Notch1信号通过调控细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解参与子宫腺肌病的发生及发展

Role of Notch 1 signaling and glycolysis in the pathogenic mechanism of adenomyosis

摘要

目的 基于Notch1信号观察子宫腺肌病（AM）在位内膜及Ishikawa细胞系糖酵解相关因子和蛋白的表达，并探讨子宫腺肌病的发生机制。 方法 收集AM（AM组，n=8）及子宫肌瘤（CON组，n=8）在位子宫内膜组织，通过临床特征评估两组子宫内膜的可比性， qRT-PCR和Western blot检测其Notch1信号及糖酵解相关因子和蛋白的表达，通过葡萄糖和乳酸试验检测其葡萄糖和乳酸的含量；建立过表达Notch1的Ishikawa细胞慢病毒稳转株， CCK-8检测其细胞存活率， Transwell迁移和侵袭实验检测其迁移和侵袭能力，细胞外酸化速率检测其糖酵解储备。 结果 与CON组子宫内膜组织比较，AM组糖类抗原125（CA125）水平明显高于CON组（P<0.01），AM患者在位子宫内膜组织Notch1、HK2和PDHA的mRNA相对表达量增加（P<0.01或P<0.05），Notch1、GLUT1、HK2、PKM和PDHA蛋白相对表达量均显著升高（P<0.01或P<0.05），葡萄糖含量显著下降、乳酸水平显著升高（P<0.01或P<0.05）。与对照病毒空载体（ov-NC）比较，过表达Notch1的Ishikawa细胞慢病毒稳转株（ov-Notch1）的细胞存活率显著升高（P<0.05），细胞迁移和侵袭细胞数量显著增加（P<0.05），酵解容量和酵解储备显著升高（P<0.01或P<0.05）。 结论 Notch1信号可能通过调控细胞的增殖、迁移、侵袭和糖酵解过程，进而参与AM的发生发展。

Abstract

Objective To investigate the expressions of glycolysis-related factors and changes in Notch1 signaling in endometrial tissues of adenomyosis (AM) and Ishikawa cells to explore the pathogenesis of AM. Methods Eutopic endometrial tissues were collected from 8 patients with AM and 8 patients with uterine fibroids matched for clinical characteristics (control group). The expressions of Notch1 signaling proteins and glycolysis-related factors in the collected tissues were detected using qRT-PCR and Western blotting, and the levels of glucose and lactic acid were determined. An Ishikawa cell model with lentivirus-mediated stable Notch1 overexpression was established for assessing cell survival rate with CCK-8 assay, cell migration and invasion abilities with Transwell migration and invasion assays, and glycolytic capacity by determining the extracellular acidification rate. Results Compared with those in the control group, the endometrial tissues in AM group showed significantly increased expression level of carbohydrate antigen 125 (CA125), increased mRNA expression levels of Notch1, HK2 and PDHA and protein expressions of Notch1, GLUT1, HK2, PKM and PDHA, lowered glucose level and increased lactate level. The Ishikawa cell models with stable Notch1 overexpression exhibited significantly increased cell survival rate with attenuated cell migration and invasion abilities and decreased glycolysis capacity and reserve. Conclusion The Notch1 signaling pathway participates in the pathogenesis of AM possibly by regulating the proliferation, migration, invasion and glycolysis of endometrial cells.

Graphical abstract

关键词

子宫腺肌病 / 子宫内膜 / 糖酵解 / Ishikawa细胞系 / 慢病毒

Key words

adenomyosis / endometrium / glycolysis / Ishikawa / lentivirus

子宫腺肌病（AM）是一种常见的妇科良性子宫疾病，其病理表现为子宫内膜腺体和间质侵入子宫肌层。约80%的患者年龄在40~50岁，且在生育期内年龄越大，症状越严重，其发病机制主要涉及类固醇激素异常、细胞增殖和凋亡、粘附和侵袭、炎症、纤维化和血管生成等^［1-3］。AM的发生发展过程与肿瘤转移的过程相似，常伴随一系列与异常能量代谢相关的生物学特性和功能异常^{［4， 5］}。研究发现，AM子宫肌层的内膜异位种植，可能由AM的能量代谢异常引起^［6-8］，也可能由于在位内膜的增殖和迁移能力增强，通过微创伤的子宫内膜-肌层交界面，侵入子宫肌层并种植生长^{［9， 10］}。目前，基于AM子宫内膜的生物学特性及能量代谢探讨AM发生机制的研究，尚未见报道。

大多数肿瘤细胞存在能量代谢异常，其能量获取主要依赖于糖酵解^［11］.糖酵解始于通过葡萄糖转运蛋白（GLUT）家族的溶质载体摄取葡萄糖，引起细胞能量代谢相关的糖酵解关键酶［如丙酮酸激酶M2（PKM2）、丙酮酸脱氢酶（PDHA）和己糖激酶2（HK2）］的表达上调，促进有氧糖酵解、葡萄糖的消耗和乳酸产生，糖酵解能力增强，进而促进肿瘤细胞生长与增殖^［12-15］。Notch1信号作为调控细胞生物学行为的重要通路之一^［16］，在子宫内膜细胞中普遍表达^［17］，与葡萄糖摄取、糖酵解、乳酸到丙酮酸转化等过程的相关，能正向调控糖酵解相关基因的表达^［18］。因此，AM可能通过Notch1信号，调控糖酵解及其相关酶的表达，影响AM在位内膜功能及细胞生物学特性，进而促进AM的发生。

Ishikawa细胞系的基因表达变化与病理生物学行为与AM在位内膜的异常生物学行为相似^［19-21］，常用于推测AM在位子宫内膜细胞的药物反应^{［22， 23］}，以弥补AM原代细胞获取困难、异质性大、生物学特征不够稳定等缺陷。本研究基于AM在位子宫内膜中Notch1信号与糖酵解关键酶的表达情况，Notch1信号过表达对Ishikawa细胞细胞存活率、迁移侵袭能力及糖酵解功能的影响，旨在通过组织和细胞两个层面共同探讨Notch1信号对糖酵解等生物学功能的影响及其对AM发生机制的调控作用。

1 资料和方法

1.1 在位子宫内膜组织的收集

在位子宫内膜组织来源于2021年1月~2022年8月在广州中医药大学第三附属医院妇科进行全子宫切除手术的患者，AM组（术后石蜡病理提示AM）和正常对照组（CON组，术后石蜡病理提示子宫平滑肌瘤）。患者年龄均在40~50岁，未绝经，术前3个月未使用过激素及类似药物治疗。本研究已获得广州中医药大学第三附属医院伦理委员会批准（伦理批号：2020025），所有患者均已知悉并同意将其组织样本应用于实验。

1.2 定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测AM在位子宫内膜组织Notch1信号及糖酵解相关因子的表达

收集利用RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒分别进行子宫内膜组织mRNA的提取和cDNA的逆转录，将cDNA、SYBR预混液与PCR引物以10u体系进行qRT-PCR反应。PCR引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司在线设计、定制。以2^-△△Ct法计算mRNA相对表达量。

1.3 蛋白免疫印迹检测AM在位子宫内膜组织Notch1信号及糖酵解相关蛋白的表达

子宫内膜组织经蛋白提取、蛋白定量、SDS-PAGE电泳、蛋白质转移及免疫印记等步骤，显色拍照后利用Image J进行条带灰度值的计算。本研究使用的抗体情况如下：Notch1兔抗、GLUT1兔抗、HK2兔抗、PKM兔抗、PDHA兔抗（Abcam，抗体稀释比依次为1∶1000、1∶100 000、1∶10 000、1∶10 000、1∶1000）。

1.4 葡萄糖和乳酸测定试剂盒检测AM在位子宫内膜组织葡萄糖和乳酸的含量

子宫内膜组织称量、机械匀浆和离心后，取上清液按照葡萄糖和乳酸测定试剂盒进行葡萄糖及乳酸测定。

1.5 过表达Notch1的Ishikawa细胞慢病毒稳定细胞株的构建

经由上海吉凯基因医学科技股份有限公司构建过表达目的病毒（ov-Notch1）和对照病毒空载体（ov-NC）。Ishikawa细胞系（江苏凯基生物技术股份有限公司）转染ov-Notch1或ov-NC慢病毒48 h后，用含0.5 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基进行Ishikawa慢病毒稳转株的筛选1周。

1.6 细胞增殖实验（CCK-8）检测过表达Notch1的Ishikawa细胞稳转株的存活率

将1.3所获的慢病毒稳转株接种至96孔板培养24 h，加入10 μL/孔的CCK-8溶液37 ℃孵育2 h，于酶标仪（波长450 nm）中读取吸光值（OD值），计算细胞存活率。

1.7 Transwell迁移和侵袭实验检测过表达Notch1的Ishikawa细胞稳转株的迁移和侵袭能力

将Transwell小室置于24孔板内（侵袭实验提前将60 μL无血清培养基和Matrigel基质胶（8∶1）铺平于上室，37 ℃孵育3 h），取1.3所获的稳转株细胞以4×10⁴/mL的密度接种至上室，下室加入完全培养，37 ℃恒温培养24 h后经PBS冲洗、4%多聚甲醛固定、结晶紫避光染色，于200倍光学显微镜下随机选取3个视野拍照计数。

1.8 细胞外酸化速率（ECAR）检测过表达Notch1的Ishikawa细胞稳转株的糖酵解储备

将1.3所获的慢病毒稳转株接种于Seahorse XF24 V7细胞培养微孔中，经细胞自然沉降、贴壁后，在探针板中依次加入葡萄糖和寡霉素，通过Seahorse能量代谢检测仪检测细胞ECAR。统计时，加入葡萄糖的ECAR值代表糖酵解，加入寡霉素的ECAR值代表酵解容量，糖酵解储备为酵解容量与糖酵解的差值。

1.9 统计学分析

采用Shapiro-Wilk检验进行连续变量的正态分布检验。符合正态分布的数据以均数±标准差表示，组间差异采用两独立样本t检验分析；不符合正态分布的数据以中位数M（P25-P75）表示，组间差异采用Mann-Whitney U检验。采用SPSS 25.0进行数据分析，P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜来源患者的基线特征

本研究共收集AM组和CON组子宫内膜标本各8例，AM组CA125水平明显高于CON组（P<0.01，表2），而年龄、子宫大小、妊娠次数、流产次数在两组间差异均无统计学意义。

2.2 AM患者在位子宫内膜组织Notch1信号及糖酵解相关因子mRNA的表达上调

与CON组子宫内膜比较，AM患者子宫内膜Notch1、HK2和PDHA的mRNA相对表达量增加（P<0.05，表3）。与CON组子宫内膜比较，AM患者子宫内膜的GLUT1和PKM的mRNA相对表达量有升高趋势，但差异无统计学意义。

2.3 AM患者在位子宫内膜组织Notch1信号及糖酵解相关蛋白的表达上调

与CON组子宫内膜比较，AM患者子宫内膜Notch1、GLUT1、HK2、PKM和PDHA蛋白相对表达量均显著升高（P<0.05或P<0.01，图1，表4）。

2.4 AM患者在位子宫内膜组织葡萄糖消耗增加、乳酸水平升高

与CON组子宫内膜比较，AM患者子宫内膜葡萄糖含量显著下降、乳酸水平显著升高（P<0.01或P<0.05，表5）。

2.5 过表达Notch1信号使Ishikawa细胞存活率增加，增殖能力增强

与ov-NC的OD值（1.00±0.00）比较，ov-Notch1的OD值（2.75±0.51）显著升高（P<0.05）。

2.6 过表达Notch1信号使Ishikawa细胞迁移、侵袭能力增强

与ov-NC组比较，ov-Notch1组迁移和侵袭细胞数均显著增加（P<0.05，图2，表6）。

2.7 过表达Notch1信号使Ishikawa细胞系糖酵解功能增强

与ov-NC组比较，ov-Notch1组酵解容量和酵解储备显著升高（P<0.01或P<0.05，表7）。

3 讨论

AM是一种常见的严重影响女性身心健康及育龄期女性生育、伴有恶性侵袭性的妇科良性疾病^［24］。AM异位子宫内膜病灶的形成机制与子宫内膜异位症有一定的相似之处^{［25， 26］}，子宫内膜异位症病灶的形成与Notch1信号及糖酵解反应活跃增加相关；与正常的子宫内膜相比，异位子宫内膜病灶中Notch-1信号、糖酵解途径及其相关酶的表达均上调^［27-29］。

本研究结果发现，AM患者在位子宫内膜组织Notch1信号的mRNA和蛋白表达量均显著升高、葡萄糖消耗增加、乳酸水平升高，提示Notch1信号在AM在位内膜特异性表达，AM在位内膜的糖酵解功能异常。而在过表达Notch1信号后，Ishikawa细胞的存活率增加，细胞增殖、迁移和侵袭能力增强，细胞酵解容量和酵解储备升高，糖酵解功能增强。Ishikawa细胞这部分验证实验与Moriyama等^{［30， 31］}研究的结论是一致的，在缺氧的条件下，细胞的Notch1信号的表达增加，与此同时，细胞葡萄糖消耗加快、乳酸生成增加，这意味着在缺氧条件下，Notch1信号显著提高了糖酵解速率，促进了细胞增殖、分化、迁移和侵袭。本研究通过在位子宫内膜组织层面和Ishikawa细胞层面相互验证，证实了Notch1信号可能通过参与糖酵解过程，促进细胞增殖、迁移、侵袭和能量代谢变化，进而促进AM的发生和发展。

Notch1信号与葡萄糖摄取、糖酵解、乳酸到丙酮酸转化等过程的基因具有相关性^［18］，且正向调控糖酵解相关基因（如GLUT、PKM等）的表达^［32］。本研究收集并检测了AM患者在位子宫内膜组织糖酵解过程关键酶GLUT、PKM、PDHA和HK2的mRNA和蛋白表达，与正常对照组子宫内膜组织相比，AM组在位子宫内膜HK2和PDHA的mRNA和蛋白表达量均显著升高，GLUT1和PKM的蛋白表达量显著升高。其中，GLUT1负责细胞中葡萄糖的基础摄取和储存，催化葡萄糖分子进入糖酵解，HK2负责将细胞中葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，PDHA负责将糖类分解产生的丙酮酸转化为乙酰辅酶A，从而进入三羧酸循环以产生细胞能量，而PKM作为糖酵解的最后一步，则负责催化磷酸化磷酸基酯，将磷酸烯醇丙酮酸转化为丙酮酸，并产生ATP。GLUT1、HK2、PDHA和PKM都是糖酵解过程中的关键分子，参与细胞内的能量代谢，对调节细胞内糖代谢和能量平衡具有重要作用。

综上所述，AM在位子宫内膜存在Notch1信号的表达及糖酵解功能的异常，且Notch1信号的过表达可以增强Ishikawa细胞存活率、迁移、侵袭及糖酵解功能。Notch1信号对AM发生发展机制的介导，可能与Notch1信号对细胞的增殖、迁移、侵袭和糖酵解的调控相关。

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