清肾颗粒通过调控外泌体、miR-330-3p以及CREBBP表达抑制小鼠肾纤维化

Qingshen Granules alleviates renal fibrosis in mice by regulating exosomes, miR-330-3p, and CREBBP expression

摘要

目的 探讨清肾颗粒对腺嘌呤诱导的肾纤维化小鼠模型及尿酸刺激下NRK-49F细胞的作用及其调控外泌体、miR-330-3p和CREBBP的机制。 方法 动物实验：构建腺嘌呤诱导的肾纤维化小鼠模型，分为正常组、模型组和清肾颗粒组（8.0 g·kg^-1·d^-1），6只/组，灌胃12周。采用尾静脉注射腺相关病毒载体，实验结束后收集双侧肾组织。观察小鼠肾组织外泌体标记蛋白CD9，Hsp70，TSG101蛋白水平变化；Western blotting及免疫荧光检测小鼠肾组织Col-III、α-SMA、FN和E-cad表达变化；HE和Masson染色观察小鼠肾组织病理学变化。细胞实验：构建尿酸刺激下的NRK-49F细胞模型（尿酸400 μmol/L，SD大鼠灌胃制备清肾颗粒含药血清用于细胞实验，分为正常组、模型组和清肾颗粒含药血清组。观察NRK-49F细胞中外泌体标记蛋白CD9，Hsp70，TSG101蛋白水平变化；Western blotting及免疫荧光检测NRK-49F细胞中Col-III、α-SMA、FN和E-cad表达变化；双荧光素酶报告基因检测miR-330-3p与CREBBP靶向关系；RT-qPCR和Western blotting检测NRK-49F细胞中miR-330-3p与CREBBP表达变化。 结果 动物实验中，Western blotting结果显示，与正常组相比，模型组CD9、Hsp70、TSG101蛋白水平升高（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒组CD9、Hsp70、TSG101蛋白水平降低（P<0.05）。Western blotting及免疫荧光结果显示，与正常组相比，模型组Col-III、α-SMA、FN表达增加，E-cad表达减少（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒组Col-III、α-SMA、FN表达减少，E-cad表达增加（P<0.05）。肾脏病理检查显示，清肾颗粒可以明显减轻小鼠肾组织纤维化（P<0.05）。RT-qPCR结果显示，尾静脉注射腺相关病毒病毒载体抑制miR-330-3p表达，增加CREBBP水平，减轻肾纤维化（P<0.05）。双荧光素酶报告基因结果显示，CREBBP是miR-330-3p的靶点（P<0.05）。RT-qPCR和Western blotting结果显示，与正常组相比，模型组miR-330-3p表达增加，CREBBP表达减少（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒组miR-330-3p表达减少，CREBBP表达增加（P<0.05）。细胞实验结果与动物实验结果趋势一致。 结论 清肾颗粒通过干预外泌体，降低miR-330-3p水平，增加CREBBP表达抑制肾纤维化。

Abstract

Objective To explore the effects of Qingshen Granules (QSG) on adenine-induced renal fibrosis in mice and in uric acid (UA)-stimulated NRK-49F cells and its mechanism for regulating exosomes, miR-330-3p and CREBBP. Methods A mouse model of adenine-induced renal fibrosis were treated daily with QSG at 8.0 g·kg^-1·d^-1via gavage for 12 weeks. An adeno-associated virus vector was injected into the tail vein, and renal tissues of the mice were collected for analyzing exosomal marker proteins CD9, Hsp70, and TSG101 and expressions of Col-III, α‑SMA, FN, and E-cad using Western blotting and immunofluorescence and for observing pathological changes using HE and Masson staining. In the cell experiment, NRK-49F cells were stimulated with uric acid (400 μmol/L) followed by treatment with QSG-medicated serum from SD rats, and the changes in expressions of the exosomal markers and Col-III, α-SMA, FN, and E-cad were analyzed. Dual luciferase reporter assay was employed to examine the targeting relationship between miR-330-3p and CREBBP, whose expressions were detected by RT-qPCR and Western blotting in treated NRK-49F cells. Results The mouse models of adenine-induced renal fibrosis showed significantly increased levels of CD9, Hsp70, and TSG101, which were decreased by treatment with QSG. The expressions of Col-III, α‑SMA, and FN increased and E-cad decreased in the mouse models but these changes were reversed by QSG treatment. QSG treatment obviously alleviated renal fibrosis in the mouse models. Intravenous injection of adeno-associated viral vector obviously inhibited miR-330-3p, increased CREBBP levels, and reduced fibrosis in the mouse models. Dual luciferase assay confirmed CREBBP as a target of miR-330-3p, which was consistent with the results of the cell experiments. Conclusion QSG inhibits renal fibrosis in mice by regulating the exosomes, reducing miR-330-3p levels, and increasing CREBBP expression.

Graphical abstract

关键词

清肾颗粒 / 外泌体 / miR-330-3p / 肾纤维化

Key words

Qingshen Granules / exosomes / miR-330-3p / renal fibrosis

慢性肾脏病（CKD）的全球患病率达到9.1%^［1］。在我国成年人群体中，CKD的患病率为8.2%^［2］。CKD最终发展为终末期肾病（ESRD），肾纤维化是多种CKD进展到ESRD的主要病理特征^［3］。外泌体是多种活细胞分泌的胞外囊泡，它们包含有生物活性的脂质、蛋白质、核酸，如lncRNA、miRNA和DNA片段，可以反映细胞、组织和生物体的状况，因此成为纤维化疾病潜在的生物标志物^［4］。MiRNAs是一个短的、非编码的单链RNA分子家族，长度约22个核苷酸，可介导细胞外基质的形成和降解，调控肾纤维化的信号通路，影响肾纤维化的发生^［5］。miR-330-3p的研究领域主要在肿瘤领域，但是其主要病理生理作用集中在细胞的转分化、迁移、凋亡等方面^［6］。CREBBP基因在许多生理病理过程中发挥着重要的作用，包括转录、分化和细胞凋亡。CREBBP参与心脏、肝脏以及肺组织纤维化过程^［7-9］。目前，在肾纤维化领域尚无miR-330-3p、CREBBP相关研究的报道。针对外泌体、miR-330-3p及CREBBP的干预措施可能有望成为缓解CKD肾纤维化的治疗途径。

在CKD的发生和发展过程中，湿热与瘀血被认为是CKD持续进展的核心。前期研究发现，具有清热化湿祛瘀功效的清肾颗粒有延缓肾纤维化作用。临床研究中，清肾颗粒在治疗CKD湿热证患者方面具有显著的有效性及安全性^{［10， 11］}。实验研究中，清肾颗粒能够通过调节单侧输尿管梗阻大鼠肾脏组织和高糖环境下HK-2细胞的氧化应激及炎症反应，有效减缓肾小管损害以及EMT的过程^［12］。清肾颗粒含药血清通过miR-23b-5p介导的Nrf2通路激活减少NRK-52E细胞转分化^［13］。然而，清肾颗粒是否能够通过干预外泌体，调控miR-330-3p、CREBBP水平发挥延缓肾纤维化作用尚不清楚。因此，本研究通过构建体外和体内实验，探究清肾颗粒通过干预外泌体对肾纤维化的影响及其对miR-330-3p、CREBBP的作用，为中医药防治肾纤维化提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

1.1.1 实验动物

C57BL/6J小鼠体质量20~25 g，SPF级雄性SD大鼠体质量180~220 g，均购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，生产许可证：SCXK（苏）2023-0009。动物实验方案经安徽中医药大学动物伦理委员会批准（AHUCM-rats-2019003）。

1.1.2 实验细胞

正常大鼠成纤维细胞（NRK-49F，武汉塞维尔生物科技有限公司）。

1.1.3 药物

清肾颗粒，10 g/包，生产厂家：安徽中医药大学第一附属医院制剂室，皖药制字：BZ20080011，批号：20210215，由茵陈、丹参、大黄、白花蛇舌草、白术、猪苓、茯苓、白蔻仁、扁豆、薏苡仁、泽泻、黄连、益母草、车前草组成。

1.1.4 主要试剂

Masson三色染色液（ebiogo），苏木素染液（ebiogo），醇溶伊红染液（ebiogo），山羊抗兔IgG（Zsbio），山羊抗小鼠IgG（Zsbio），RIPA细胞裂解液（强）（Beyotime），NovoStart SYBR High-Sensitivity qPCR SuperMix（Novoprotein），CD9（Santa Cruz），HSP70（bioss），TSG101（Proteintech），α‑SMA（bioss），E-cadherin（Santa Cruz），Fibronectin（bioss），Collagen III（bioss），CREBBP（Zsbio），GAPDH（Life technogies）。

1.1.5 主要仪器

台式高速离心机（郑州宏华仪器有限公司），生物组织包埋机（湖北亚光），病理切片仪（Leica），荧光定量PCR仪（ABI），显微镜（OLYMPUS）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模

C57BL/6J小鼠随机分为对照组（Sham组）、模型组（Model组）和清肾颗粒组（Model+QSG组），6只/组^［14］，Model组和Model +QSG组均采用腺嘌呤诱导构建肾纤维化模型。将8周龄C57BL/6J小鼠置于标准笼内，常温（21~22 ℃）、恒湿（40%~50%），光照周期为12 h。在研究开始前，所有小鼠喂养1周适应动物设施条件。肾纤维化模型小鼠喂养0.2%腺嘌呤与AIN-93M（Research Diets, Inc., New Brunswick）混合饲料，对照组给予正常AIN-93M饲料，喂养8周。实验结束，收集肾脏组织进行检测分析。所有动物实验结束后，动物尸体放置于医疗垃圾袋，送至安徽中医药大学科研实验中心统一处理。

腺相关病毒体内干预模型的制备：HEK293T细胞培养在10 cm的细胞培养平皿中，用DMEM（10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素）培养。用100 mL聚乙烯亚胺（1 mg/mL，Kingmorn）转染10 mg miR-330-3p敲除质粒（或对照质粒）、10 mg pAAV9（General Biosystems 5）和10 mg pAd Delta F6（丰辉生物科技有限公司）。上清液中的AAV9病毒通过PEG8000沉淀获得。细胞中的病毒用重复冻融法获得。用1 mol/L MgCl₂和苯佐酶核酸酶（EMD Millipore Core）孵育后，用碘克沙醇（Sigma）进行密度梯度离心纯化AAV9病毒。纯化的AAV9病毒浓缩在浓缩管（Amicon Ultra-15， Millipore）中。为了检测病毒滴度，使用TIANamp Genomic DNA试剂盒（天源公司）提取基因组病毒DNA。每只小鼠尾静脉注射1×10¹² GC剂量的AAV9病毒。根据成熟miR-330-3p（GCAAAGCACAGGGCCT ATACAC）序列，设计了以下序列来敲除miR-330-3p和pENN.AAV.cTNT.质粒（通用生物系统公司）。携带针对miR-330-3p的shRNA的血清型9 AAV载体（AAV9）来自汉恒生物技术公司（上海）。每只小鼠尾静脉注射50 µL（2×10¹² vg/mL）携带针对miR-330-3p的shRNA的AAV9或对照载体。

1.2.2 含药血清制备

将20只大鼠随机分为药物组和空白组，10只/组^［13］。药物组大鼠给予清肾颗粒8 g·kg^-1·d^-1灌胃，1次/d，连续给药10 d后处死动物，腹主动脉无菌采血，常温静置2 h后，离心后得到含药血清，混匀后过滤除菌，56 ℃，30 min水浴灭活，置-20 ℃保存备用。空白组动物给予等量生理盐水灌胃，并按上法制备大鼠空白血清。

1.2.3 细胞上清中外泌体的提取及纯化

用无外泌体的FBS培养，待细胞融合达70%~80%，换无血清培养基继续培养24 h同步化。将NRK-49F细胞分为正常组和尿酸刺激组（400 μmol/L），培养48 h，分别收集两组上清液，离心获取沉淀（即外泌体），以适量PBS重悬，-80 ℃保存。

1.2.4 HE和Masson染色

肾脏组织标本经常规固定、包埋，制成厚度2 μm的组织切片，行HE、Masson染色。

1.2.5 Western blotting法检测肾组织和细胞中相关蛋白

收集各组细胞，用RIPA裂解液提取总蛋白并测量蛋白浓度。分离总蛋白，电泳并转膜。封闭2 h，TBST洗膜，加入一抗孵育（CD9 1∶500，Hsp70 1∶1000，TSG101 1∶3000，Fibronectin 1∶1000，α-SMA 1∶2000，Collagen III 1∶1000，E-cadherin 1∶500，GAPDH 1∶1000），4 ℃过夜，然后加入二抗孵育1 h后洗膜。使用ECL发光试剂盒来检测蛋白。使用ImageJ软件以目标蛋白与内参照GAPDH的灰度值比值做统计分析。

1.2.6 RT-qPCR检测肾组织和细胞中miR-330-3p和CREBBP

用TRIzol、三氯甲烷、异丙醇提取细胞总RNA，根据试剂盒操作说明将RNA反转录成cDNA，SYBR Green法进行反应，检测miR-330-3p、CREBBP的mRNA表达。引物序列（5'→3'）：miR-330-3p GCAAAGCACACGGCCTAA；CERBBPGTGAAGAT GGCCGAGAACTT。采用2^-△△Ct法分析相对表达量。

1.2.7 免疫荧光双染

将肾组织样本石蜡包埋、切成薄片，脱蜡、水化，柠檬酸缓冲液中加热，滴加3%的H₂O₂孵育15 min，血清37 ℃封闭30 min，分别滴加一抗，4 ℃孵育过夜；滴加荧光二抗（1∶800），避光37 ℃孵育1 h，DAPI复染10 min后，滴加防荧光淬灭剂封片，利用荧光显微镜进行拍照。

1.2.8 双荧光素酶报告基因

为了构建含目标片段的报告基因质粒，该质粒被插入荧光素酶表达载体并成功转染至NRK-49F细胞，同时与phRL-TK（内参）共转染。在测定荧光素酶活性时，首先制备并保存Firefly luciferase底物LAR II，然后裂解细胞，并配制Renilla luciferase底物Stop&Glo以终止LAR II反应。通过荧光值测定，分别读取两种荧光素酶的活性值，并计算其比值，得出不同处理组相对于对照组的相对荧光素酶活性。

1.2.9 统计学方法

所有数据均采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，计量资料均符合正态分布，以均数±标准差表示。若方差齐，组间比较采用t检验；若方差不齐，则采用非参数检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 清肾颗粒可以减轻肾纤维化小鼠肾组织外泌体分泌

Western blotting结果显示，与正常组相比，模型组CD9、Hsp70、TSG101蛋白表达明显升高（P<0.05）。而与模型组相比，清肾颗粒组CD9、Hsp70、TSG101蛋白表达明显降低（P<0.05，图1A、B）。

2.2 清肾颗粒对小鼠肾纤维化的影响

Western blotting结果显示，与正常组相比，模型组Col-III、α-SMA、FN蛋白表达升高，E-cad蛋白表达降低（P<0.05）。与Model组相比，清肾颗粒组Col-III、α-SMA、FN蛋白表达降低，E-cad蛋白表达升高（P<0.05，图2A、B）。免疫荧光结果显示，与正常组相比，模型组Col-III、 α-SMA、FN平均荧光强度增加，E-cad减少（P<0.05）。与模型组相比，清肾颗粒组Col-III、α-SMA、FN平均荧光强度减少，E-cad增加（P<0.05，图2C、D）。HE染色结果显示，与正常组相比，模型组小鼠肾组织表现出肾小管上皮脱落、空泡变性、部分管腔扩张。Masson染色结果显示，与正常组相比，模型组大鼠的肾脏病理出现明显的纤维化增生。清肾颗粒干预后显著改善这些病理变化（P<0.05，图2E、F）。

2.3 抑制miR-330-3p表达，减轻肾纤维化

Western blotting结果显示，与正常组相比，模型组Col-III、α-SMA、FN蛋白表达升高，E-cad蛋白表达降低（P<0.05）。经过AAV-miR-330-3p病毒干预后，Col-III、α‑SMA、FN表达降低，E-cad表达升高（P<0.05，图3A~E）。免疫荧光结果显示，与正常组相比，模型组Col-III、α-SMA、FN平均荧光强度增加，E-cad减少（P<0.05）。经过AAV-miR-330-3p病毒干预后，Col-III、α-SMA、FN平均荧光强度减少，E-cad增加（P<0.05，图3F、G）。

2.4 抑制miR-330-3p，CREBBP表达增加

Western blotting结果显示，与正常组相比，模型组CREBBP蛋白表达降低（P<0.05）。经过AAV-miR-330-3p病毒干预后，CREBBP表达增加（P<0.05，图4A、B）。RT-qPCR结果显示，与正常组相比，模型组CREBBP mRNA表达降低（P<0.05）。经过AAV-miR-330-3p病毒干预后，CREBBP mRNA表达增加（P<0.05，图4C）。

2.5 CREBBP是miR-330-3p的靶点

TargetScan软件预测CREBBP基因的3'端非翻译区（3' UTR）是miR-330-3p的保守结合位点（图5A）。miR-330-3p mimics与CREBBP-WT转染到NRK-49F细胞后，与NC组相比，miR-330-3p mimics抑制了CREBBP-miR-330-3p转染细胞中的荧光素酶活性（P<0.05，图5B）。

2.6 清肾颗粒抑制小鼠肾组织miR-330-3p表达，增加CREBBP水平减轻肾纤维化

RT-qPCR结果显示，与正常组相比，模型组miR-330-3p表达增加（P<0.05），清肾颗粒干预后降低肾组织miR-330-3p表达（P<0.05，图6A）。同时，与正常组相比，模型组小鼠肾组织CERBBP mRNA表达降低（P<0.05），而清肾颗粒干预显著增加CREBBP mRNA表达（P<0.05，图6B）。Western blotting结果显示，与正常组相比，模型组CREBBP蛋白表达降低（P<0.05），清肾颗粒干预后增加肾组织CREBBP蛋白表达（P<0.05，图6C、D）。

2.7 清肾颗粒含药血清可以减轻尿酸刺激下NRK-49F细胞外泌体分泌

Western blotting结果显示，与正常组相比，模型组CD9、Hsp70、TSG101蛋白表达明显升高（P<0.05）。而与模型组相比，清肾颗粒含药血清组CD9、Hsp70、TSG101蛋白表达明显降低（P<0.05，图7A、B）。

2.8 清肾颗粒含药血清对NRK-49F细胞活化的影响

Western blotting结果显示，与正常组相比，模型组Col-III、α-SMA、FN蛋白表达升高，E-cad蛋白表达降低（P<0.05）。与模型组相比，清肾颗粒含药血清组Col-III、α-SMA、FN蛋白表达降低，E-cad蛋白表达升高（P<0.05，图8A、B）。免疫荧光结果显示，与正常组相比，模型组Col-III、α-SMA、FN平均荧光强度增加，E-cad减少（P<0.05）。与模型组相比，清肾颗粒含药血清组Col-III、α-SMA、FN平均荧光强度减少，E-cad增加（P<0.05，图8C、D）。

2.9 清肾颗粒含药血清降低miR-330-3p表达，增加CREBBP水平抑制NRK-49F细胞活化

RT-qPCR结果显示，与正常组相比，模型组miR-330-3p表达增加（P<0.05），清肾颗粒含药血清干预后降低miR-330-3p表达（P<0.05，图9A）。同时，与正常组相比，模型组CERBBP mRNA表达降低（P<0.05），而清肾颗粒含药血清干预显著增加CREBBP mRNA表达（P<0.05，图9B）。Western blotting结果显示，与正常组相比，模型组CREBBP蛋白表达降低（P<0.05），清肾颗粒含药血清干预后增加CREBBP蛋白表达（P<0.05，图9C、D）。

3 讨论

肾纤维化是一种进行性的病理状态，肾纤维化中ECM的积累导致肾小球硬化和肾小管间质损伤，常伴有免疫和炎症反应，最终导致ESRD。因此，预防或延缓肾纤维化进展，是有效治疗CKD的措施^［3］。本研究通过构建体外和体内实验，证实清肾颗粒通过抑制外泌体分泌，降低miR-330-3p水平，增加CREBBP表达，发挥减轻肾纤维化的作用，为中医药治疗肾纤维化提供科学依据。

外泌体可以由多种细胞释放，通过传递多种分子，在肾纤维化进展中有着极其重要的作用^［15］。有研究显示，外泌体介导的OPN/CD44轴激活在肾纤维化过程中起着关键作用^［16］。还有研究表明肾小管来源的外泌体通过穿梭TNFAIP8阻断p53信号传导，在肾纤维化过程中控制成纤维细胞数量方面发挥着关键作用^［17］。本研究发现清肾颗粒抑制小鼠肾组织外泌体分泌，减轻肾纤维化，清肾颗粒含药血清能够可以减轻尿酸刺激下NRK-49F细胞外泌体分泌，说明外泌体对肾纤维化调节有着至关重要的作用，抑制外泌体分泌能够发挥肾保护作用。

外泌体作为细胞间重要的通讯载体，其所携带的miRNAs对靶器官或者细胞的干预是其参与纤维化过程的重要作用机制之一^［18］。通过调控miRNAs的表达，可能为肾脏纤维化的干预治疗提供新的有效途径^［19］。目前相关miR-330-3p的研究主要集中于肿瘤领域，在非小细胞肺癌中，miR-330-3p通过GRIA3激活MAPK/ERK信号通路，促进细胞侵袭和转移^［20］，后续研究明确在非小细胞肺癌中，miR-330-3p通过GRIA3促进脑转移和上皮-间质转化^［21］。CircRNA_0078767通过海绵化miR-330-3p增加CDK14表达，促进骨肉瘤进展^［22］。除此之外，近期在上皮细胞损伤、炎症、成纤维细胞的增殖及侵袭的研究同样发现了miR-330-3p的调节作用^{［23， 24］}。因此，虽然miR-330-3p的研究主要在肿瘤领域，但是其主要病理生理作用集中在细胞的转分化、迁移、凋亡、上皮细胞损伤和成纤维细胞增殖等方面，而肾纤维化过程中必然要经历肾脏固有细胞的损伤和成纤维细胞的增殖、侵袭。目前在肾纤维化研究领域尚无miR-330-3p相关研究的报道。本研究发现，采用尾静脉注射腺相关病毒载体抑制miR-330-3p表达能够减轻肾纤维化，并且通过生物信息学预测及双荧光素酶报告基因验证，CREBBP为miR-330-3p下游靶点。CREBBP 在许多生物和生理过程中发挥着重要的作用，包括转录、分化和细胞凋亡^［25］。在缺血再灌注肺损伤研究中，ZFP36通过CREBBP/p53/p21/Bax途径保护肺免受I/R诱导的损伤和纤维化^［7］。在肝纤维化中，CCl4诱导的肝纤维化鼠的原代肝星状细胞和肝组织中circCREBBP显著下调，circCREBBP对hsa-miR-1291海绵吸附下降可能是肝纤维化进展的主要因素^［8］。在心脏纤维化中，上调的miR‑330‑3p通过靶向CREBBP促进二叶主动脉瓣钙化^［9］。在不同组织的纤维化过程中均有CREBBP参与，并且具有明确的纤维化干预靶点，但目前CREBBP在肾纤维化发生发展中的作用未见研究报道。本研究发现清肾颗粒能够抑制miR-330-3p表达，增加CREBBP水平，发挥延缓肾纤维化作用。

综上，清肾颗粒能够减轻肾纤维化，其涉及的机制可能与抑制外泌体分泌，降低miR-330-3p水平，增加CREBBP表达有关。本项研究为清肾颗粒在治疗CKD患者中的应用提供了新的理论支持，为中医药预防和治疗肾脏疾病提供新的思路和方法。

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