血根碱通过调控Nrf2/NF-κB通路缓解小鼠溃疡性结肠炎

column:Sanguinarine alleviates ulcerative colitis in mice by regulating the Nrf2/NF-κB pathway

摘要

目的 探讨血根碱（SA）对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的溃疡性结肠炎（UC）的作用机制。 方法 随机将56只雄性C57BL/6小鼠分为空白对照组、模型组（DSS组）、SA低剂量组（DSS+SA-L，SA 1 mg/kg）、SA中剂量组（DSS+SA-M，SA 5 mg/kg）、SA高剂量组（DSS+SA-H，SA 10 mg/kg）、柳氮磺吡啶组（DSS+SASP，SASP 400 mg/kg）、SA高剂量组+Nrf2抑制剂ML385组（DSS+SA-H+ML385，SA 10 mg/kg+ML385 30 mg/kg），8只/组。除空白对照组外，均采用3.5%DSS诱导建立UC模型，SA干预组和柳氮磺吡啶组给与对应药物灌胃治疗，通路抑制剂组SA 10 mg/kg灌胃同时腹腔注射ML385 30 mg/kg。通过监测小鼠体质量变化、疾病活动指数（DAI）评分、结肠长度测量、HE染色评估小鼠炎症；检测结肠组织中活性氧（ROS）水平；比色法检测结肠组织中丙二醛含量（MDA）； RT-qPCR检测结肠组织中炎性因子；Western blotting法检测结肠组织中核因子E2相关因子2（Nrf2）、血红素加氧酶1（HO-1）、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap-1）、磷酸化p65蛋白（p-p65）、p65、紧密连接蛋白（occludin、ZO-1）蛋白表达。 结果 与DSS组相比，SA治疗可缓解DSS组小鼠体质量下降、结肠长度缩短、DAI评分升高（P<0.05）。HE染色显示，DSS组结肠腺体结构破坏，SA可明显改善结肠隐窝结构。RT-qPCR显示，SA干预组结肠组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平下降（P<0.05），ROS、MDA下降（P<0.05）。Western blotting结果显示，结肠组织中Nrf2、HO-1、occludin、ZO-1蛋白表达上升（P<0.05），Keap-1、p-p65蛋白表达下降（P<0.05），p65无明显变化（P>0.05），且DSS+SA-L、DSS+SA-M、DSS+SA-H组各指标变化呈剂量依赖性。Nrf2通路抑制剂ML385降低高剂量组SA对UC小鼠结肠黏膜的改善作用。 结论 SA可改善UC样小鼠肠炎，作用机制可能与激活Nrf2通路，抑制Nrf2介导的NF-κB通路有关。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of sanguinarine (SA) for alleviating ulcerative colitis (UC) induced by dextran sodium sulfate (DSS) in mice. Methods Male C57BL/6 mouse models of 3.5% DSS-induced UC were randomized for treatment with 1, 5 and 10 mg/kg SA by gavage, 400 mg/kg sulfasalazine by gavage, or 10 mg/kg SA combined with intraperitoneal injection of 30 mg/kg ML385 (a Nrf2 inhibitor). The changes in intestinal inflammation was assessed by monitoring weight changes, disease activity index (DAI) score, colon length measurement, and HE staining. After the treatments, the colon tissues were collected for detection of malondialdehyde (MDA) content using colorimetry, mRNA expressions of inflammatory factors using RT-qPCR, and the expressions of Nrf2, HO-1, Keap-1, p-p65, p65, occludin, and ZO-1 proteins were detected using Western blotting. Results SA treatment obviously alleviated weight loss, colon length shortening and DAI score increase and ameliorated structural destruction of the colon glands and colonic crypts in mice with DSS-induced UC. SA intervention significantly decreased the levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 mRNA and lowered ROS and MDA levels in the colon tissue of UC mice. The mouse models receiving SA treatment showed significantly increased expressions of Nrf2, HO-1, occludin and ZO-1 and lowered expressions of Keap-1 and P-P65 in the colon tissue without significant changes of p65 expression, and these changes were SA dose-dependent. Treatment with ML385 obviously attenuated the effect of high-dose SA for improving UC in the mouse models. Conclusion SA can improve UC-like enteritis in mice possibly by activating the Nrf2 pathway and inhibiting the NF-κB pathway in the colon tissue.

Graphical abstract

关键词

溃疡性结肠炎 / 血根碱 / Nrf2 / NF-κB

Key words

ulcerative colitis / sanguinarine / Nrf2 / nuclear factor-κB

溃疡性结肠炎是一种累及肠道的慢性炎症性疾病，发病机制复杂，病因不明，患者主要症状为反复腹痛、腹泻及粘液脓血便^{［1， 2］}。由于UC病因不易确定，发病机制复杂，因此探究其发病机制，寻找一种治疗UC的药物极为重要。UC发病机制虽尚不明确，但促炎细胞因子的产生增加和氧化应激发挥重要作用^［3］。研究认为核因子E2相关因子2（Nrf2）/核因子-kB（NF-κB）通路在UC的发生、发展和转归中扮演重要作用^{［4， 5］}。Nrf2和NF-κB分别是调控氧化应激和炎症反应的关键转录因子，Nrf2能维持细胞氧化还原的稳态，NF-κB激活后会产生大量促炎因子。药理学和遗传学研究表明，这两种途径之间存在一定串扰，Nrf2的缺失会导致NF-κB活性增加^［6］。SA具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用^［7］，最早用于抗感染治疗，并广泛用于畜牧业^［8］，研究显示SA可以缓解非甾体抗炎药引起的大鼠小肠炎症^［9］，通过增强血乳屏障，进而保护LPS刺激的小鼠乳腺炎^［10］，并可通过抑制NLRP3炎性体激活改善DSS诱导的小鼠UC^［11］。但目前关于SA和小鼠UC的研究报道较少，且其治疗小鼠UC的机制是否与Nrf2/NF-κB通路有关尚未有文献报道。本研究拟采用DSS诱导的UC小鼠模型，分析SA对UC的治疗作用及其作用机制，从而寻找一种更有效的治疗方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物

C57BL/6小鼠由河南斯克贝斯生物科技股份有限公司提供，6周龄，雄性，SPF级。本研究已通过蚌埠医科大学伦理委员会审核批准（伦理批号：2023-090号），实验动物的饲养及干预处理严格按照《实验动物管理条例》进行。

1.2 实验仪器及试剂

葡聚糖硫酸钠（DSS）（MeilunBio）；血根碱（MedChemexpress）；柳氮磺吡啶（MedChemexpress）；HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；兔抗小鼠Nrf2抗体、兔抗小鼠Keap-1、兔抗小鼠HO-1、兔抗小鼠NF-kBp65（武汉三鹰）；鼠抗小鼠p-p65（CST）、兔抗小鼠ZO-1（Servicebio）、鼠抗小鼠Occludin（武汉三鹰）、鼠抗小鼠GAPDH、山羊抗小鼠IgG二抗、 山羊抗兔IgG二抗（中杉金桥）；丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）（南京建成生物研究所）；小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6炎性因子的引物由安徽通用生物股份有限公司合成；RNA 提取试剂盒（Servicebio）；逆转录试剂盒、SYBR Green II 荧光定量PCR试剂盒（Servicebio）；BCA试剂盒（碧云天）；Nanodrop分子检测仪器（ALLSHENG）；实时定量聚合酶链反应（qPCR）仪（ABI）；酶标仪（BioTek）。

1.3 方法

1.3.1 建立UC小鼠模型及分组

根据预实验结果选用体质量18~20 g的C57BL/6小鼠进行造模。有文献^［12］报道血根碱对大鼠的毒性较低，口服LD₅₀值为1658 mg·kg^-1，静脉注射毒性为LD50值29 mg·kg^-1，且该课题组预实验曾使用100 mg·kg^-1作用于小鼠，小鼠生长未受影响；同时有文献^［13］报道血根碱可以治疗醋酸诱导的UC小鼠，其血根碱使用剂量选择1 mg·kg^-1、5 mg·kg^-1 、10 mg·kg^-1，因此为保障安全，本文参考此文献的使用剂量。

将小鼠分为空白对照组（Ctrl组，饮用双蒸水同时灌胃生理盐水）、模型组（DSS组，饮用3.5% DSS同时灌胃生理盐水）、 血根碱低剂量组（DSS+SA-L，饮用3.5%DSS同时灌胃SA 1 mg·kg^-1·d^-1）、血根碱中剂量组（DSS+SA-M，饮用3.5%DSS同时灌胃SA 5 mg·kg^-1·d^-1）、血根碱高剂量组（DSS+SA-H，饮用3.5%DSS同时灌胃SA 10 mg·kg^-1·d^-1）、阳性药物组（DSS+SASP，饮用3.5%DSS同时灌胃柳氮磺吡啶400 mg·kg^-1）、血根碱高剂量组+ML385组（DSS+SA-H+ML385，饮用3.5%DSS 灌胃SA10 mg·kg^-1同时给予腹腔注射ML385 30 mg·kg^-1）。造模前禁食24 h，后自由饮用3.5% DSS水溶液7 d，第2天分别开始灌胃给药，第8天全部更换为蒸馏水，期间每天监测和记录大鼠的体质量并检查大便稠度和直肠出血症状。

1.3.2 疾病活动指数（DAI）

基于体质量变化、大便性状和大便出血进行评分，DAI=（体质量+大便形状+出血情况）/3，分值范围为0~4分，评分越高表示炎症越重^［14］。第8天时颈椎脱臼法牺牲各组小鼠，分离结肠，PBS清洗干净后测量结肠长度，然后分成3份分别放入4%多聚甲醛和-80 ℃冰箱中保存。

1.3.3 HE染色

用PBS清洗好结肠后，4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋、切片，进行苏木精伊红染色，使用显微镜观察。

1.3.4 Western blotting检测

取结肠组织100 mg放入含有蛋白酶磷酸酶抑制剂的裂解液中，匀浆，离心收集上清液中的蛋白。用BCA法测定其浓度，加入蛋白上样缓冲液后，定量30 μg电泳，再将蛋白转移到PVDF膜上，后与Nrf2、HO-1、Keap-1、p-p65、p65、occludin、ZO-1和GAPDH的一抗孵育过夜（不超过18 h），TBST清洗，后与二抗孵育1~2 h曝光显影。最后使用Image J 软件分析各组小鼠蛋白表达水平。

1.3.5 RT-qPCR检测

使用RNA提取试剂盒提取结肠组织中的总RNA，然后用逆转录试剂盒逆转录成cDNA。以cDNA为模版进行RT-qPCR检测：PCR反应体系：2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL；Forward Primer（10 μmol/L） 0.4 μL；Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL；Template 2 μL；Nuclease-Free Water 7.2 μL。根据说明书设置反应条件如下：预变性95 ℃ 30 s 1循环；变性95 ℃ 15 s，退火65 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 30 s，共40个循环。反应结束后根据溶解曲线分析验证产物的特异性。结束后获得TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA的循环阈值（Ct），根据2^－△△Ct公式计算基因的相对表达量引物序列见表1。

1.3.6 活性氧（ROS）测定

按照厂家说明书，利用DCFH-DA荧光探针测定ROS的含量。使用眼科剪将结肠组织剪碎后加入酶消化30 min，再使用细胞筛网过滤，收集滤过的细胞，清洗后后加入DCFH-DA中，37 ℃孵育1 h，用流式细胞仪（美国BD ）进行流式细胞仪分析。

1.3.7 MDA测定

提取适量小鼠结肠组织匀浆，并用BCA法测蛋白浓度，按MDA试剂盒要求测定和计算MDA。MDA含量（nmol/mgprot）=（OD_测量-OD_对照）/（OD_标准-OD_空白）×标准品浓度（10 nmol/mL）/待测样本蛋白浓度。

1.4 统计学分析

采用GraphPad Prism 9软件进行统计学分析，每组试验至少重复3次，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较使用单因素方差分析，两组间比较采用 t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SA对DSS诱导的UC模型小鼠的保护作用

与DSS模型组相比，SA药物组和阳性药物SASP组小鼠体质量增加（图1A），DAI评分降低（图1B），结肠长度变长（图1C、D，P<0.05），且SA药物组具有良好的剂量依赖关系。

2.2 SA干预后各组小鼠结肠组织病理学改变

结果显示，对照组的结肠组织粘膜层、肌层未见异常，腺体结构排列有序；与对照组相比，DSS组小鼠结肠组织的隐窝结构消失，大量炎性细胞浸润。与DSS组相比，SA组、SASP组隐窝结构破坏减轻，炎性细胞浸润减少；SA-L、SA-M、SA-H组织损伤依次减轻（图2）。

2.3 SA干预保护DSS诱导的UC小鼠肠道屏障功能

Western blotting检测结果显示，与对照组相比，DSS组结肠组织中ZO-1、Occludin的蛋白表达水平降低（P<0.05），与DSS组比，SA各剂量组和阳性药物组的ZO-1、Occludin蛋白表达水平升高（P<0.05），且DSS+SA-L组、DSS+SA-M组、DSS+SA-H组蛋白表达依次升高，呈剂量依赖关系（图3）。

2.4 SA抑制DSS诱导的UC小鼠肠道炎症反应和氧化应激

RT-qPCR结果显示，与对照组比，DSS可升高结肠组织中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达（P<0.05），与DSS组比，SA和SASP抑制TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达（P<0.05，图4A~C）。此外，DSS处理的小鼠肠组织中的ROS、MDA升高，SASP和SA组均拮抗DSS的作用（P<0.05，图4D~F）。SA的作用呈剂量依赖关系。

2.5 SA对UC小鼠肠组织中NF-κBp65、p-p65、Keap-1、Nrf-2、HO-1蛋白表达的影响

Western blotting检测结果显示，与对照组相比，DSS组小鼠p-p65、Keap-1蛋白表达升高（P<0.05），Nrf2、HO-1蛋白表达降低（P<0.05）。与DSS组相比，SA和SASP则降低p-p65、Keap-1蛋白表达（P<0.05），升高Nrf2、HO-1蛋白表达（P<0.05），DSS+SA-M组、DSS+SA-H组呈剂量依赖关系，但SA-L组Nrf2、Keap-1、p-p65变化不明显（P>0.05）。SA对非磷酸化的p65无明显影响（P>0.05，图5）。

2.6 Nrf2特异性抑制剂ML385对Nrf2/NF-κB通路和肠道紧密连接蛋白的影响

Western blotting检测结果显示，与DSS组相比，DSS+SA-H组Nrf2、HO-1、ZO-1、Occludin蛋白表达升高，p-p65表达降低（P<0.05），但DSS+SA-H+ML385组可以逆转这些变化，表现为Nrf2、HO-1、ZO-1、Occludin蛋白表达低于DSS+SA-H组，但高于DSS组（P<0.05），p-p65蛋白表达高于DSS+SA-H组，低于DSS组（P<0.05），P65变化无统计学意义（P＞0.05，图6）。

2.7 ML385对DSS诱导的UC小鼠炎症因子水平、ROS和MDA影响

结果显示，与对照组相比，DSS组TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA、MDA、ROS表达水平升高（P<0.05）；与DSS组相比，SA-H降低了小鼠结肠中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的表达（P<0.05），同时降低了MDA、ROS水平（P<0.05）。ML385作用后TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA、MDA、ROS水平升高（P<0.05），但低于DSS组（P<0.05，图7）。

3 讨论

研究显示，氧化应激和促炎细胞因子增加在UC的发生发展中扮演重要作用^［15］。由于目前治疗药物的副作用大^［16］，UC患者的预期寿命较低，且患结肠切除术和结直肠癌的风险增加，因此寻找一种治疗UC的药物至关重要^［17］。本文通过体内试验证实SA通过激活Nrf2、抑制NF-κB通路，缓解肠屏障和发挥保护肠炎的作用。

中药因其整体性和安全性特征，对于UC具有良好的缓解作用，且具有低毒、价优等优势^{［18， 19］}。如黄连解毒汤可以通过抑制NF-κB通路，激活Nrf2通路，保护肠粘膜，从而缓解UC的症状^［5］；钩吻碱子可以通过调控Nrf2/NF-κB通路，保护肠屏障，从而减少LPS引起的氧化应激和炎症^［20］；原花青素A1通过激活AMPK通路抑制UC小鼠的mTOR信号通路从而缓解UC小鼠症状^［21］。对血根碱研究发现SA有抗菌、抗氧化 、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗血管生成、镇痛、改善肝功能和增强免疫力等多方面的生物学活性^{［22， 23］}，且血根碱可通过诱导细胞凋亡等多方面发挥抗炎抗氧化作用^［11］。有研究表明，SA可以通过调控Nrf2/NF-κB信号通路缓解消炎痛诱导的大鼠小肠损伤^［9］；SA调控TLR4/NF-κB通路抑制LPS诱导的H9c2心肌细胞炎症和凋亡^［24］等，但SA是否通过调控Nrf2/NF-κB通路，缓解DSS诱导的UC小鼠，尚未见报道。因此，现需开发这种生物碱用于治疗UC。

氧化应激与UC的发生发展密切相关，机体受到外界氧化应激刺激时，ROS、MDA升高，导致 DNA 损伤、蛋白质氧化和脂质过氧化，最终导致肠道组织损伤，削弱免疫系统，并引发一系列严重的病变^［25］。本研究结果显示，模型组UC小鼠体质量下降、便血，结肠长度变短，局部结肠组织出现糜烂、溃疡、水肿和腺体结构的破坏，同时DAI评分升高，ROS、MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平升高，阳性药物组及SA组较模型组有明显改善且降低ROS、MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平。上述结果表明SA对UC样结肠炎具有改善作用，表明其机制与降低氧化应激、炎症反应有关。UC患者常伴有肠屏障功能受损，且肠屏障结构和功能障碍与肠炎密切相关^［26］。本研究证实了SA可促进ZO-1和occludin的表达，表明SA具有抗肠炎和保护肠屏障的作用，但具体机制不详，有待进一步探索。

尽管UC发病机制不详，但许多研究认为Nrf2/NF-κB在UC的发生发展中占有重要的作用^［27-29］。Nrf2是一种重要的转录调节因子，生理情况下，其与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap-1）结合，被Cul3-E3连接酶泛素化，最后被蛋白酶体降解维持在一定水平。当机体受到氧化应激、炎症等刺激时，Keap-1与Nrf2解偶联，Nrf2活化从细胞质中转位进入细胞核，与ARE结合并激活下游抗氧化基因表达，诱导Ⅱ相解毒酶（如HO-1、NQO1）的产生，从而维持机体的氧化还原平衡^［30］。有研究表明，UC的发生发展与Nrf2密切相关^［31］。NF-κB是一种核转录调节因子，参与炎症、细胞凋亡、免疫反应等多种过程^［32］。NF-κB家族有5种成员，分别是RelA/p65、c-Rel、RelB、p50和p52。它们可以形成各种异源二聚体或者同源二聚体，如常见的p50和p65组成的异源二聚体，在外界刺激时，IkB激酶（IKK）被激活，后IkB磷酸化，导致NF-κB的释放和核移位，在核内，与特定的DNA序列结合，编码产生大量炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α等），从而促进炎症^［33］。有研究显示Nrf2和NF-κB通路间存在一定串扰，可能共同促进炎症反应^［34］，激活Nrf2信号通路可以抑制NF-κB通路，Nrf2缺陷的小鼠表现出NF-κB异常激活^［35］，因此，我们推测血根碱可以通过调节Nrf2/NF-κB通路缓解小鼠的UC。本研究DSS诱导的UC小鼠模型组，与空白对照组比，Nrf2、HO-1蛋白表达显著下降，Keap-1、p-p65升高，p65无明显变化，SA可以逆转这些改变，表明血根碱可以通过调控Nrf2/NF‑κB通路而缓解UC样小鼠肠炎。为验证Nrf2具有关键作用，我们选择了Nrf2特异性抑制剂ML385^［36］，结果显示ML385干预后，SA的治疗作用被逆转，表现在Nrf2、HO-1蛋白表达较DSS+SA-H组下降，p-p65较DSS+SA-H组增加；RT-qPCR显示ML385干预后TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平较DSS+SA-H升高，MDA、ROS出现同样的变化，但较DSS组有改善。此外，SA改善肠屏障紧密连接蛋白指标ZO-1和occludin的蛋白表达，被ML385逆转。该结果表明，抑制Nrf2的激活可以阻断SA对UC的保护作用，SA可以通过调节Nrf2和Nrf2介导NF-κB通路改善DSS诱导的UC样小鼠肠炎。以上结果显示，SA可以通过抑制氧化应激和炎症，保护肠屏障，而达到保护UC的作用。

本研究不仅扩充了SA抗炎、抗氧化的机制，且扩大了该药物的治疗范围，为今后UC的临床治疗提供了重要参考价值。但本研究存在一些不足：研究虽发现SA可以通过Nrf2/NF-κB通路对小鼠UC模型发挥保护作用，但是否可以通过其他途径发挥作用尚未可知。此外，血根碱虽然低毒，小鼠使用的范围是安全范围，但今后用于临床是否有不良反应，也需进一步探讨。

综上所述，SA可能通过激活Nrf2信号通路，并抑制Nrf2介导的NF-κB通路，从而缓解UC样小鼠肠炎。本研究为UC的治疗提供了新的见解，SA可能是治疗UC的潜在药物。

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基金资助

安徽省高等学校科学研究项目（自然科学类）重大项目(2022AH051489)

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