蒙花苷通过抑制TLR4/NF-κB通路抑制小鼠脊髓损伤后小胶质细胞活化介导的神经炎症和神经元凋亡

Linarin inhibits microglia activation-mediated neuroinflammation and neuronal apoptosis in mouse spinal cord injury by inhibiting the TLR4/NF-κB pathway

摘要

目的 探讨蒙花苷（LIN）在脊髓损伤（SCI）后对激活小胶质细胞介导的炎症和神经元凋亡的神经保护作用和潜在机制。 方法 将50只8~10周龄C57BL/6J小鼠随机分为假手术组（Sham组）、脊髓损伤模型组（SCI组）和LIN药物治疗组（12.5、25、50 mg/kg），10只/组。使用巴索小鼠评分量表（BMS）、斜板实验和脚印分析评估SCI小鼠的运动功能恢复情况；通过HE染色和LFB染色分别评估脊髓组织损伤面积和髓鞘化面积。采用Nissl染色、免疫荧光及Western blotting观察损伤脊髓组织前角运动神经元的保留情况。体外实验通过LPS诱导BV2细胞建立体外炎症模型，同时给予蒙花苷进行干预，将BV2细胞分为对照组（Con-B）、脂多糖组（LPS-B）及蒙花苷组（LIN-B）。通过免疫荧光、Western blotting、RT-qPCR及ELISA检测体内外小胶质细胞活化及炎症因子的释放情况，进一步采用Western blotting验证信号通路的改变。构建体外BV2细胞和HT22细胞共培养模型，分为Con-H组、LPS-H组以及LIN-H组。采用Western blotting检测激活小胶质细胞介导的HT22细胞凋亡情况。 结果 行为学检测发现，LIN组小鼠BMS评分显著提高，承受的斜板高度更高，后肢行走协调且足迹清晰（P<0.05）。组织学染色结果显示，LIN组小鼠脊髓组织损伤面积减少，髓鞘化面积增加，并且小鼠脊髓前角运动神经元的数量增加（P<0.05）。体内外实验证实，LIN显著抑制小胶质细胞的活化和炎症因子（iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6、IL-1β）的释放，并减少了体内神经元的凋亡（P<0.05）。Western blotting显示LIN抑制小胶质细胞活化可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。体外共培养实验结果显示，LIN的干预能够减少炎症介导的神经元凋亡数量（P<0.05）。 结论 LIN可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路抑制小胶质细胞的激活，减轻神经炎症，改善SCI后的神经元凋亡，提高SCI小鼠运动能力，发挥其神经保护作用。

Abstract

Objective To investigate the mechanism underlying the neuroprotective effect of linarin (LIN) against microglia activation-mediated inflammation and neuronal apoptosis following spinal cord injury (SCI). Methods Fifty C57BL/6J mice (8-10 weeks old) were randomized to receive sham operation, SCI and linarin treatment at 12.5, 25, and 50 mg/kg following SCI (n=10). Locomotor function recovery of the SCI mice was assessed using the Basso Mouse Scale, inclined plane test, and footprint analysis, and spinal cord tissue damage and myelination were evaluated using HE and LFB staining. Nissl staining, immunofluorescence assay and Western blotting were used to observe surviving anterior horn motor neurons in injured spinal cord tissue. In cultured BV2 cells, the effects of linarin against lipopolysaccharide (LPS)‑induced microglia activation, inflammatory factor release and signaling pathway changes were assessed with immunofluorescence staining, Western blotting, RT-qPCR, and ELISA. In a BV2 and HT22 cell co-culture system, Western blotting was performed to examine the effect of linarin against HT22 cell apoptosis mediated by LPS-induced microglia activation. Results Linarin treatment significantly improved locomotor function (P<0.05), reduced spinal cord damage area, increased spinal cord myelination, and increased the number of motor neurons in the anterior horn of the SCI mice (P<0.05). In both SCI mice and cultured BV2 cells, linarin effectively inhibited glial cell activation and suppressed the release of iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6, and IL-1β, resulting also in reduced neuronal apoptosis in SCI mice (P<0.05). Western blotting suggested that linarin-induced microglial activation inhibition was mediated by inhibition of the TLR4/NF-κB signaling pathway. In the cell co-culture experiments, linarin treatment significantly decreased inflammation-mediated apoptosis of HT22 cells (P<0.05). Conclusion The neuroprotective effect of linarin is medicated by inhibition of microglia activation via suppressing the TLR4/NF‑κB signaling pathway, which mitigates neural inflammation and reduce neuronal apoptosis to enhance motor function of the SCI mice.

Graphical abstract

关键词

脊髓损伤 / 蒙花苷 / 神经炎症 / 神凋亡 / TLR4/NF-κB

Key words

spinal cord injury / linarin / neuroinflammation / apoptosis / TLR4/NF-κB

脊髓损伤（SCI）是极具致残性和破坏性的中枢神经系统疾病之一^{［1， 2］}。SCI后小胶质细胞的过度激活加剧炎症反应，导致神经元的损伤和死亡，加速SCI的进展^［3］。因此，继发性损伤成为SCI不可逆损伤的重要因素，也是导致患者感觉和运动功能障碍的根本原因^{［4， 5］}。但目前临床上尚未出现一种有效的治疗方法能够显著缓解SCI后的继发性损伤，寻找新的且有效的药物是目前SCI治疗亟待解决的问题。蒙花苷（LIN）是一种天然黄酮类化合物，具有良好的抗炎、抗凋亡、神经保护等药理作用^［6］。既往研究发现，LIN能够通过抑制巨噬细胞的吞噬作用和促炎因子的产生发挥抗炎作用，并可抑制TLR4信号通路预防骨关节炎症^{［7， 8］}。在阿尔茨海默病和缺血性脑卒中的研究中发现，LIN能够增加了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而减少神经元的凋亡数量发挥神经保护作用^［9-12］。尽管LIN在中枢神经系统疾病中发挥着潜在的神经保护作用，但其在SCI中的研究尚未可见。因此，本研究通过构建体内小鼠SCI模型和体外炎症及继发性神经元凋亡模型，探讨LIN对SCI的保护作用和潜在机制。

1 材料和方法

1.1 材料

蒙花苷（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%）；苏木精-伊红、Luxol Fast Blue染液、甲苯胺蓝染液、CCK8试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；抗体CD68、iNOS、NeuN、TLR4、IgG H&L（Alexa Fluor^® 555）、IgG H&L（FITC）（abcam）；COX-2（Bio-Techne）；cleaved-caspase 3、p-NF‑κB p65、NF‑κB p65、p-IκBα、IκBα（CST）；Bcl-2、Bax、GAPDH（武汉三鹰生物技术有限公司）；小鼠小胶质细胞株BV2、小鼠海马神经元HT22细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）；MEM培养基、DMEM培养基、胎牛血清（gibco）；二甲基亚砜DMSO（北京索莱宝科技有限公司）；BCA蛋白试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；脂多糖LPS（Sigma）；酶联免疫吸附实验检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；抗体CD11b、Trizol（Thermo Fisher）；cDNA试剂盒、PCR反应试剂盒（Takara）；引物TNF-α、IL-6、IL-1β、GAPDH（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 SCI造模与分组

选取8~10周龄的雌性C57BL/6J小鼠（18~22 g），经腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉小鼠后，在无菌条件下，以第9胸椎（T9）为中心，咬除T9棘突，去除椎板，充分暴露脊髓；小鼠固定在IH-0400脊髓撞击仪上，确保脊髓呈水平状态，设置撞击力度为50 kdynes，当损伤部位存在局部瘀血，双下肢抽搐和尾巴痉挛性摇摆为造模成功^［13］。造模成功后每日皮下注射0.5 mL抗生素，并进行排尿护理，直至SCI小鼠恢复自主排尿功能。

小鼠饲养于恒温动物房内，明暗12 h交替，自由获取食物和水。适应性喂养1周后将50只C57BL/6J小鼠随机分为5组，10只/组：假手术组（Sham组）、模型组（SCI组）、低剂量蒙花苷组（12.5 mg/kg LIN组）、中剂量蒙花苷组（25 mg/kg LIN组）和高剂量蒙花苷组（50 mg/kg LIN组）。Sham组小鼠行椎板切除术，不进行脊髓撞击；SCI组小鼠进行脊髓撞击和生理盐水（0.2 mL）治疗。LIN组脊髓损伤小鼠分别口服12.5、25、50 mg/kg的LIN（DMSO溶解，生理盐水稀释）^［14］，每组小鼠每天灌胃给药1次（0.2 mL），连续给药至取材前1 d。本研究经蚌埠医科大学动物研究伦理委员会批准（伦理批号：伦动科批字［2022］第068号）。

1.2.2 巴索小鼠评分量表（BMS）评分^［15］

为评估小鼠运动功能的恢复情况，在小鼠脊髓损伤术前和术后的第1、3、7、14、21、28、35、42天，每组随机选取6只小鼠，由2位独立的研究员进行双盲实验。在4 min的时间内，根据小鼠后肢关节运动、动作协调性、躯干稳定性和尾巴位置对SCI小鼠进行0~9分的评分，评分越高代表SCI小鼠运动功能恢复的越好。最后结果取其平均值作为其得分。

1.2.3 斜板实验

为评估小鼠后肢承重能力，在小鼠脊髓损伤术前和术后的第1、3、7、14、21、28、35、42天，每组随机选取6只小鼠，将小鼠置于垫有橡胶垫的斜板上，从0°开始，每次抬高5°至最高角度60°，记录小鼠在斜板上维持5 s的最大角度值。测试3次取其平均值。

1.2.4 脚印分析^［16］

在小鼠脊髓损伤后的第42天，每组随机选取6只小鼠，将小鼠的前爪和后爪分别涂上红色和蓝色染料，让其行走在长80 cm，宽40 cm的窄暗道上，拍照记录SCI小鼠行走时留下的足印，并对脚印进行0~4分的评分。评分标准：0分：持续的足背跛行或后肢拖沓，不能够走出可见的脚印；1分：至少在3个脚印中有至少3个足趾出现可见的足趾印；2分：内旋或外旋角度超过基线值的2倍；3分：没有明显的足趾拖沓，仅有内旋或外旋；4分：没有明显的内旋或外旋（不超过基线角度的2倍）。

1.2.5 组织取检

药物干预7 d后，将小鼠麻醉后进行心脏磷酸缓冲盐溶液（PBS）灌注，至右心无血液流出，肝脏变黄，肺组织变白时，再用4%多聚甲醛固定液（PFA）灌注至小鼠全身僵硬。进而以脊髓损伤处为中心，取约1 cm长脊髓组织。

1.2.6 组织学染色

脊髓组织经脱水处理后，进行OCT包埋，制作厚度为4 μm的冰冻切片用于后续染色实验。通过HE染色、LFB染色和Nissl染色评估受损区域，髓质白质区域和剩余运动神经元的数量。病变面积和髓质白质面积使用ImageJ软件进行测量，并进行定量分析，通过计算尼氏体的数量来量化存活的神经元。

1.2.7 细胞培养

小鼠小胶质细胞BV2细胞培养于MEM培养基中，含10%胎牛血清和1%青/链霉素，并置于37 ℃、5%CO₂的培养箱中，每隔1 d更换1次培养基。将细胞分为对照组（Con-B）、脂多糖组（LPS-B，1 μg/mL）和蒙花苷组（LIN-B）。对照组：BV2细胞不做任何处理；脂多糖组：采用1 μg/mL 的LPS诱导体外BV2细胞炎症模型；蒙花苷组：于LPS诱导的炎症环境下，加入30 μmol/L的LIN同时诱导24 h。LIN与含有0.01%的DMSO的培养基混合，细胞传代于6孔板（2×10⁵）或96孔板（1×10⁴），进行后续细胞实验。

1.2.8 BV2细胞和HT22细胞的共培养模型

小鼠海马神经元HT22细胞培养于含DMEM、10%胎牛血清和1%青/链霉素的培养基中。将Con-B、LPS-B和LIN-B组的BV2细胞弃去旧的培养基，加入新鲜培养基培养24 h，收集各组上清，与HT22细胞的培养基进行1：1混合处理干预各组HT22细胞（Con-H、LPS-H和LIN-H组），培养24 h进行后续检测。

1.2.9 CCK-8

将BV2细胞以1×10⁴/mL的密度接种于96孔板中，每组5个重复孔。LIN孵育24 h，LPS诱导6 h。每孔加入90 μL培养基和10 μL CCK8工作液，置于细胞培养箱中孵育1 h，于酶标仪450 nm波长下检测各孔细胞的吸光度值。

1.2.10 RT-qPCR

采用Trizol法从SCI小鼠脊髓组织和各组BV2细胞中总的RNA，然后使用反转录试剂盒合成cDNA。使用qPCR试剂盒以cDNA为模板，进行PCR反应。最终在Quant Studio实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，采用两步法PCR扩增程序为：95 ℃预变性，95 ℃变性，60 ℃延伸。以GAPDH为内参，利用2^-ΔΔCt法进行qPCR结果相对定量分析。引物序列：TNF-α上游引物5'-CAGGCGGTGCCTATGTCTC-3'，下游引物5'-CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG-3'；IL-6上游引物5'-TCTATACCACTTCACAAGTCGGA-3'，下游引物5'-GAATTGCCATTGCACAACTCTTT-3'；IL-1β上游引物5'-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3'，下游引物5'-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3'；GAPDH上游引物5'-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3'，下游引物5'-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3'。

1.2.11 ELISA

将脊髓组织匀浆后提取上清，各组细胞诱导结束后收集上清，根据ELISA试剂盒说明书，使用酶标仪测定450 nm处的吸光度值，检测组织和细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的浓度。

1.2.12 免疫荧光染色

脊髓组织冰冻切片及BV2细胞爬片用4%多聚甲醛固定后，用PBS洗涤3次后，加入0.2% TritonX-100通透15 min。加入5%的山羊血清于室温封闭30 min。加入一抗［CD68（1∶500）、CD11b（1∶200）、NeuN（1∶100）、cleaved-caspase 3（1∶200）］在4 ℃孵育12 h。次日PBS洗涤切片后，加入二抗［山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor^® 555），1∶1000；山羊抗兔IgG H&L（FITC），1∶500］室温下孵育2 h。最后，滴加DAPI复染细胞核。于荧光显微镜下观察并随机拍摄6个视野，进一步分析图像。

1.2.13 Western blotting

脊髓组织、BV2细胞及HT22细胞中加入RIPA裂解液（含蛋白酶和磷酸化酶抑制剂）提取蛋白质。采用BCA法进行蛋白定量，40 μg蛋白加入SDS-PAGE凝胶孔中进行电泳，并转移到PVDF膜上，使用脱脂牛奶（5%）封闭1 h后，加入一抗（iNOS、COX-2、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase 3、p-NF‑κB p65、NF-κB p65、p-IκBα、IκBα、TLR4、GAPDH，1∶1000）在4 ℃下孵育过夜。次日加入相应的二抗于室温下孵育1 h。最终使用ECL化学发光试剂对膜进行可视化，使用ImageJ软件对条带进行灰度值分析。实验独立重复3次。

1.3 统计学分析

采用SPSS26.0软件进行数据处理和统计分析，符合正态分布且方差齐的计量资料以均数±标准差表示。两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LDS-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LIN改善SCI小鼠运动功能

自损伤后第21天起，相较于SCI组，接受LIN治疗的小鼠BMS评分显著提高（P<0.05，图1A），在斜板实验中所承受的斜面角度更高（P<0.05，图1B）。LIN在低、中及高浓度间的差异无统计学意义。因此后续实验选择低剂量的药物浓度（12.5 mg/kg）。脚印分析实验显示，SCI组小鼠出现后肢拖拽的情况；经过LIN治疗的小鼠显示出更为协调的双后肢足迹，且脚印评分显著提高（P<0.05，图1C、D）。

2.2 LIN改善SCI小鼠脊髓组织的病理学损伤

HE染色结果显示，接受LIN治疗的小鼠脊髓损伤中心及距中心0.25 mm和0.5 mm处损伤区域较SCI组明显减少（P<0.05，图2A、B）。LFB染色结果显示，SCI组小鼠髓鞘化面积显著减少，经LIN治疗后明显改善，小鼠脊髓损伤中心及距中心0.25 mm处髓鞘化面积也显著增加（P<0.05，图2C、D）。

2.3 LIN减少SCI后小胶质细胞的活化数量并减轻神经炎症

免疫荧光结果显示，SCI后小胶质细胞激活标志物（CD68）的荧光强度显著增强，而经LIN治疗后这种增加显著被逆转（P<0.05，图3A、B）。Western blotting分析显示，SCI组促炎介质iNOS和COX-2蛋白水平显著增加，而经LIN治疗后这些蛋白表达水平显著降低（P<0.05，图3C、D）。RT-qPCR结果显示，SCI小鼠脊髓组织中促炎因子TNF-α、IL-6及IL-1β显著增加，而经LIN治疗后显著抑制了小鼠脊髓组织中炎症因子的释放（P<0.05，图3E~G）。ELISA结果与RT-qPCR结果相一致（P<0.05，图3H~J）。

2.4 LIN减轻SCI后的神经元凋亡

Nissl染色结果显示，相较于SCI组，LIN组小鼠脊髓前角组织中存活的神经元数量更多（P<0.05，图4A、B）。NeuN/c-caspase 3免疫荧光双重染色结果显示，与SCI组相比，LIN组小鼠脊髓组织中c-caspase 3阳性的神经元数量显著减少（P<0.05，图4C、D）。Western blotting分析显示，LIN组小鼠脊髓组织中凋亡蛋白Bax和c-caspase 3的表达水平显著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平增加（P<0.05，图4E~H）。

2.5 LIN抑制LPS激活的小胶质细胞中促炎因子的释放

CCK8结果显示，在0~120 μmol/L的浓度范围内LIN对BV2细胞无毒副作用，BV2细胞活力不受影响（图5A）。LPS（1 μg/mL）刺激BV2细胞6 h后，细胞活力显著降低，因此后续实验中LPS的最佳诱导时间为6 h（P<0.05，图5B）。并且浓度为30、60、120 μmol/L的LIN能够改善LPS诱导的BV2细胞损伤（P<0.05），3组间差异无统计学意义（图5C）。Western blotting分析显示，相对于LPS-B组，30 μmol/L的LIN能够降低iNOS和COX-2的表达（P<0.05，图5D、E），因此后续实验选择30 μmol/L的LIN作为最适合的药物治疗浓度。免疫荧光染色结果显示，LIN-B组小胶质细胞的活化数量相较于LPS-B组显著减少（P<0.05，图5F、G）。RT-qPCR及ELISA结果显示，经LIN干预的BV2细胞中促炎因子释放显著减少（P<0.05，图5H~M）。

2.6 LIN可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路抑制小胶质细胞的激活

Western blotting结果显示，相较于LPS-B组，LIN-B组的TLR4、MyD88的蛋白表达下降，NF-κB p65及IκBα的蛋白磷酸化水平降低（P<0.05，图6）。

2.7 LIN抑制活化的BV2细胞介导的HT22细胞凋亡

CCK8结果发现，在0~120 μmol/L的浓度范围内LIN对HT22细胞活力无影响（P<0.05，图7A）。将HT22细胞与LPS干预的BV2细胞进行共培养，经Western blotting检测，HT22细胞中Bax、c-caspase3蛋白的表达显著增加，Bcl-2蛋白的表达则显著降低；而LIN的干预显著逆转了以上蛋白的表达（P<0.05，图7B~E）。

3 讨论

脊髓损伤后，大量小胶质细胞被激活并聚集在受损区域，释放大量炎性介质，加剧神经元的损伤和凋亡^［17］。控制继发性SCI中神经炎症和神经元凋亡，对促进脊髓的修复和恢复至关重要^［18］。本研究验证了LIN对神经的保护作用，其能够有效地抑制小胶质细胞活化介导的炎症和继发性神经元凋亡，从而改善SCI小鼠的运动功能。其作用机制可能与促进TLR4/NF-κB信号通路的失活有关。

天然植物化合物在中枢神经系统的治疗方面具有显著效果^［19］。LIN是一种天然的黄酮类化合物，具有神经保护、抗细胞凋亡和抗炎等多种药理作用，且药物安全性较高，因此在临床研究中备受重视^［20］。研究表明，LIN不仅对心血管健康有益，能够降低血脂和减轻心脏肥大等症状，还对神经系统具有保护作用，有助于提升记忆和学习能力^{［9， 21， 22］}。LIN优越的神经保护作用表明其可能在SCI中具有潜在的治疗价值。为验证猜想，本研究首次应用LIN探究其在SCI模型小鼠中的作用效果，通过BMS评分、斜板实验以及脚印分析在内的多种行为学检测，结果显示经LIN治疗的SCI小鼠的运动能力显著提高，主要表现在躯干稳定性的增强，后肢的承重能力增加以及行走时脚印更加协调清晰。组织学染色结果显示，相较于SCI损伤组，经LIN治疗后的小鼠脊髓组织损伤面积显著减小，髓鞘化面积显著增加，SCI小鼠的损伤脊髓组织得到明显的改善。本研究证实LIN治疗显著改善小鼠的运动功能障碍和脊髓组织损伤。然而，LIN在脊髓损伤中发挥的具体作用途径尚不明确。

神经炎症是脊髓损伤对创伤的重要反应。小胶质细胞是中枢神经系统中的免疫细胞，是先天免疫系统的主要成分之一^［23］。研究表明，脊髓损伤后损伤组织处小胶质细胞活化并释放炎症介质进一步加剧损伤部位的炎症病理过程^［24］。既往研究发现，LIN通过抑制炎症反应来保护ccl4诱导的急性肝损伤并改善DSS诱导的C57BL/6J小鼠结肠炎^{［25， 26］}。然而，该药物在SCI后如何抑制炎症减轻损伤尚未见阐明。因此，本研究首次探讨了LIN是否能够抑制小胶质细胞的活化减轻SCI炎症，进而发挥保护作用，结果显示LIN组小胶质细胞活化的阳性数量显著减少，炎症标志物（iNOS和COX-2）蛋白水平明显下降。此外，经LIN治疗的SCI小鼠脊髓组织中炎症介质（TNF-α、IL-1β和IL-6）的释放较SCI模型组显著减少。由此可见，LIN通过减少小胶质细胞的活化，减轻SCI小鼠体内的炎症。

既往研究显示，TLR4信号通路是介导LPS诱导的炎症反应的最重要通路^［27］。LIN可通过抑制TLR4信号通路预防骨关节炎炎症反应^［7］。TLR4是Toll样受体家族的一员，在免疫系统中起着关键作用，是介导LPS应答的主要受体。当LPS结合到TLR4上时，刺激TLR4与其下游分子MyD88相互作用，会引发一系列信号传导事件，其中的核心环节是NF-κB信号通路^［28］。NF-κB是一种转录因子，当TLR4被激活后，IκBα蛋白被磷酸化，从而增加p65的磷酸化，促进炎症过程^［29］。为了验证LIN是否在SCI后经此通路抑制小胶质细胞活化减轻炎症反应，本研究采用LPS构建体外神经炎症模型，结果显示，LPS-B组小胶质细胞中iNOS和COX2蛋白的表达增加，而LIN的干预能够降低蛋白的表达。本研究结果显示，LPS诱导的BV2细胞中IL-1β、TNF-α和IL-6促炎因子水平显著提高，同时提高了TLR4、MyD88蛋白表达水平和p65、IκBα的磷酸化水平；而LIN的干预显著逆转促炎因子和这些蛋白的高表达水平。以上结果表明LIN可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路从而抑制了LPS激活的小胶质细胞产生的炎症损伤，这为明确LIN抑制SCI炎症过程的潜在机制提供一项证据。

继发性SCI中炎症反应会持续破坏细胞功能并损伤脊髓中的神经元，导致长期的神经功能缺损^［30］。大量神经元的丧失是限制脊髓损伤后运动功能恢复的关键因素^{［31， 32］}。因此，抑制神经元凋亡成为脊髓损伤后神经再生的重要策略之一。本研究进一步探讨LIN对神经元凋亡的影响，以及在炎症环境下LIN对神经元的保护作用。Nissl染色结果显示，与SCI组相比，LIN组SCI小鼠脊髓前角残留的运动神经元数量明显增多。免疫荧光检测表明，相对于损伤组，LIN治疗后的SCI小鼠脊髓组织中cleaved-caspase3阳性神经元数量显著减少；Western blotting实验进一步证实，LIN显著降低损伤脊髓组织中促凋亡蛋白cleaved-caspase3和Bax蛋白的表达，并增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。因此，LIN的治疗显著降低了脊髓损伤后的神经元凋亡。进而，本研究通过BV2细胞与HT22细胞的共培养模型体外模拟脊髓损伤后炎症对神经元存活的影响。Western blotting结果显示，LIN的干预使得HT22细胞中抗凋亡蛋白（Bcl-2）表达显著增加，促凋亡蛋白（Bax、cleaved-caspase3）表达明显降低。由此可见，LIN可能通过抑制LPS诱导小胶质细胞活化介导的神经元凋亡减轻脊髓损伤后的继发性损伤。

本研究也存在局限性。本研究专注于探讨LIN的干预后小胶质活化对神经元凋亡的影响，但脊髓损伤后的病理机制繁复，尚需深入研究LIN的干预是否影响其它病理机制对神经元的作用效果。脊髓损伤的小胶质细胞活化的相关分子机制错综复杂，是否涉及其他分子机制仍待进一步探索。

综上所述，我们发现LIN可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路抑制小胶质细胞的活化，减少小胶质细胞所产生的炎症反应，进而抑制脊髓损伤后神经元的凋亡，最终改善SCI小鼠的运动功能。LIN作为一种具有多重药理作用的天然植物化合物，在SCI中显示出显著的神经保护效果，为SCI的治疗提供了新的方向。

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