三百棒通过调控PI3K/Akt信号通路改善胶原诱导性类风湿性关节炎大鼠的血管翳

Tujia medicine Toddalia asiatica improves synovial pannus in rats with collagen-induced arthritis through the PI3K/Akt signaling pathway

摘要

目的 探讨三百棒醇提物（TAAE）通过PI3K/Akt信号通路改善胶原诱导性（CIA）大鼠血管翳的治疗作用及其机制。 方法 将60只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、雷公藤多苷片组（TGT）、三百棒醇提物低剂量组（TAAE-L）、三百棒醇提物中剂量组（TAAE-M）、三百棒醇提物高剂量组（TAAE-H），10只/组。除正常组外，对其余大鼠采用二次免疫法建立CIA大鼠模型。二次免疫结束后，三百棒醇提物组和雷公藤多苷组按相应剂量灌胃给药，1次/d，连续35 d。采用关节炎指数（AI）评分评估大鼠关节炎症程度；HE染色法观察膝关节滑膜病理变化；ELISA检测细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的水平；Western blotting法检测各组大鼠滑膜组织中 PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮抑制因子内皮抑素（ES）、缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）、基质金属蛋白酶（MMP1、MMP3、MMP9）蛋白含量的变化；RT-PCR检测各组大鼠滑膜组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α、PI3K、Akt mRNA水平。 结果 与模型组相比较，TAAE和TGT组大鼠的足肿胀度和AI评分降低（P<0.05），膝关节病理变化明显改善，新生血管生成减少，血清中炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）水平降低（P<0.01）。Western blotting实验结果显示，与模型组相比较，TAAE的干预上调ES蛋白水平，下调p-PI3K、p-Akt、MMP1、MMP3、MMP9、VEGF、HIF-1α蛋白水平，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。TAAE还降低了TNF-α、IL-6、IL-1β、PI3K、Akt、VEGF、HIF-1α mRNA水平，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。TAAE-H组与TGT组相比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 TAAE可通过PI3K/Akt信号通路调控HIF-1α、VEGF、ES、MMP1、MMP3、MMP9等蛋白的表达，改善CIA大鼠关节症状，抑制RA血管翳形成。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic mechanism of Tujia medicine Toddalia asiatica alcohol extract (TAAE) for synovial pannus formation in rats with college-induced arthritis (CIA). Methods Sixty male SD rats were randomized into normal control group, CIA model group, TGT group, 3 TAAE treatment groups at low, medium and high doses (n=10). Except for those in the normal control group, all the rats were subjected to CIA modeling using a secondary immunization method and treatment with saline, TGT or TAAE by gavage once daily for 35 days. The severity of arthritis was assessed using arthritis index (AI) score, and knee joint synovium pathologies were examined with HE staining. Serum levels of TNF-α, IL-6, and IL-1β were detected with ELISA; the protein expressions of PI3K, Akt, p-PI3K, p-Akt, VEGF, endostatin, HIF-1α, MMP1, MMP3, and MMP9 in knee joint synovial tissues were determined using Western blotting, and the mRNA expressions of TNF‑α, IL-6, IL-1β, VEGF, HIF-1α, PI3K, and Akt were detected with RT-PCR. Results Treatment of CIA rat models with TAAE and TGT significantly alleviated paw swelling, lowered AI scores, and reduced knee joint pathology, neoangiogenesis, and serum levels of inflammatory factors. TAAE treatment obviously increased endostatin protein expression, downregulated p-PI3K, p-Akt, MMP1, MMP3, MMP9, VEGF, and HIF-1α proteins, and reduced TNF‑α, IL-6, IL-1β, PI3K, Akt, VEGF, and HIF-1α mRNA levels in the synovial tissues, and these changes were comparable between high-dose TAAE group and TGT group. Conclusion TAAE can improve joint symptoms and inhibit synovial pannus formation in CIA rats by regulating the expressions of HIF-1α, VEGF, endostatin, MMP1, MMP3, and MMP9 via the PI3K/Akt signalling pathway.

Graphical abstract

关键词

三百棒 / 类风湿性关节炎 / 血管翳 / 炎症 / PI3K/Akt信号通路

Key words

Toddalia asiatica / rheumatoid arthritis / pannus / inflammation / PI3K/Akt signaling pathway

类风湿关节炎（RA）是一种影响全身的结缔组织性疾病，其主要病理特征是关节滑膜增厚、血管翳形成、骨及软骨破坏^［1］。据流行病学显示，全球有0.5%~1%的人群患有RA，其中我国该病的患病率为0.42%^{［2， 3］}。虽然RA的病因病机尚未完全明了，但人们已经认识到血管翳是引起关节病变、软骨破坏的主要病理基础。在RA滑膜炎症的环境中，滑膜细胞类似瘤样增殖，凋亡失衡，并伴有大量炎性细胞浸润，诱发了关节微环境的缺氧状态，这为滑膜血管的生成提供了条件，从而促进血管翳的形成^［4］。

由于目前临床治疗RA使用的DMARDs药物的严重毒副作用和生物制剂的昂贵价格使得患者常常难以接受^{［5， 6］}，因此，寻找具有抗RA功效的新药物成为当前研究的焦点，中医药和民族药物备受关注，因其源自天然且疗效显著。三百棒又名飞龙掌血，见血飞等，为芸香科飞龙掌血属植物（Toddalia asiatica Lam.）的根。在恩施土家苗族地区，三百棒是一种常用的抗风湿药物，其疗效已在临床上得到确切验证。据《土家族药物志》的记载，三百棒具有祛风除湿、消肿止痛、活血舒筋的功效，对于风寒湿痹症疗效佳^［7］。

PI3K/Akt信号通路不仅在炎症方面起重要作用^［8-10］，还与RA血管翳形成密切相关，其在RA滑液和滑膜细胞中有很高的表达水平。研究显示，在RA关节缺氧内环境中，滑膜细胞会通过激活PI3K/Akt通路来促使VEGF和HIF-1α的过度表达^［11］。课题组前期研究表明三百棒可以降低RA模型大鼠VEGF的表达^［12］。三百棒醇提物还具有很好的抗炎作用^{［7， 13］}，但三百棒改善RA血管翳的作用机制尚不明确，因此，本研究采用二次免疫法复制CIA大鼠模型，探讨三百棒对RA血管翳的改善作用及其可能机制，为进一步结合中医和土家医药理论，开发利用土家民族药物提供科学依据和理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康SPF级7~8周龄的雄性SD大鼠（180~220 g）60只，购自武汉实验动物中心，生产许可证号：SCXK（鄂）2020-0018，动物饲养于适宜环境，适应性喂养1周后用于实验。本实验已通过湖北民族大学动物伦理委员会的批准［批准号（No：2022-68）］。

1.2 主要试剂

牛Ⅱ型胶原（BⅡC，Chondrex）；完全弗氏佐剂（Sigma）；不完全弗氏佐剂（Sigma）；苏木素-伊红（HE）染液（Biossci）；雷公藤多苷片（浙江得恩德制药股份有限公司，国药准字H22022674）；VEGF、MMP2、MMP3、MMP9抗体（爱博泰克生物有限公司）；Akt抗体、p-Akt抗体（CST）；PI3K抗体（武汉华美生物有限公司）；p-PI3K、ES、HIF-1α抗体（北京博奥森有限公司）。

1.3 主要器材

Re-2000E旋转蒸发仪（郑州英宇裕华仪器公司）；FD8-8真空冷冻干燥机（Buchi）；153BR79456电泳槽、153BR79456电转膜仪（Bio-Rad）；TSJ-SD脱水机；HM325切片机（Leica）；BMJ-A包埋机（常州市中威电子仪器有限公司）；MagNA Lyser组织匀浆仪；Light Cycler480Ⅱ实时荧光定量PCR仪（Roche）。

1.4 实验方法

1.4.1 三百棒醇提物（TAAE）的制备

三百棒从湖北省恩施州的咸丰县采集，经湖北民族大学附属民大医院制剂室张国安主任药师鉴定为三百棒Toddalia asiatica（L.） Lam。药材标本（No.20200809），本研究主要使用三百棒的根皮。药物制备方法参照前期课题组处理方法^{［7， 14］}，将制备所得三百棒醇提物称重并计算收得率为24.8%，使用时用蒸馏水配制成所需浓度。

1.4.2 药物处理

Ⅱ型胶原乳化剂的制备：Ⅱ型胶原乳化剂的制备方法同前课题组研究^{［7， 14］}。

雷公藤多苷溶液配制：雷公藤多苷片购于湖北民族大学附属民大医院，将其研磨成粉，加蒸馏水稀释至所需浓度，使用超声振荡仪振荡溶解。

1.4.3 胶原诱导大鼠关节炎模型建立

参照课题组及相关文献报道^［7］，采用二次免疫法建立CIA模型，二次免疫结束后，随机取3只老鼠滑膜进行HE染色，当HE染色显示滑膜病理性改变，并且AI评分≥4时，表明该模型构建成功。

1.4.4 动物分组及给药

雄性SD大鼠60只，适应性喂养1周后，按随机数字法分为正常组（Control），模型组（Model）、三百棒醇提物低、中、高剂量组（TAAE-L、TAAE-M、TAAE-H）、雷公藤多苷片组（TGT），除正常组外余下的进行二次免疫法造模。造模成功后，TAAE-L、TAAE-M、TAAE-H组分别给予1.2、2.4、4.8 g/kg TAAE（参考60 kg成人临床常用剂量折算成等效标准大鼠剂量），1次/d，连续灌胃35 d。雷公藤多苷给药1.89 mg·kg^-1·d^-1，1次/d，连续灌胃35 d。正常组和模型组给予相同体积的生理盐水，持续35 d。

1.4.5 关节的组织病理学和评估

基于相关文献及课题组前期研究^［7］。采用0~4级关节评分法（表1）对大鼠双后肢进行评分，从第2次免疫结束后当天开始，每周对每只大鼠的肢踝关节肿胀状况进行详细的评分和记录，以2个脚爪的评分之和作为每个大鼠的关节评分。

1.4.6 大鼠足跖肿胀测量

参照相关文献及前课题组研究^［7］，用足容积排水法，测定大鼠踝关节以下（包括踝关节）的体积变化，并计算关节肿胀程度。关节肿胀度=（造模后容积－造模前容积）/造模前容积×100%。

1.4.7 酶联免疫吸附法（ELISA）

采取每种血液样本5 mL，以检测大鼠血清中细胞因子的含量。血液凝集后，所有的样本经过1 000 r/min的离心处理15 min，收集大鼠的血清，根据ELISA试剂盒的使用说明来测定细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的含量，使用酶标仪来测定吸光度，计算炎症因子的浓度。

1.4.8 组织病理HE染色

膝关节包埋后脱蜡：分别加入二甲苯I、II各20 min，梯度乙醇逐级脱水。染色：苏木素染色液（Harris）染色4 min→蒸馏水洗2 min，0.8%~1.0%的盐酸乙醇分化，蒸馏水冲洗，用稀碳酸锂水溶液返蓝，然后水洗2 min，加入伊红染液染20 s。脱水后封片：无水乙醇中脱水2 min，透明、封固。显微镜镜检，图像采集分析。

1.4.9 Western blotting检测相关因子表达

将每组动物的关节滑膜组织粉碎，向每个管中加入300 μL含有PMSF的裂解液以进行自动匀浆，制备蛋白样品，BCA法测定总蛋白浓度。各孔取相应的蛋白上样，然后电泳进行蛋白分离（浓缩胶电压80 V；分离胶电压120 V）。在280 mA恒定的电流下，将分离后的蛋白电转至PVDF膜上。快速封闭液封闭，用TBST洗膜1次，5 min；加入一抗抗体（体积稀释比例均为1∶1000），4 ℃孵育过夜，次日先以TBST洗膜3次，8 min/次；加入二抗（稀释比例为1∶10 000），室温反应2 h；再用TBST洗膜3次，8 min/次。按ECL试剂盒说明进行曝光显影。采用ImageJ图像分析管理系统对蛋白条带灰度值进行分析。

1.4.10 RT-PCR

用TRIzol试剂裂解滑膜组织，用Roche匀浆，４℃离心后，取总RNA。根据试剂盒的说明书进行逆转录，RT-PCR选用10 μL反应体系，根据SYBR试剂盒的反应条件在PCR仪上进行扩增，具体的引物（赛维尔公司）序列见表2。绘制溶解曲线，最终数据以2^-△△Ct进行分析。

1.5 统计学处理

采用SPSS 23.0及Graphpad Prism 8.0统计软件对实验数据进行分析，每组实验重复3次，实验结果以均数±标准差表示。实验数据符合正态分布时用One-Way ANOVA分析，方差齐时组间比较采用LSD法，方差不齐时组间比较采用Dunnete's T₃法，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TAAE对CIA大鼠关节炎严重程度的影响

2.1.1 大鼠关节肿胀度

与正常组相比，各造模组大鼠足跖容积明显增加，关节出现肿胀、畸形，并出现跛行，行动困难。2周后，模型组关节肿胀程度达到了顶峰。给药第1周起，与模型组相比较，TAAE-L剂量组中大鼠的关节有轻微的红肿现象，TAAE-M、TAAE-H、TGT组大鼠关节红肿症状得到了明显的缓解；给药第4周后，各药物干预组大鼠关节肿胀程度明显低于模型组，整体状况得到改善，疗效显著（P<0.05，P<0.01，图1）。

2.1.2 大鼠关节炎指数评分

与正常组相比较，模型组大鼠关节明显发红、肿胀，部分甚至出现畸形。各造模组大鼠AI评分≥4，且模型组数据持续保持上升趋势；与模型组相比，经过TAAE和TGT药物治疗后AI评分逐渐降低（P<0.05，P<0.01），且TAAE低、中、高剂量组在用药第2周开始稍有改善，其后一直保持下降趋势（图2）。

2.2 TAAE干预后各组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量

ELISA实验结果显示：与正常组相比，模型组大鼠血清中炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）含量明显升高；与模型组比较，TAAE组和TGT组中各炎症因子水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.01），TAAE-H剂量组与TGT组相比较差异无统计学意义（P>0.05，图3）。

2.3 TAAE减轻CIA大鼠的关节组织病理学变化

大鼠膝关节组织HE染色结果显示：正常组中滑膜无增生，无新生血管生成，未见炎性细胞浸润；与正常组相比，模型组小鼠踝关节间隙狭窄，出现滑膜增生，新生血管生成，较多部位存在炎性细胞浸润情况；经过TAAE和TGT治疗后滑膜增生和血管生成明显改善，炎症细胞明显减少（图4）。

2.4 TAAE对大鼠滑膜组织相关蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组血管内皮生长因子（VEGF）、缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）蛋水平升高，血管内皮抑制因子内皮抑素（ES）水平降低，P<0.01；与模型组比较，TAAE和TGT的治疗使这种现象发生了逆转，使VEGF、HIF-1α蛋白水平降低，ES蛋白水平降低，P<0.05，TAAE-H剂量组与TGT组相比较差异无统计学意义（P>0.05，图5）。

2.5 TAAE对PI3K/AkT信号通路相关蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组中p-PI3K、p-Akt蛋白表达上升（P<0.01）；与模型组相比，TAAE与TGT干预治疗组中p-PI3K、p-Akt蛋白表达明显下降（P<0.05，P<0.01），PI3K、Akt的总蛋白表达量无明显变化，差异无统计学意义，TAAE-H剂量组与TGT组相比较差异无统计学意义（P>0.05，图6）。

2.6 TAAE对大鼠滑膜组织mRNA水平的影响

RT-PCR实验结果显示：与正常组比，模型组中PI3K、Akt、TNF‑α、IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α的mRNA水平升高，与模型组比较，TAAE与TGT治疗组中PI3K、Akt、TNF‑α、IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α的mRNA水平降低，差异有统计学意义（P<0.05，图7）。

3 讨论

类风湿关节炎是一种难治性自身免疫性疾病，全身各个器官会受到血管炎病变的影响。其病理机制涵盖了滑膜的增生、炎细胞浸润、新生血管的生成、血管翳的形成等多个方面^{［16， 17］}，其中新生血管生成是RA疾病进程中的关键环节^［18］。血管翳的组成部分包含新生的微血管、机化的纤维素和肥大的滑膜细胞，血管翳是RA病变过程中的典型病理产物，具有“类肿瘤”特点，是导致软骨破坏和关节病变的主要病理基础^{［19， 20］}，目前靶向新生血管生成是治疗RA的热点^［21］。CIA模型与人类RA具有较多相同病理特征，包括如滑膜过度生长、炎性细胞的渗透和软骨的降解等，是目前研究RA的经典动物模型^［22］。因此，本研究构建了CIA模型来深入探索TAAE如何改进RA血管翳的机制。

三百棒是土家苗族常用的一种天然抗风湿药物，临床常用的土家抗风湿复方三百棒药酒^［23］、金边祛风饮^［24］均以三百棒为主要成分，治疗RA十余年，起到了较好的疗效。前课题组已证实TAAE具有良好的抗炎作用^{［7， 13］}，可降低RA模型大鼠VEGF的表达，抑制关节炎，减少血管增生、软骨降解，改善RA病情^［12］。TAAE还可通过PI3K/Akt信号通路促进滑膜细胞凋亡从而减轻CIA大鼠的关节炎^［15］。然而三百棒在改善血管翳方面的相关机制尚不清楚，因此，本实验进一步探讨了TAAE对RA血管翳的改善作用及其可能机制，在本研究中，TAAE能有效降低CIA大鼠足肿胀度，降低AI评分还能明显改善CIA大鼠滑膜增生、炎性浸润、血管新生等病理改变。在RA患者关节腔中存在低氧环境，会募集大量炎性细胞加剧局部炎性反应，从而促进血管新生。本研究中TAAE的干预降低了CIA大鼠血清中促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）水平，表现出良好的抗炎作用，对CIA大鼠关节炎血管翳有很好的抑制作用。

近年来研究发现，PI3K/Akt通路在RA滑膜微血管新生中起重要调控作用。PI3K是一个包括许多脂质激酶的家族，且可以被众多的细胞因子受体所激活，活化后的PI3K可使Akt磷酸化，进入胞质和胞核。Akt可直接或间接磷酸化mTOR后可进一步使HIF-1α升高，导致VEGF表达增强，ES表达减弱，从而导致血管翳新生血管的生成^{［25， 26］}。HIF-1α作为新生血管生成的关键转录因子，它调节细胞对缺氧的反应，在RA缺氧滑膜中高表达^［27］。VEGF具有调控血管生成的作用，是HIF-1α调控的关键下游基因之一，VEGF能够直接加速血管翳的生成，从而进一步加剧滑膜增生引发的慢性炎症症状^［28］。内皮抑素（ES）是一种血管生成的内源性抑制剂，ES可有效抑制血管生成和肿瘤生长^［29］。研究表明：纤维样滑膜细胞可通过PI3K/Akt信号途径表达的低水平CD147降低VEGF产生^［30］。同时研究发现CIA大鼠滑膜组织中新生血管形成与HIF-1α过表达相关，其表达同样依赖PI3K/Akt信号通路^［11］。本研究中，TAAE的治疗使ES蛋白水平明显上调，VEGF、HIF-1α、p-PI3K、p-Akt蛋白水平明显下调，对血管翳的形成有明显的抑制作用。

在RA发展中，基质金属蛋白酶（MMPs）作为炎症的重要介质，其对细胞外基质（包括胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白等）有降解作用^［31］。在RA患者关节中MMPs呈高表达^［32］，它不仅能直接降解骨和软骨，还能通过刺激内皮细胞，使血管再生促进血管翳形成，导致RA中的不可逆组织破坏和胶原变性^{［33， 34］}。研究表明，使用MMP组织抑制剂（TIMP）后，RA患者关节症状可以得到有效缓解^［35］ 。本研究中，TAAE的干预有效下调了滑膜组织中MMP2、MMP3、MMP9蛋白水平，对CIA大鼠关节炎起到明显的改善作用。同时，TAAE的干预有效降低VEGF、HIF-1α、PI3K、Akt、TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA水平。该实验结果提示TAAE可介导PI3K/Akt通路减轻滑膜炎症，改善CIA大鼠滑膜血管翳。

综上，TAAE能够显著改善CIA大鼠关节肿胀症状及其病理变化，减轻滑膜炎症，抑制滑膜血管翳形成，其机制可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路从而发挥治疗作用。同时，本研究为进一步开发土家药物三百棒治疗RA提供了理论依据。

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