胃癌是全国肿瘤发病率排名第2的恶性肿瘤
［1］，是癌症死亡第3大常见原因
［2］。研究表明胃癌是由多因素、多基因变异累积导致的疾病，胃癌，大部分诊断发现已经是胃癌晚期，预后较差。寻找新的靶点是提高胃癌5年生存率的有效途径之一。近年来根据基因组及基因表达谱分析发现了一些具有重要生物学意义和临床应用价值的分子标志物及治疗靶点
［3］。本研究前期获得了胃癌基因差异表达谱，鉴定出约700个差异表达基因；进一步结合TCGA数据，初步筛选，选出增殖相关特征基因精子相关抗原5（SPAG5）。
SPAG5在实体瘤中已被证明有致癌作用，在多种癌症中过表达，并且与患者预后不良显著相关，可作为多种肿瘤的诊断、预后生存标志物和免疫治疗的靶点
［4-6］。已有研究发现，SPAG5在胃癌中高表达
［7］，与患者预后不良相关，机制研究发现，通过Survivin介导SPAG5表达上调依赖于Wnt/β-catenin 信号通路的存活素来促进胃癌的进展
［8］。但SPAG5在胃癌中的相关研究和报道依然不足，与胃癌增殖之间的关系尚不明确。本研究在以往研究的基础上，将进一步利用胃癌患者组织样本及体外细胞实验验证SPAG5在促进胃癌细胞恶性增殖的作用。
1 材料和方法
1.1 实验材料
组织样本：从青海大学附属医院肿瘤库和中国人民解放军总医院第七医学中心收集了122例GC样本和50例癌旁正常胃黏膜组织。本研究通过青海大学医学院伦理委员会审查（伦理批号：2021-21）。
细胞：人胃腺癌细胞（MKN74、SGC7901、AGS、MGC803、MKN45、GES、MGC803、BGC823）来自北京市肿瘤防治研究所惠赠。
实验试剂：胎牛血清（Ausbian），DMEM（Corning），胰酶（生工生物工程（上海）股份有限公司），Trizol（上海普飞生物技术有限公司），PCR试剂（Takara）试剂，MTT（Genview），DMSO（上海试一化学试剂有限公司），MTT检测试剂盒，Click-iT EdU检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific），GIEMSA（上海鼎国生物技术有限公司），凋亡检测试剂盒（eBioscience）。慢病毒编号：shCtrl-psc3741，shSPAG5-LVpGCSIL-004PSC27089-1（上海吉凯基因医学科技股份有限公司）。一抗：Anti-SPAG5（1∶1000）；鼠Anti-Ki-67 （8D5），（1∶200）；Anti-GAPDH（1∶2000），（Santa-Cruz）。二抗：Anti-Rabbit IgG（1∶2000）、Anti-Mouse IgG（1∶2000）（Santa-Cruz）。苏木素染色（上海碧云天生物技术股份有限公司）。
实验仪器：倒置显微镜（Nikon），二氧化碳细胞培养箱（海尔智家股份有限公司），多功能酶标仪（Molecular Devices），流式细胞仪（Millipore Guava easyCyte HT），漩涡震荡仪（IKA），化学发光成像系统（Vilber Bio Imaging）。
1.2 实验方法
1.2.1 生物信息学分析
通过Proteinatlas数据库分析SPAG5在细胞内定位，以及多种癌症中表达情况。并且利用 TCGA数据库（The Cancer Genome Atlas，
https：//www.cancer.gov/）下载胃癌高通量基因测序数据（HTSeq-Count）和临床数据集，共检索到408例胃腺癌组织和211例正常癌旁组织的mRNA表达数据。利用KM-plot数据库对关键基因SPAG5的表达在肿瘤中进行预后生存分析，并绘制生存曲线。我们通过在线网站GEPIA 2对SPAG5进行预后生存分析评估，生存数据选择总体生存期（OS），使用Log-rank检验，通过Kaplan-Meier生存曲线评估SPAG5在胃癌中的预后价值。
1.2.2 免疫组织化学
取组织切片在60 ℃恒温箱中烘烤30 min，组织切片置于二甲苯中脱蜡并以分级乙醇系列水合，在微波炉里高火加热0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织切片放入20 min。10%血清（TBS配制）封闭 30 min；孵育过夜；用PBS冲洗3次，5 min/次。在室温下，加入二抗，室温孵育60 min；二抗30 min。DAB 染色，苏木素染色 脱水封片，扫描染色玻片。
1.2.3 组织免疫荧光共聚焦
取组织切片脱蜡和水化，PBS冲洗2次， 5 min/次。抗原修复，PBS冲洗3次，5 min/次。滴加5%的血清，室温封闭30 min。滴加一抗，室温封闭1 h。PBS冲洗3次，5 min/次。滴加荧光二抗，避光室温孵育1 h。PBS冲洗3次，5 min/次。DAPI染色，滴加覆盖切片，染色10 min。PBS冲洗2次，2 min/次。封片。使用激光共聚焦显微镜进行观察。
1.2.4 慢病毒干扰感染细胞
利用慢病毒进行基因敲减，干扰片段序列：ATGCAACTGGATTATACAA，使用AGS和MGC803细胞进行慢病毒感染，将对数生长期的AGS，MGC803细胞使用胰蛋白酶消化后重新接种于10 cm细胞培养皿中，待细胞密度达60%~70%时进行转染。之后离心、过滤细胞。CsCI密度梯度离心法纯化病毒悬液，透析袋收集病毒，保存于-80℃。制备单细胞悬液，按2×105/孔的浓度接种于6孔板，对照及目的慢病毒感染目的细胞后72 h于显微镜下荧光观察，观察结果显示细胞感染效率达到80%以上。
1.2.5 Celigo和MTT细胞增殖实验
使用胎牛血清，DMEM，胰酶，在37 ℃的5% CO2培养箱中培养AGS细胞和MGC803细胞。
使用Celigo检测记录各时间点的细胞数目，从而分析细胞的生长状况。将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度接种于96孔板（铺板数设定为2000 /孔）。每组3复孔，培养体系为 100 μL/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致，37 ℃、5% CO2 培养箱培养；从铺板后第2天开始，每天Celigo 检测读板1次，连续检测读板5 d；通过调整analysis settings的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；对数据进行统计绘图，绘出5 d的细胞增殖曲线。
将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数。根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度（约2000/孔），每组3~5重复，根据实验设计决定铺板数量（如检测5 d，则铺5张96孔板）。统一铺好后，待细胞完全沉淀下来后，在显微镜下观察各实验组的细胞密度，放入细胞培养箱中培养。从铺板后第2天开始，培养终止前4 h加入20 μL 5 mg/mL 的 MTT于孔中，4 h后完全吸去培养液，注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒，加100 μL DMSO溶解甲瓒颗粒。振荡器振荡2~5 min，酶标仪490/570 nm检测OD值，数据统计分析。
1.2.6 实时荧光定量PCR法
将处理好的AGS和MGC803细胞进行总RNA提取，Trizol法提取，使用分光光度计抽提RNA浓度和质量。使用TAKARA试剂盒，根据说明书步骤将总RNA反向转录成cDNA，配置反应体系20 μL根据TAKARA说明书加样。反应程序根据说明书设定每个样品由3个重复孔和3组生物重复组成。反应后，判断是否产生非特异性扩增，根据熔解曲线判断。以2
-△△CT法计算基因相对表达量（
表1）。
1.2.7 蛋白质印迹法
处理好的AGS和MGC803细胞在缓冲液中获得细胞蛋白提取物，做蛋白定量。在10%SDS-PAGE凝胶上进行电泳。转膜转到PVDF膜上之后，使用一抗孵育，抗体来自鼠源。在PBS中洗涤并与二抗孵育后成像。应用BIO-RAD图像分析软件对蛋白质印迹杂交条带进行密度扫描。使用image J进行量化分析。
1.2.8 体外增殖实验
取各组对数生长期细胞浮在完全培养基，胰酶制备单细胞悬液，进行细胞计数。培养在96孔板，1000/孔，体积200 μL。同一般培养条件，培养3 d之后显色，每孔加MTT，溶液（5 mg/mL配PBS 20 μL），继续孵育4 h，弃上清液。每孔加150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解之后，比色，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值（570 nm波长），结果以横坐标为时间，纵坐标为吸光值绘制细胞生长曲线。MTT检测试剂盒Click-iT EdU检测试剂盒购于赛默飞，荧光细胞计数检测使用细胞成像分析仪，对细胞拍照并进行计数，并绘制曲线观察其增殖情况。
1.2.9 平板克隆形成实验
将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化，完全培养基重悬，制成细胞悬液，计数。于6孔板培养板中各实验组接种细胞400~1000/孔（根据细胞生长情况确定），每个实验组设3个复孔。将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14 d或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3 d进行换液并观察细胞状态。实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照，PBS洗涤细胞1次。每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，固定细胞30~60 min，PBS洗涤细胞1次。每孔加入洁净、无杂质GIEMSA染液500 μL，染细胞10~20 min。ddH2O 洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照整，克隆计数。
1.2.10 Annexin V-APC单染法流式检测细胞凋亡
shRNA慢病毒感染AGS和MGC803细胞后，培养5 d，细胞处理后，收集，沉淀，PBS清洗1次后重置细胞悬液，细胞计数仪进行细胞计数后染色孵育，按凋亡检测试剂盒说明书进行实验操作。结束后放入流式细胞管中送去流式细胞仪Millipore Guava easyCyte HT上机检测细胞凋亡。
1.2.11 统计学方法
实验结果使用SPSS 20.0版软件进行分析。数据以均数±标准差表示。等级资料采用Spearman检验进行比较。各组之间的差异通过t检验和单因素方差分析进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 利用TCGA数据等数据库分析SPAG5的表达
Protein atlas数据库分析发现SPAG5在细胞核及细胞浆均有分布（
图1A），TCGA数据库发现SPAG5在胃癌中高表达（
图1B），Protein atlas数据库分析显示其在多种肿瘤中高表达（
图1C）。
2.2 利用KM-plot及GEPIA数据库分析SPAG5的表达
利用KM-plot数据库和GEPIA数据库发现SPAG5在肺腺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、膀胱癌中高表达，并且与患者生存相关（
图2）。
2.3 SPAG5在胃癌组织中的表达
SPAG5基因在细胞的胞浆中表达，在胃癌肿瘤组织中高表达，并且，进行SPAG5的表达水平与总共122名有随访数据的胃癌患者的总生存期相关分析。Kaplan-Meier生存曲线显示，与SPAG5阳性肿瘤患者相比，SPAG5阴性肿瘤患者的预后更好（
P=0.001）。此外，多变量分析显示SPAG5表达是总体存活的独立预后因素，进一步，我们在122例胃癌及癌旁组织中通过免疫组化实验分析发现SPAG5的表达与MKi67之间存在显著的相关性（
图3、
表2）。
2.4 SPAG5与MKi67表达相关性分析
通过TCGA数据进行相关性分析发现，SPAG5与MKi67均在胃癌中高表达，并且二者的表达具有相关性（R=0.393，
P<0.01）。进一步，通过免疫组化实验及多因素分析发现在胃癌及癌旁组织中SPAG5的表达与MKi67之间存在显著的相关性（R=0.504，
P<0.01），免疫荧光共聚焦证明二者的表达具有相关性（图4，
表3）。
2.5 SPAG5在胃癌细胞系中的表达
在7株胃癌细胞系中，real time-PCR检测SPAG5基因表达结果，发现SPAG5基因在MKN74、BGC823、MGC803，SGC7901和AGS等细胞中表达水平较高细胞；蛋白水平通过Western blotting进行检测，结果一致（图5）。
2.6 在胃癌细胞系AGS和MGC803进行SPAG5干扰
荧光显微镜下观察转染效率发现，AGS和MGC803细胞在荧光视野下，细胞感染效率达到80%以上，细胞状态正常（图6A）。qRT-PCR和Western blotting结果显示，在AGS、MGC803细胞中，干扰组SPAG5基因的内源表达在基因和蛋白质水平均显著降低（P<0.01，图6B、C）。
2.7 干扰SPAG5后抑制胃癌细胞AGS和MGC803的增殖
shRNA慢病毒感染AGS和MGC803细胞后，通过Celigo实验和MTT检测，干扰SPAG5基因后AGS和 MGC803细胞生长受到明显抑制（
P<0.01，
图7A、B）。shRNA慢病毒感染AGS和MGC803细胞，克隆形成实验发现干扰SPAG5后AGS和MGC803细胞克隆形成的速率明显减慢，克隆大小受到抑制（
P<0.01，
图7 C）。
2.8 干扰SPAG5促进AGS和MGC803细胞的细胞凋亡
使用流式细胞术检测细胞凋亡，与对照组相比，shSPAG5组凋亡率明显增加（
P<0.01，
图8）。
3 讨论
SPAG5是一种微管相关蛋白
［9］。通常主要在精子细胞表达，其他正常组织几乎不表达。其C-端有两个螺旋结构域，与纺锤体的结构和功能相关。纺锤体负责有丝分裂过程中染色体的排列和分离，结合在纺锤体微管的SPAG5在细胞分裂的前、中、后期都可发挥作用
［10］；并且这种作用是SPAG5，CDK5RAP2，MCPH蛋白等在内的中心粒卫星蛋白相互作用的结果
［11］。细胞分裂过程中最显著的变化就是染色体的排列和分离，SPAG5敲除的细胞在有丝分裂过程中会出现障碍，最终产生凋亡
［12］。SPAG5可以促进多种肿瘤细胞的存活，下调的SPAG5可以抑制了细胞的活力、迁移和侵袭以及上皮间质转化，并诱导了G1期的停止
［13］。细胞分裂过程中最显著的变化就是染色体的重排与分离，而SPAG5敲除后细胞增殖受到抑制，并促进细胞凋亡
［14］。
SPAG5在多种癌症中高表达，被认为是潜在的泛肿瘤标志物
［15］。研究发现SPAG5在宫颈癌、乳腺癌及非小细胞肺癌等肿瘤组织中有不同程度的表达
［16-18］，被预测认为是肺癌治疗的新靶点
［19］。SF3B4在宫颈癌中表达上调，敲低SF3B4导致SPAG5的剪接效率下降，导致SPAG5的表达降低；SPAG5敲低损害了SF3B4在宫颈癌细胞中过表达的生物学功能，SF3B4/SPAG5轴是潜在治疗靶点
［20］。在黑色素瘤重，SPAG5过表达是患者不良预后的独立因素，下调SPAG5的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖，减弱肿瘤细胞的迁移和侵袭
［21］。本研究结果通过Proteinatlas、TCGA和GEPIA数据库分析发现SPAG5在肺腺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、膀胱癌中高表达，并且与患者生存相关。SPAG5可能是一个潜在的泛肿瘤标志物。进一步分析发现，慢病毒干扰SPAG5基因可以抑制胃癌细胞AGS和MGC803的增殖，促进AGS和MGC803的凋亡。分析SPAG5在胃癌的生物学作用具有重要意义。
SPAG5参与多种肿瘤的发生发展，SPAG5可通过HER2激活PI3K-AKT-mTOR信号通路促进细胞增殖
［22］，SPAG5可通过抑制p53信号通路，促进胰腺癌细胞的恶性行为
［23］。SPAG5促进自噬通过调节A549肺腺癌细胞中mTORC1的活性
［24］。根据报道，SPAG5可以抑制mTOR复合物信号通路进而阻止HELA细胞凋亡
［25］。SPAG5在恶性黑色素瘤中过表达，下调SPAG5可能导致FOXM1/ADAM17/NOTCH1信号失活，抑制肿瘤的生长和上皮间充质转化
［21］。在肝癌中SPAG5可能作为Wnt/β-catenin通路的上游调节蛋白发挥作用，沉默SPAG5会降低抑制程度，导致下游通路的蛋白表达下降
［26］。研究发现，着丝粒定位的SPAG5 结合蛋白（KNSTRN）调节免疫反应、促进G1/S转化和促进乳腺癌细胞增殖，发挥致癌活性
［27］。并且SPAG5可通过HER2激活PI3K-AKT-mTOR信号通路促进细胞增殖
［22］，SPAG5可通过抑制p53信号通路，促进胰腺癌细胞的恶性行为
［23］。SPAG5通过调节A549肺腺癌细胞中mTORC1的活性促进自噬
［24］。根据报道，SPAG5可以抑制mTOR复合物信号通路进而阻止HELA细胞凋亡
［25］。本研究前期结果同样证明，SPAG5可以通过激活PI3K/AKT信号通路影响胃癌的发展
［28］，可见，SPAG5可能与肿瘤细胞增殖密切相关。
本研究发现通过生信分析，免疫组化，免疫荧光共聚焦实验结果发现MKi67与SPAG5在胃癌中的表达具有相关性。MKi67是一种与细胞增殖有关的抗原
［29］。MKi67的蛋白质表达与恶性肿瘤内相互作用，是肿瘤增殖侵袭标志物
［30］。MKi67在直肠癌
［31］、乳腺癌
［32］、胃癌、及恶性软组织肿瘤中均有过表达。MKi67表达水平指示细胞增殖状态，MKi67的过度表达与癌细胞的分化呈负相关
［33］。被公认为癌症类型的有效诊断靶点
［34， 35］。MKi67在肝癌中，高表达与侵袭性临床肿瘤特征，肿瘤内异质性，同源重组缺陷呈正相关
［36］。刘萍团队
［16］通过蛋白质-蛋白质相互作用和RTq-PCR证明肺癌中MKi67和SPAG5的表达呈正相关，乳腺癌中两者的高表达与较差相关预后
［22］。这与本研究通过TCGA，免疫组化和免疫荧光共聚焦中的结论一致。因此，研究MKi67与SPAG5在胃癌中协同表达机制具有重要意义。
越来越多的证据表明，SPAG5在癌症治疗反应中发挥着重要的调节作用
［37］。同时该基因可以为核蛋白MKi67促进肿瘤增值的机制研究提供新方向。但SPAG5在胃癌中的作用机制研究依然不足。因此，今后将进一步分析在胃癌中SPAG5参与的相关通路来阐明它在肿瘤发生发展中的具体机制。
京公网安备11010202008535号
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