清肾颗粒通过调控外泌体、miR-330-3p以及CREBBP表达抑制小鼠肾纤维化

摘要

目的 探讨清肾颗粒对腺嘌呤诱导的肾纤维化小鼠模型及尿酸刺激下NRK-49F细胞的作用及其调控外泌体、miR-330-3p和CREBBP的机制。方法 动物实验：构建腺嘌呤诱导的肾纤维化小鼠模型，分为正常组、模型组和清肾颗粒组（8.0 g·kg-1·d-1）,6只/组，灌胃12周。采用尾静脉注射腺相关病毒载体，实验结束后收集双侧肾组织。观察小鼠肾组织外泌体标记蛋白CD9,Hsp70,TSG101蛋白水平变化；Western blotting及免疫荧光检测小鼠肾组织Col-III、α-SMA、FN和E-cad表达变化；HE和Masson染色观察小鼠肾组织病理学变化。细胞实验：构建尿酸刺激下的NRK-49F细胞模型（尿酸400μmol/L,SD大鼠灌胃制备清肾颗粒含药血清用于细胞实验，分为正常组、模型组和清肾颗粒含药血清组。观察NRK-49F细胞中外泌体标记蛋白CD9,Hsp70,TSG101蛋白水平变化；Western blotting及免疫荧光检测NRK-49F细胞中Col-III、α-SMA、FN和E-cad表达变化；双荧光素酶报告基因检测miR-330-3p与CREBBP靶向关系；RT-qPCR和Western blotting检测NRK-49F细胞中miR-330-3p与CREBBP表达变化。结果 动物实验中，Western blotting结果显示，与正常组相比，模型组CD9、Hsp70、TSG101蛋白水平升高（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒组CD9、Hsp70、TSG101蛋白水平降低（P<0.05）。Western blotting及免疫荧光结果显示，与正常组相比，模型组Col-III、α-SMA、FN表达增加，E-cad表达减少（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒组Col-III、α-SMA、FN表达减少，E-cad表达增加（P<0.05）。肾脏病理检查显示，清肾颗粒可以明显减轻小鼠肾组织纤维化（P<0.05）。RT-qPCR结果显示，尾静脉注射腺相关病毒病毒载体抑制miR-330-3p表达，增加CREBBP水平，减轻肾纤维化（P<0.05）。双荧光素酶报告基因结果显示，CREBBP是miR-330-3p的靶点（P<0.05）。RT-qPCR和Western blotting结果显示，与正常组相比，模型组miR-330-3p表达增加，CREBBP表达减少（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒组miR-330-3p表达减少，CREBBP表达增加（P<0.05）。细胞实验结果与动物实验结果趋势一致。结论 清肾颗粒通过干预外泌体，降低miR-330-3p水平，增加CREBBP表达抑制肾纤维化。

关键词

清肾颗粒 / 外泌体 / miR-330-3p / 肾纤维化