睡眠性状与特发性正常压力脑积水的因果关联：一项两样本双向孟德尔随机化研究

Causal relationship between sleep phenotype and idiopathic normal pressure hydrocephalus: a two-sample bidirectional Mendelian randomization study

摘要

目的 利用双向孟德尔随机化研究方法探索睡眠性状与特发性正常压力脑积水之间的因果关系。 方法 采用GWAS catalog、芬兰公共数据库和MRCIEU GWAS数据库中8种睡眠性状的全基因组关联分析数据作为暴露，芬兰公共数据库中特发性正常压力脑积水（iNPH）的全基因组关联分析数据作为结局，使用逆方差加权法（IVW）作为主分析方法来评估睡眠性状与特发性正常压力脑积水之间的因果关系。敏感性分析方法采用Cochrane Q检验进行异质性检验和采用MR Egger‑intercept检验来检测潜在的水平多效性。同时，进行反向孟德尔随机化分析特发性正常压力脑积水与睡眠性状的因果关联。 结果 主分析方法IVW法显示经常白天小睡会增加iNPH的发病风险（OR=3.3393，95 CI%：1.0646-10.4742，P=0.0270）。Cochrane Q检验显示结果无潜在的异质性、MR Egger‑intercept检验显示结果无水平多效性（P>0.05）。外部验证复现了这一结果（OR=2.5660，95 CI%：1.1680-5.6373，P=0.0189）、（OR=4.0424，95 CI%：1.5709-10.4024，P=0.0038）。反向MR分析提示罹患iNPH不会影响睡眠性状。 结论 白天小睡的频率和特发性正常压力脑积水存在因果关联，对于老年人群，减少每周白天小睡的频率有助于降低iNPH的发生风险。

Abstract

Objective To explore the causal relationship between sleep phenotype and idiopathic normal pressure hydrocephalus (iNPH) using two-sample bidirectional Mendelian randomization. Methods The exposure data including 8 sleep phenotypes used in this study were obtained from GWAS catalog, FinnGenR10 and MRCIEU GWAS. The outcome data for idiopathic normal-pressure hydrocephalus were obtained from FinnGen R10. We used the inverse-variance weighted (IVW) method to perform the principal analyses. Cochrane Q-statistics test was used to assess the heterogeneity and MR Egger‑intercept test performed to evaluate the pleiotropy for sensitivity analyses. Results IVW result showed that frequent daytime nap was associated with higher odds of iNPH (OR=3.3393, 95 CI%: 1.0646-10.4742, P=0.0270). Cochrane Q-statistics test and MR Egger‑intercept test showed that the MR analysis had no pleiotropy or heterogeneity (P>0.05). The external validation reproduced this result (OR=2.5660, 95 CI%: 1.1680-5.6373, P=0.0189; OR=4.0424, 95 CI%: 1.5709-10.4024, P=0.0038). Reverse Mendelian randomization suggested that iNPH did not have significant impact on sleep phenotype. Conclusion The frequency of daytime naps is causally associated with iNPH, and reducing the frequency of weekly daytime naps can reduce the risk of iNPH in the elderly population.

Graphical abstract

关键词

孟德尔随机化研究 / 睡眠性状 / 特发性正常压力脑积水 / 白天小睡

Key words

Mendelian randomization / sleep phenotype / idiopathic normal pressure hydrocephalus / day nap

正常压力脑积水（NPH）是一种脑室病理性扩大而腰椎穿刺测得的脑脊液压力正常的疾病，典型的临床表现为痴呆、步态障碍和尿失禁三联征^［1］。NPH分为病因不明的特发性正常压力脑积水（iNPH）和继发于脑出血、创伤等明确病因的继发性正常压力脑积水。iNPH主要发生于60岁以上老年人，并且患病率随着年龄增长而增加^{［2， 3］}。国外一项人群研究提示iNPH患病率从70~79岁的0.2%增加到80岁以上的6%^［2］。上海地区的一项横断面调查发现国内65~84岁老年人iNPH的患病率为1.8%^［3］。随着老年化程度不断加深，iNPH的疾病负担将愈来愈严重。因此，研究iNPH的病因以及危险因素可为iNPH的预防和治疗提供新的思路，有助于减轻疾病负担，具有重要的临床意义。

尽管经过数十年的研究，但目前iNPH的病因及危险因素仍不十分明确^{［4， 5］}。目前比较公认的iNPH的危险因素是老年人群中常见的心血管疾病诸如高脂血症、糖尿病和高血压等^［6-9］。此外，既往有数宗小规模的观察性研究亦报道睡眠异常如阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSA）和iNPH密切相关^［10-13］。Román等^［10］开展的一项总共纳入31例iNPH患者的前瞻性研究提示90.3%（28/31）的iNPH患者合并OSA且所有iNPH患者均合并睡眠异常（打鼾、夜间反复觉醒、夜尿症和白天过度嗜睡）。并且一项多中心研究提示失眠和过长睡眠会增加痴呆的患病风险^［14］。上述研究提示睡眠异常可能会增加iNPH的患病风险，但目前尚无大规模流行病学研究提供更有说服力的证据，且传统的观察性研究易受各种混杂因素干扰和反向因果偏差影响，难以推断睡眠性状与iNPH的因果关系。明确睡眠性状与iNPH的因果关联能够更好地指导iNPH的一级预防策略，因为睡眠习惯是可改变的生活因素。通过了解相关睡眠性状与iNPH之间的关系，我们可以采取针对性的措施，如调整睡眠时间、改善睡眠环境和减少白天小睡等，从而降低iNPH患病风险。

孟德尔随机化研究（MR）采用单核苷酸多态性（SNP）位点进行因果关联评估。由于等位基因在遗传过程中随机分配，此过程即相当于随机对照实验的随机分组过程，并且每一个个体的基因型在其整个生命周期内保持不变，所以 MR分析可规避混杂因素带来的干扰和其他反向因果偏差^［15］。MR分析效果等同于随机对照研究，且具有更好的实用性和便捷性。因此，本研究使用大规模全基因组关联研究（GWAS） 数据集，通过两样本双向MR研究分析睡眠性状与iNPH之间的因果关联，以期为iNPH的预防和治疗提供新的思路。

1 资料和方法

1.1 资料来源

正常压力脑积水的汇总数据来自芬兰数据库^［16］的一项GWAS队列，其中1456例病例和409 726例对照组。与睡眠相关的性状包括睡眠时长、过长睡眠（≥9 h）、过短睡眠（≤7 h）、打鼾、经常白天小睡（>3 d/周，>15 min/次）、早起睡眠习惯和失眠等的汇总数据来均来源于GWAS catalog数据库，此外OSA的汇总数据来源于MRCIEU GWAS数据库，各汇总数据的详细信息见表1。

1.2 工具变量的筛选

工具变量（IV）的选择基于孟德尔随机化研究的3个核心假设，（1）IV与暴露强相关（P<5×10^-8）；（2） IV与混杂因素不相关；（3）IV仅通过暴露而非通过其他任何途径影响结局。为避免连锁不平衡（LD）带来的偏倚，确保筛选的 IV 相互独立，本研究选择的IV符合每两个基因之间的物理距离>10 000 kb且基因之间 LD 的r²值<0.001。并进一步排除统计强度F<10的SNP。为满足假设（2），通过检索Phenoscanner V2数据库，排除与原发性高血压、糖尿病、高脂血症和肥胖等混杂因素相关的SNP。最后排除与结局密切相关的SNP（P<5×10^-8）以满足假设（3）的条件。

1.3 分析方法

1.3.1 主分析方法

采用固定效应逆方差加权和随机效应逆方差加权法（IVW）方法作为主分析方法，MR-Egger和加权中位数（MR-WM）为补充的MR方法进行分析。若暴露只有1个IV，则采用系数比率法（Wald ratio）。结果以比值比（OR）及相应的95% 置信区间（CI）的形式展示。

1.3.2 敏感性分析方法

采用MR Egger‑intercept检验来检测潜在的水平多效性。采用Cochrane Q检验进行异质性检验，当存在异质性时（即Cochrane Q检验 P<0.05），主分析MR结果采用随机效应IVW法的结果。采用留一法（Leave-one-out 检验）通过逐次逐个剔除单个SNP并计算剩余SNP合并产生的效应，明确单一SNP对结局的效应，进一步验证MR分析结果的稳健性。

1.3.3 外部验证

对初始MR分析提示和iNPH有因果关联的睡眠性状，选择不同的GWAS数据进行外部验证。目前除了芬兰数据库有iNPH的GWAS数据，其他公开数据库暂无iNPH 的GWAS数据，因此使用芬兰数据库的iNPH数据继续进行外部验证。按照上述方法筛选工具变量，进行MR分析和敏感性分析。此外，剔除跟初始MR分析重叠的工具变量，使用完全不同于初始分析的工具变量进行第二步外部验证。

上述分析均使用R语言（4.3.0版）中的“TwoSampleMR”包进行MR分析和绘图。P<0.05为差异有统计学意义（双侧）。

2 结果

2.1 工具变量

在探究睡眠性状与正常压力脑积水发病关联的分析中，本研究最终纳入了53个与睡眠时长、6个与过长睡眠（≥9 h）、17个与过短睡眠（≤7 h）、25个与打鼾、71个与经常白天小睡（>3 d/周，>15 min/次）、94个与早起睡眠习惯、1个与阻塞性睡眠呼吸暂停综合征和14个与失眠相关的SNP作为工具变量。在反向分析中，即探究NPH对睡眠性状影响的因果关联，最终纳入了7个与iNPH相关的SNP作为工具变量（表2）。

2.2 睡眠性状与iNPH因果关联的MR分析结果

以8种睡眠性状为暴露，iNPH为结局，主分析方法IVW法显示经常白天小睡会增加iNPH的发病风险（OR=3.3393，95 CI%：1.0646-10.4742，P=0.0270），并且3种MR分析方法结果因果方向相同，均提示经常白天小睡会增加iNPH的发病风险（图1）。Cochrane Q检验显示结果无潜在的异质性、MR Egger‑intercept检验显示结果无水平多效性（P>0.05，表3）。留一法检验逐个剔除单个SNP后，剩余SNPs的MR分析结果均在0的右侧，提示不存在对因果关联影响较大的SNP，此研究结果较为稳健（图2）。IVW法显示其余睡眠性状（睡眠时长、过长睡眠、过短睡眠、打鼾、早起睡眠习惯、睡眠呼吸暂停综合征和失眠）均与NPH无发病关联（P>0.05），且Cochrane Q检验和MR Egger‑intercept检验均提示结果无异质性和水平多效性（表3）。

2.3 iNPH与睡眠性状因果关联的MR分析结果

以iNPH为暴露，8种睡眠性状为结局，MR结果提示患有iNPH不会影响睡眠性状（表4）。其中在评估iNPH与睡眠时长、过短睡眠、打鼾、白天小睡和失眠等因果关联时，由于Cochrane Q检验提示存在异质性（P<0.05），主分析方法结果采用随机效应IVW法的结果。MR Egger‑intercept检验提示MR分析结果不存在水平多效性（P>0.05）。

2.4 外部验证白天小睡与iNPH因果关联的MR分析结果

选择来自MRCIEU GWAS数据库的白天小睡（Nap during day ID： ukb-a-12）进行外部验证。最终筛选出48个SNP作为工具变量。此外，我们剔除了跟初始MR分析白天小睡GWAS数据筛选出的工具变量重叠的18个SNP，使用完全不同于初始分析的30个SNP作为工具变量进行第二步外部验证。两步外部验证都复现了初始分析的结果，主分析方法IVW法显示白天小睡会增加iNPH的发病风险，两步外部验证的结果分别如下（OR=2.5660，95 CI%：1.1680-5.6373，P=0.0189）、（OR=4.0424，95 CI%：1.5709-10.4024，P=0.0038），并且3种MR分析方法结果因果方向相同（表3）。反向MR分析结果提示罹患iNPH不会影响白天小睡（表4）。

3 讨论

本研究MR结果显示相关睡眠性状和iNPH之间存在因果关联。本研究利用的白天小睡这一性状的GWAS数据^［19］来自英国生物银行，总共包括452 633名参与者，其平均年龄大约为57岁，主要关注点在于白天小睡的频率，按照每周白天小睡的频率分成很少（0~1 d）、有时（2~5 d）和经常（6~7 d）3个等级，且每次白天小睡的时间均大于15 min。因此可以得出相应的因果结论，老年人经常白天小睡会导致iNPH的发生，其罹患iNPH的概率是无白天小睡习惯的人3.3393倍（95 CI%：1.0646-10.4742，P=0.0270），其余两种补充MR分析方法均与IVW分析法的因果效应一致。敏感性分析提示此MR分析结果较为稳健可靠。而反向MR分析结果则提示iNPH不会影响睡眠性状。利用来自MRCIEU GWAS数据库的白天小睡GWAS数据进行的外部验证复现了这一结果（OR=2.5660，95 CI%：1.1680-5.6373，P=0.0189）。

本研究的创新之处在于首次应用孟德尔随机化研究全面的探究8种睡眠性状与iNPH的因果关联，为iNPH的预防带来新的思路，对于老年人群，减少白天小睡的频率有助于降低iNPH的发生概率。既往一项前瞻性队列研究^［10］同样提示31例iNPH患者的Epworth嗜睡程度评分值为11.4±6.4（评分值小于8为正常）^［22］，提示白天嗜睡可能和iNPH密切相关，但是传统的观察性研究易受混杂因素影响无法提供可靠的因果关联。此外该项前瞻性研究纳入病例数较少且并未纳入同年龄人群的健康对照组，更降低了其研究结果的说服力。传统探究因果关联的“金标准”随机对照研究费时、费钱，特别是研究像iNPH这类发病率较低的疾病，耗费巨大。我们开展的孟德尔随机化研究能很好地弥补上述传统临床研究的缺点，利用出生后不再发生变化的SNP作为工具，得出较为可靠的白天小睡和iNPH的因果关联。

目前关于白天小睡对健康影响的问题，还有许多仍待解决的疑惑^［23］。诸如白天小睡是否对健康有积极的影响、对健康的影响是否和白天小睡的持续时间以及频率相关等问题，仍然无确切的答案。对于年轻运动员，适宜时间的白天小睡可以提高他们的运动表现^{［24， 25］}以及减轻疲劳^［24］。对于老年人群，白天小睡对健康似乎有相反的作用。美国一项总共纳入2751名65岁以上老年人的大规模多中心前瞻性队列研究经过12年的随访最终结果提示^［26］，白天小睡的时间越长，发生痴呆的概率越大。一项来源于《中国健康与养老追踪调查》项目的横断面研究^［27］也得出类似的结果，白天不小睡以及白天过度小睡（>90 min/d）的人群发生认知障碍的风险分别是白天适宜小睡（31~60 min/d）的1.62倍和1.64倍。上述研究主要关注白天小睡持续时间对健康的影响，除此之外，白天小睡的频率和心血管疾病的发生密切相关^［28-30］。一项包括全球21个国家116 632位人群的多中心前瞻性队列研究^［28］显示经常白天小睡的人其发生心血管事件的风险显著增加，并且在每天晚上睡眠时间大于6 h的人群中，心血管意外发生的风险随着白天小睡持续时间的增加而增加。类似的，瑞士的一项前瞻性队列研究^［29］也得出相似的结论，经常白天小睡的人（6~7次/周）发生心血管事件的概率高于没有白天小睡习惯的人（HR =1.67， 95%  CI 1.10 to 2.55）。Yang等^［30］开展的前瞻性研究以及孟德尔随机化研究都证实了经常小睡会导致原发性高血压。由于心血管疾病也是目前较为公认的iNPH的危险因素^［6-9］，因此我们推测老年人经常白天小睡会导致如高血压等心血管疾病的发生，继而进一步导致iNPH的发生。上述推测有待进一步设计严谨的前瞻性研究或孟德尔随机化研究证实。综上，结合本研究MR分析结果以及既往的研究结果，我们认为老年人减少白天小睡的频率以及持续时间，有助于降低iNPH和心血管疾病发生的概率。

既往的观察性研究报道睡眠呼吸暂停综合征与iNPH密切相关^［10-13］，认为OSA可能会导致类淋巴系统功能失衡进而导致iNPH^［31-33］，但是本研究并未发现睡眠呼吸暂停综合征和iNPH的因果关联，可能是传统的观察性研究不可避免的混杂因素干扰了研究结果。

本研究的不足之处在于：（1）所使用的GWAS纳入对象均为欧洲人群，结论不能简单地直接外推到其他人群；（2）本研究提供了白天小睡和iNPH的因果关联，但是无法进一步探讨相关的发病机制。未来还需在不同人种之间开展相关研究，以进一步验证我们得出的结论。

综上所述，本研究采用双向两样本MR研究方法，系统探讨了不同睡眠性状与iNPH的潜在因果关联。结果表明，老年人经常白天小睡会导致罹患iNPH，提示减少白天小睡的频率对iNPH的发生有预防作用。

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