、Perforin、IFN-γ、Ki-67）表达情况。 结果 免疫荧光结果显示，PR/CR组（Respond）的患者肺腺癌组织中CCL19⁺ DC浸润高于PD/SD组（Unrespond）患者，表现出更好的免疫治疗疗效，ROC曲线下面积为0.785，敏感度为75.6%，特异度为62.8%。CCL19⁺ DC高表达患者肺腺癌组CD8⁺ T细胞表面分子Granzyme B（P<0.01）、Perforin（P<0.01）、IFN-γ（P<0.01）及 Ki-67（P<0.001）表达均高于CCL19⁺ DC低表达患者。肺腺癌组织基线水平CCL19⁺DC的表达与免疫治疗疗效具有显著的相关性（P=0.003），与CTL细胞浸润呈正相关（r=0.6657，P<0.001），CCL19⁺ DC丰富度与CD8⁺ T细胞的浸润具有显著的相关性（P=0.007）。与对照组相比，转染过表达CCL19质粒及单独使用anti-PD1处理组中CD8⁺ T淋巴细胞杀伤及增殖功能标志物增加（P<0.01）。使用anti-PD1联合转染过表达CCL19质粒处理组中CD8⁺ T淋巴细胞杀伤及增殖功能标志物水平显著增加（P<0.001）。 结论 在免疫治疗背景下，肺腺癌微环境中基线水平CCL19⁺ DC的表达与肺腺癌患者免疫治疗疗效及CTL细胞浸润呈正相关，并且肺腺癌微环境中CCL19⁺ DC可以提升CD8⁺ T细胞杀伤及增殖功能标志物水平，发挥潜在抗肿瘤免疫作用。因此，肺腺癌微环境中基线水平CCL19⁺DC可以有效预测肺腺癌免疫治疗的敏感性。

Abstract

Objective To explore the correlation of baseline CCL19⁺ dendritic cell (CCL19⁺ DC) infiltration in lung adenocarcinoma microenvironment with immunotherapy efficacy and CD8⁺ T cell infiltration. Methods We retrospectively analyzed the data of patients with lung adenocarcinoma hospitalized at First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology from January, 2020 to December, 2023, and collected tissue samples from 96 patients undergoing immunotherapy for assessing CCL19⁺ DC and CD8⁺ T cell infiltration using immunofluorescence assay. We evaluated the predictive value of baseline CCL19⁺ DCs for patient responses to immunotherapy using receiver-operating characteristics (ROC) curves and analyzed the correlations of baseline CCL19⁺ DC expression with immunotherapy efficacy and CD8⁺ T cell and cytotoxic T lymphocyte (CTL) infiltrations. In co-culture systems of lung adenocarcinoma PC9 cells, CD8⁺ T cells and DCs (overexpressing CCL19 with or without anti PD-1 antibody treatment), the expressions of granzyme B, perforin, IFN-γ, and Ki-67 in T cells were analyzed using flow cytometry. Results The patients with partial or complete remission following immunotherapy had a significantly higher baseline CCL19⁺ DC infiltration level in lung adenocarcinoma tissues than those with poor responses. CCL19⁺ DC infiltration had an area under ROC curve of 0.785, a sensitivity of 75.6%, and a specificity of 62.8% for predicting immunotherapy efficacy. The expression of CD8⁺ T cell surface molecules Granzyme B (P<0.01), Perforin (P<0.01), IFN-γ (P<0.01) and Ki-67 (P<0.001) in patients with high expression of CCL19⁺ DC were higher than those in patients with low expression of CCL19⁺ DC. The baseline CCL19⁺ DC infiltration level was positively correlated with immunotherapy efficacy (P=0.003), CTL infiltration of (r=0.6657, P<0.001) and CD8⁺ T cell infiltration (P=0.007). In the co-cultured cells, CCL19 overexpression combined with anti-PD1 treatment of the DCs more strongly enhanced cytotoxicity and proliferation of CD8⁺ T lymphocytes than either of the single treatments (P<0.01 or 0.001). Conclusion The baseline CCL19⁺ DC infiltration level in lung adenocarcinoma microenvironment is positively correlated with immunotherapy efficacy and CTL infiltration and can thus predict the response to immunotherapy.

Graphical abstract

关键词

肺腺癌 / CCL19⁺树突状细胞 / 免疫治疗 / CD8⁺T细胞

Key words

lung adenocarcinoma / CCL19⁺ dendritic cells / immunotherapy / CD8⁺ T cells

肺腺癌作为肺癌中常见的组织学类型之一，其发病率和病死率长期居高不下，严重威胁人类健康^［1］。尽管临床上肺腺癌的免疫治疗方法取得了突破性进展，显著延长了部分肺腺癌患者的生存期，但仍有相当比例的患者对免疫治疗无应答或耐药，表明肺腺癌免疫治疗尚存在个体差异性^{［2， 3］}。因此，深入研究肺腺癌免疫治疗的分子机制，筛选能预测免疫治疗效果的生物标志物，对于实现肺腺癌免疫治疗个体化具有重要意义^{［4， 5］}。

肿瘤微环境中浸润的免疫细胞是影响肿瘤进展和免疫治疗效果的关键^［6］。树突状细胞（DC）是机体内最主要的抗原提呈细胞，在启动和维持T细胞抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用^［7］。大量研究显示，DC浸润水平与多种实体瘤患者的预后密切相关，说明DC的浸润状态可能是评估肿瘤免疫状态和预测免疫治疗效果的潜在标志^{［8， 9］}。然而，肿瘤微环境中不同亚型的DC在分布和功能上存在显著差异。因此，有必要深入研究特定DC亚型的分子表型和功能，以寻找更精准有效的免疫治疗标志物^{［10， 11］}。有研究显示^［12］，趋化因子在协调抗肿瘤免疫中发挥重要作用。目前已发现多种趋化因子能够募集DCs，例如CC趋化因子配体19（CCL19）^{［13， 14］}。CCL19的表达与多种肿瘤预后和抗肿瘤免疫相关，其可诱导肿瘤微环境中DC及CD8⁺ T细胞浸润的增加。CCL19可能成为潜在的肿瘤预后标志物、免疫治疗预测性生物标志物及癌症治疗靶点^［15］。

尽管已有研究证实了在非小细胞肺癌、黑色素瘤和鼻咽癌等多种肿瘤中存在表达CCL19的CCL19⁺DC亚群，并与肿瘤预后相关^［16-18］。但CCL19⁺ DC在肺腺癌微环境中的作用机制及其与肺腺癌患者免疫治疗疗效的相关性尚未见报道。本研究通过回顾性分析接受免疫治疗的肺腺癌患者的临床病理资料和体外研究，初步探讨基线水平CCL19⁺ DC与免疫治疗后肺腺癌微环境中CD8⁺ T细胞浸润以及免疫治疗效果之间的相关性，将为肺腺癌患者免疫治疗用药提供参考。

1 资料和方法

1.1 基本资料

1.1.1 一般资料

选取2020年1月~2023年12月河南科技大学第一附属医院收治的96例肺腺癌患者，年龄35~75（59.4±6.1）岁。纳入标准：病理结果确诊为肺腺癌；初次诊治；接受肺癌根治术；患者及家属对本研究知情。排除标准：未完成诊治及随访；合并严重的心肺功能障碍；伴有精神障碍性疾病；妊娠哺乳期妇女。本研究经河南科技大学第一附属医院伦理委员会审核批准通过（伦理批号：2024-03-K0071）。

1.1.2 细胞

肺癌细胞系PC-9（上海博古生物细胞所）。

1.1.3 主要试剂

RPMI 1640培养基（普诺赛）；胰蛋白酶、红细胞裂解液、人外周血淋巴细胞分离液（Solarbio）；青-链霉素（Servicebio）；柠檬酸盐修复液粉（上海生工）；磷酸缓冲液（PBS）粉末、五色多重荧光组化染色试剂盒（Absin）；CD11c抗体（CST）；CCL19抗体（Proteintech）；CD8抗体（Abcam）；CD3 PerCP-CY5.5、Granzyme B-PE、CD8 BV605（BD）；Ki67-FITC、Perforin-PE、IFN-γ-PE（Invitrogen）；Pan-DC富集试剂盒、CD8 Microbeads human（Miltenyi）；Recombinant Human CCL19（R&D Systems）；InVivoMAb anti-human PD-1（BioXcell）。质粒Human CCL19 Overexpression（pcDNA3.1）由赛业（苏州）生物科技有限公司定制完成（Kozak-Human CCL19 CDS V315-1-ANF序列：5'-CTATAGGGAGACCCAAGC TG-3'；Kozak-Human CCL19 CDS V315-1-ANR序列：5'-CA GTCGAGGCTGATCAGCGG-3'）。

1.1.4 主要仪器

CO₂培养箱（Thermo Fisher）、流式细胞仪（CyTek）、芯片扫描仪（3DHISTECH）、凝胶成像系统（BIO-RAD）。

1.2 检测方法

1.2.1 免疫荧光法检测肺腺癌组织中CD11c⁺ CCL19⁺ DC与CD8⁺ T细胞浸润情况

实验步骤按照多重免疫荧光化学染色法检测进行。常规步骤包括组织切片石蜡溶解、组织切片二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、抗原高温高压修复、内源性过氧化物酶阻断，滴加5% BSA封闭后滴加一抗［一抗CD11c （DC标志物）稀释比1∶800，一抗CCL19 稀释比1∶200，一抗CD8稀释比1∶100，一抗Granzyme B稀释比1∶100，一抗Perforin稀释比1∶100，一抗IFN-γ稀释比1∶200，一抗稀释比Ki-67稀释比1∶200］，４℃孵育过夜，PBS充分冲洗后滴加荧光二抗，室温孵育1 h，滴加DAPI，室温避光孵育20 min后抗荧光淬灭封片剂封片4 ℃避光保存，用芯片扫描仪扫描后观察。

1.2.2 质粒转染

使用Pan-DC富集试剂盒按照使用说明分离出树突状细胞（DC），培养于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640中。DC在基础条件下体外培养6 h。然后，将生长良好的树突状细胞接种于12孔板中，当密度达到1×10⁵ /孔时，加入1 mL新鲜培养液再培养24 h，当细胞密度达到80%时转染质粒。将铺板细胞的培养液更换为900 μL新鲜的含血清的细胞培养基。加入100 μL脂质体/DNA混合物，37 ℃孵育6 h后，更换转染培养基。加入1 mL 新鲜生长培养基，培养48 h后将细胞转移至 10 cm 培养皿进行培养，更换为含G-418 Geneticin的新鲜培养基进行药筛，筛选3 d后换成半量浓度的抗生素维持。初筛G-418 Geneticin浓度为800 μg/mL，之后更改为1600 μg/mL。

1.2.3 Western blotting

使用细胞裂解液提取细胞中的蛋白，并以BCA法检测蛋白浓度。测定浓度后的蛋白加入Loading buffer，沸水煮10 min。按实验步骤制备浓缩胶、上样、电泳、转膜后，用5%脱脂奶粉封闭1 h，再加入一抗，4 ℃孵育过夜。使用TBST洗膜后，加入二抗，室温孵育1 h后洗膜。ECL方法进行曝光显影。

1.2.4 细胞共培养与实验分组

使用含有10%FBS及1%青链霉素的RPMI 1640完全培养基，在37 ℃及5%CO₂的培养箱中培养肺癌细胞系PC-9，2~3 d/次换液传代，并在显微镜下观察，取对数生长期细胞进行后续实验。取健康志愿者的外周血，与等体积外周血淋巴细胞分离液、PBS缓冲液混匀，分离出单个核细胞（PBMC），使用CD8 Microbeads human分离出CD8⁺ T细胞，培养于含10% FBS的RPMI 1640中。细胞共分为4组：对照组（CTL组）：将PC9细胞、DC与CD8⁺T进行共培养；Anti-PD-1组：将PC9细胞、DC与CD8⁺ T进行共培养，给予anti-PD-1处理；CCL19过表达组：将PC9细胞、过表达CCL19的DC与CD8⁺ T进行共培养；Comb组：将PC9细胞、过表达CCL19的DC与CD8⁺ T进行共培养，并给予anti-PD1处理。上述处理组中anti-PD-1浓度为15 mg/mL。

1.2.5 流式细胞学检测

将上述分组共培养的细胞分别进行消化处理，PBS洗涤２遍，1000 r/min离心5 min，去上清液。使用200 μL PBS溶液重悬细胞，并转移至流式管。使用一抗CD3-PerCP-CY5.5、CD8-BV605、Perforin-PE、Gzmb-PE、IFN-γ-PE、Ki67-FITC等进行染色，４℃避光孵育30 min，加入300 μLPBS洗涤去除未结合的染料，离心去上清液后加入300 μL PBS重悬细胞，上机检测。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0和Graphpad9.0对实验数据进行统计学分析及制图，数据以均数±标准差表示，两组数据比较采用独立样本t检验，3组或以上数据比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌组织基线水平CCL19⁺ DC表达与免疫治疗疗效、CD8⁺ T细胞浸润、细胞毒性T细胞（CTL）浸润的关系

2.1.1 肺腺癌组织基线水平CCL19⁺ DC表达与免疫治疗疗效的关系

收集96例肺腺癌患者免疫治疗肿瘤组织及患者临床资料，根据肺腺癌患者免疫第三周期结束后复查的影像结果，采用WHO制定的疗效评估标准将患者分为部分缓解/完全缓解组（PR/CR组，Respond）及进展性疾病/稳定性疾病组（PD/SD组，Unrespond）。结果显示，PR/CR组（Respond）的患者肺腺癌组织中CCL19⁺ DC浸润高于PD/SD组（Unrespond）的患者肺腺癌组织 （图1，P<0.001；表1，P=0.003）。应用ROC曲线分析CCL19⁺ DC与肺腺癌免疫治疗疗效的相关程度，结果显示CCL19⁺ DC预测肺腺癌免疫治疗疗效的ROC曲线下面积为0.785，最佳截断值为20.75%，其敏感度为75.6%，特异度为62.8%（图1）。

2.1.2 免疫荧光法检测肺腺癌组织中CD8⁺ T细胞浸润情况

CD8⁺ T与Granzyme B、Perforin、IFN-γ及Ki-67分子的共定位结果显示，与基线水平CCL19⁺ DC低表达患者肺腺癌组织相比，基线水平CCL19⁺ DC高表达患者肺腺癌组织中CD8⁺ T细胞表面分子Granzyme B（P<0.01）、Perforin（P<0.01）、IFN-γ（P<0.01）及Ki-67（P<0.001）表达量均显著增加（图2，P<0.05）。

同时，基线水平肺腺癌患者组织中CCL19⁺ DC的丰富度与CD8⁺ T细胞的浸润具有显著的相关性（表2，P=0.007）。

2.1.3 肺腺癌微环境中基线水平CCL19⁺ DC的表达与CTL浸润相关性分析

结果显示，与基线水平CCL19⁺ DC低表达肺腺癌患者相比，基线水平CCL19⁺ DC高表达的肺腺癌患者组织中CTL细胞浸润显著增多。相关性分析结果显示，基线水平CCL19⁺ DC的表达和CTL细胞浸润呈正相关（图3，r=0.6557，P<0.001）。

2.2 免疫治疗背景下CCL19⁺ DC浸润对CTL增殖及杀伤功能的影响

2.2.1 转染过表达CCL19质粒细胞成功表达CCL19蛋白

使用Western blotting方法分析未转染及转染过表达CCL19质粒的DC中CCL19蛋白的表达情况。结果显示，与未转染的DC细胞相比，转染过表达CCL19质粒的DC中CCL19蛋白表达明显增高（图4，P<0.001）。

2.2.2 转染过表达CCL19质粒和/或anti-PD1处理增加了CD8⁺ T细胞表面分子的表达

流式细胞学结果显示，与对照组（未处理组）相比，转染过表达CCL19质粒及单独使用anti-PD1处理组中CD8⁺ T细胞表面分子GranzymeB （P<0.01）、Perforin （P<0.01）、IFN-γ（P<0.01）、Ki-67（P<0.01）水平增加。与对照组（未处理组）相比，使用anti-PD1联合转染过表达CCL19质粒处理组中CD8⁺ T细胞表面分子Granzyme B（P<0.001）、Perforin （P<0.001）、IFN-γ（P<0.001）、Ki-67（P<0.001）水平显著增加（图5）。

3 讨论

目前临床上肺癌治疗方式主要包括手术治疗、化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗等^［19］。PD-1/PDL-1免疫检查点抑制剂（ICI）的使用，使部分肺癌患者实现了长期生存^［20］。ICI只能使一部分患者受益，因此临床上需要寻找有效的生物标志物来预测ICI的潜在治疗疗效，从而指导临床决策。DC已被证明在ICIs的治疗反应中发挥关键作用，并已作为癌症免疫治疗的潜在靶点引起了广泛关注^［21-23］。但不同亚型的DC在肿瘤免疫微环境中的表达及功能状态仍需进一步探讨。有学者提出趋化因子可调节肿瘤微环境中多种细胞的募集^{［24，25］}。CCL19属于CC趋化因子家族成员之一，可由DC产生^［26］，并参与免疫细胞浸润和免疫应答的调控。本研究通过回顾性分析接受免疫治疗的肺腺癌患者临床病理资料和体外细胞学实验，初步探讨基线水平CCL19⁺ DC在肺腺癌微环境中的作用机制，结果显示CCL19⁺ DC在肺腺癌微环境中的表达与肺癌患者免疫治疗疗效、抗肿瘤免疫增强及与ICI协同作用方面密切相关，可以有效预测肺腺癌免疫治疗的敏感性。

既往研究发现，在肺癌小鼠模型中，给予重组CCL19可以显著增加肿瘤部位CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞以及树突状细胞的浸润，并伴随着IFN-γ水平的升高，从而有效提升了小鼠对抗肿瘤生长的能力^［27］。另外，结肠癌小鼠模型在给予重组CCL19治疗后，也得到了同样的结果^{［28， 29］}。也有研究证实，在肺癌小鼠模型中肿瘤区域CCL19的产生与CD8⁺ T细胞的浸润呈正相关^［30］。最近研究报道显示，给结肠癌小鼠模型局部注射能够表达CCL19的间充质干细胞，可以有效促进肿瘤内DC和CD8⁺ T细胞的浸润，并显著增强anti-PD-L1的治疗效果^［31］。本研究中，免疫荧光检测结果显示PR/CR组（Respond）患者肺腺癌组织中CCL19⁺ DC浸润高于PD/SD组（Unrespond）患者肺腺癌组织，ROC曲线下面积为0.785，敏感度为75.6%，特异度为62.8%，表明CCL19⁺DC对肺腺癌免疫治疗疗效具有一定的预测价值。同时，CD8与Granzyme B、Perforin、IFN-γ及Ki-67共定位的实验结果与上述研究报道结果相似，基线水平CCL19⁺ DC高表达的患者肺腺癌组织中CD8⁺ T细胞表面IFN-γ表达量增加。同时，我们还检测到CD8⁺ T细胞表面Granzyme B、Perforin及Ki-67表达量也同步增加。卡方检验结果显示，肺腺癌微环境中基线水平CCL19⁺ DC的表达与肺腺癌患者免疫治疗疗效及CD8⁺ T细胞浸润具有明显的相关性。除此之外，皮尔逊（Pearson）相关分析结果显示，基线水平CCL19⁺ DC的表达和CTL细胞浸润呈正相关。上述结果说明，肺癌微环境中CCL19⁺ DC有望成为预测肺腺癌患者免疫治疗疗效的新型生物标志物。

为进一步验证免疫治疗背景下CCL19⁺ DC浸润对CTL增殖及杀伤功能的影响，我们进行了体外细胞共培养实验。本研究选取肺腺癌细胞系PC-9与CD8⁺ T细胞及DC进行共培养，按照分组方法在DC细胞中转染过表达CCL19质粒，并给予anti-PD-1处理。通过流式细胞术检测各组CD8⁺ T细胞表面杀伤及增殖功能标志分子Granzyme B、Perforin、IFN-γ及Ki-67的表达。结果显示，与对照组相比，使用anti-PD-1（anti-PD-1组）及DC细胞转染过表达CCL19质粒处理组（CCL19过表达组）中，CD8⁺ T细胞表面分子表达均升高，使用anti-PD1联合转染过表达CCL19质粒处理组（Comb组）各CD8⁺ T细胞表面分子升高更显著，这些结果与结肠癌小鼠模型中CCL19增强anti-PD-L1治疗效果结果相似^［31］。另外，有研究报道多种肿瘤中存在表达CCL19的DC^［18-20］，但均没有就患者肿瘤微环境中基线水平CCL19⁺ DC对ICI的增强作用进行探讨。本研究在一定程度上丰富了既往研究的结果，为临床评估免疫治疗疗效提供了新的思路和方向。另外，有研究表明CCL19与头颈鳞癌（HNSCC）预后不良相关^［32］，这与本研究结果有所不同，考虑可能与肿瘤类型及肿瘤微环境（TME）差异有关。因此，CCL19⁺ DC在不同肿瘤中的发挥的作用和机制可能存在差异，需要进一步深入探讨。

本研究还存在一些局限性。首先，本研究样本量较小，未来将扩大样本量对结果进行进一步的验证。其次，本研究主要探讨了免疫治疗背景下基线水平CCL19⁺ DC表达与CD8⁺ T细胞浸润的相关性，CCL19⁺ DC与其他免疫细胞亚群的相互作用及其临床意义有待进一步阐明。再次， 本研究通过体外实验初步证实了CCL19⁺ DC可增强CD8⁺ T细胞的杀伤及增殖功能，但其具体 分子机制尚不明确，还需进一步研究。

综上所述，本研究初步探究了在免疫治疗背景下，肺腺癌微环境中基线水平CCL19⁺ DC的表达与免疫治疗疗效具有相关性，肺腺癌微环境中CCL19⁺ DC可以增强CD8⁺ T淋巴细胞表面增殖和杀伤标志分子的表达，发挥潜在抗肿瘤免疫作用。该研究丰富了对CCL19⁺ DC在肺腺癌免疫治疗中作用的认识，为指导肺腺癌患者免疫治疗提供了一定理论依据。

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