ORY-1001靶向赖氨酸特异性去甲基化酶1下调胶质母细胞瘤Notch/HES1通路的表达并发挥抗肿瘤作用

ORY-1001 inhibits glioblastoma cell growth by downregulating the Notch/HES1 pathway via suppressing lysine-specific demethylase 1 expression

摘要

目的 探究赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）抑制剂ORY-1001对胶质母细胞瘤（GBM）的抑瘤作用和机制。 方法 从公开数据库（TCGA和HPA）下载相关数据，分析LSD1在GBM和正常脑中的表达情况。将24只雌性BALB/c小鼠，随机分为对照组与ORY-1001组，12只/组。肿瘤细胞种植后，每7 d 用400 µg/kg ORY-1001进行灌胃，检测肿瘤生长和动物生存时间，评估ORY-1001对GBM的抗肿瘤效应。检测A_{490 nm}值测定ORY-1001对GBM细胞活力的影响。Western blotting检测ORY-1001对LSD1表达的影响。利用慢病毒试剂，构建稳定敲降LSD1的GBM细胞（sh-LSD1），并通过动物成瘤实验评估沉默LSD1在活体动物内的作用以检测LSD1药物抑制获得的表型特异性。运用生物信息学方法分析与LSD1相关的基因及通路。Western blotting检测沉默LSD1及不同剂量ORY-1001治疗后Notch/HES1通路的表达。通过慢病毒转染，构建稳定过表达Notch1（oe-Notch1）的U87细胞。测定过表达Notch1后，ORY-1001对GBM动物模型肿瘤生长及生存时间的影响。通过ChIP揭示ORY-1001对Notch/HES1通路的具体调控机制。 结果 LSD1在GBM中高表达，并与患者的预后呈负相关（P<0.001）。ORY-1001治疗以及LSD1基因沉默都使荷瘤动物肿瘤负荷减轻（P<0.05）和生存时间延长（P<0.001），对多种GBM细胞的活力均表现出抑制作用（P<0.05）。ORY-1001呈剂量依赖性地抑制LSD1的表达。Notch通路富集了与LSD1抑制相关的差异基因，LSD1沉默及ORY-1001治疗后Notch/HES1通路表达显著下调（P<0.05），逆转了ORY-1001对GBM的抗肿瘤作用（P<0.05）。 结论 ORY-1001通过抑制GBM中LSD1的表达而下调Notch/HES1通路，并发挥抗肿瘤效应。

Abstract

Objective To explore the inhibitory effect ORY-1001, a lysine-specific histone demethylase 1 (LSD1) inhibitor, on growth of glioblastoma (GBM) and the underlying mechanism. Methods We analyzed LSD1 expressions in GBM and normal brain tissues based on data from TCGA and HPA databases. Female BALB/c mouse models bearing xenografts derived from U87 cells or cells with lentivirus-mediated LSD1 silencing or Notch overexpression were treated with saline or 400 µg/kg ORY-1001 by gavage every 7 days, and GBM formation and survival time of the mice were recorded. The effect of ORY-1001 on GBM cell viability was assessed, and its effect on LSD1 expression was analyzed with Western blotting. The genes and pathways associated with LSD1 were analyzed using bioinformatics methods. Western blotting and qRT-PCR were used to detect Notch/HES1 pathway expression after LSD1 silencing and ORY-1001 treatment. The impact of ORY-1001 on viability of U87 cells with Notch1 silencing or overexpression was assessed, and the regulatory effects of ORY-1001 on Notch/HES1 pathway were analyzed using chromatin immunoprecipitation assay. Results A high expression of LSD1 in GBM was negatively correlated with patient survival (P<0.001). ORY-1001 and LSD1 silencing obviously reduced tumor burden and prolonged the survival time of GBM-bearing mice. ORY-1001 treatment significantly inhibited the viability and dose-dependently decreased LSD1 expression in GBM cells, and such inhibitory effect of ORY-1001 was attenuated by LSD1 silencing. The Notch pathway enriched the differential genes related to LSD1, and Notch/HES1 pathway expression was significantly down-regulated after LSD1 silencing and ORY-1001 treatment. Notch1 overexpression significantly attenuated the anti-tumor effect of ORY-1001 on GBM. Mechanistically, ORY-1001 disrupted the interaction between LSD1 and the Notch pathway target genes including Notch3, HES1 and CR2. Conclusion ORY-1001 down-regulates the Notch/HES1 pathway by inhibiting LSD1 expression to suppress the growth of GBM in mice.

Graphical abstract

关键词

赖氨酸特异性去甲基化酶1 / 生信分析 / 胶质母细胞瘤 / Notch/HES1通路 / 癌症治疗

Key words

Lysine-specific histone demethylase 1 / bioinformatics analysis / glioblastoma / Notch/HES1 pathway / cancer treatment

胶质母细胞瘤，又称多形性胶母细胞瘤（GBM），是一种最常见且具有侵袭性的脑肿瘤，同时也是原发性脑肿瘤死亡的主要原因^［1］。尽管近年来针对GBM在手术治疗、放射治疗和化疗方面取得了一些进展，但患者的中位生存期仍仅为15个月^［2-4］。GBM的高死亡率及治疗选择的匮乏凸显了开发新治疗策略的迫切需求。大量研究表明，GBM中Notch信号通路的激活是细胞增殖和存活^{［5， 6］}，细胞命运决定^{［7， 8］}，肿瘤血管生成^［9］，以及治疗耐药性产生^{［10， 11］}的关键机制。阻断Notch通路可抑制GBM干细胞的体内及体外生长^［12］。但目前对GBM中Notch通路的研究尚未对GBM的临床治疗产生实质性影响。

赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）是一种依赖于黄素腺嘌呤二核苷酸的去甲基化酶^［13］，在多种类型的肿瘤中高度表达^［14-16］。LSD1调控多种生物学过程，包括上皮间充质转化、细胞分裂与增殖、干细胞发育以及恶性转化^{［17， 18］}。在临床前研究中，靶向LSD1在急性髓系白血病（AML）和小细胞肺癌（SCLC）模型中均显示出良好的治疗效果^{［19， 20］}，这引发了对LSD1抑制剂在GBM中的作用及机制的研究兴趣。目前，已有研究报道了LSD1失活对GBM的影响，并揭示了部分作用机制^［21］。然而，由于LSD1的广泛作用及GBM的复杂遗传改变和多种病理表型，针对LSD1在GBM中的作用和机制仍需进一步研究。

新型的LSD1抑制剂ORY-1001，其对LSD1的选择性显著高于LSD2和单胺氧化酶^［20］。通过生物信息学分析发现，在GBM中抑制LSD1后，部分差异基因（DEGS）富集在GBM中主要的促癌通路Notch上，预示靶向LSD1可能调控GBM中Notch途径的表达。本研究通过ORY-1001在体内和体外对GBM进行干预，探讨ORY-1001在GBM中的抑瘤作用，阐明其对Notch途径的调控作用及具体机制，为LSD1抑制剂用于GBM的治疗提供新的依据。

1 材料和方法

1.1 生信分析

从癌症基因组图谱（TCGA）数据库中检索与LSD1相关的基因表达数据。关于GBM患者的RNA-Seq数据从加州大学圣克鲁斯分校网站（https：//xena.ucsc.edu）下载。对数据集进行归一化处理和基于log2的转换，然后通过双样本t检验分析LSD1基因在GETx正常组织和胶质瘤组织中转录水平的差异。从人类蛋白质图谱（HPA）数据库（http：//www.proteinatlas.org）下载LSD1在正常和胶质母细胞瘤组织中的免疫组织化学图像，以比较LSD1在胶质母细胞瘤和正常脑组织中的翻译水平。使用R软件（v.3.6.2）和RStudio（v.1.2.1335）进行数据分析和处理。筛选与LSD1显著相关的差异基因的标准为R>0.5和P<0.01。采用Kaplan-Meier生存分析方法，探讨LSD1基因表达与GBM生存及预后的关系。使用包括ggplot2、heatmap和proc在内的R包进行额外的统计计算和图形可视化。P<0.05认为结果具有统计学意义。

1.2 细胞培养与慢病毒感染

胶质母细胞瘤细胞系U87、U251和A172购自上海生命科学研究院细胞库。在37 ℃、5%CO₂条件下，将细胞培养于含有10%胎牛血清（Sigma-Aldrich）和青霉素/链霉素（Sigma-Aldrich）的高糖Dulbecco改良Eagle培养基中。慢病毒干扰载体LV-LSD1-shRNA、LV-Notch1-shRNA和慢病毒过表达载体LV-Notch1购自和元生物技术（上海）股份有限公司。

1.3 LSD1酶活性测定

表观酶™LSD1脱甲基酶活性/抑制检测试剂盒（比色法）包含测量LSD1活性/抑制所需的所有试剂。在实验中，将二甲基化组蛋白H3-K4 LSD1底物均匀涂在96孔板上。活性LSD1与底物结合并去除底物上的甲基，去甲基化产物随后被特异性抗体识别。脱甲基化产物的比例或数量与酶活性成正比，通过测量A_490nm值来确定酶活性。

1.4 实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）

总RNA用Trizol试剂（Takara）提取，并使用PrimeScript RT Master Mix（Takara）逆转录为cDNA。根据制造商说明，使用SYBR Green Real-Time PCR Master Mix Kit（Takara）进行RT-qPCR反应。反应在LightCycler^®96 （Roche） 上进行，程序为95 ℃预变性30 s，然后95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。反应体积为20 µL，相对表达量以甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）进行归一化。定量聚合酶链式反应所用引物序列列于表1。

1.5 蛋白质印迹检测

根据制造商的说明，使用磷酸-酸性蛋白质提取试剂盒 （江苏凯基生物科技） 提取细胞蛋白质。用江苏凯根生物科技公司的BCA试剂盒检测细胞裂解液中的蛋白质浓度。蛋白质样品用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离，并转移到PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭1 h，分别与β-肌动蛋白（1∶1000）、LSD1（1∶1000）、Notch1（1∶1000）、HES1（1∶1000）、NICD （1∶1000）、CSL（1∶1000）、Cleaved Caspase-3（1∶500）等一抗在4 ℃孵育过夜。用TBST洗涤后加入二抗 （1∶1000），室温孵育1 h，TBST洗涤后加入化学发光液，使用化学发光仪显色并拍照。免疫印迹检测所用的蛋白，β-肌动蛋白、LSD1、Notch1、HES1、NICD、CSL均购自Cell Signaling Technology，Cleaved Caspase-3二抗购自Abcam。

1.6 裸鼠移植瘤模型的建立

4周龄的雌性BALB/c裸鼠从重庆医科大学动物实验中心购买，研究按照重庆医科大学的机构动物福利指导方针进行，并且已获得重庆医科大学附属大学城医院伦理委员会的批准（LL-202359）。根据不同的实验需求，设立以下3种不同的分组：（1）将BALB/c裸鼠随机分为Vehicle组和ORY-1001组，12只/组。种植肿瘤细胞后，ORY-1001组每7 d灌胃1次，使用400 µg/kg的ORY-1001 （Selleck）；而Vehicle组则以相同体积的生理盐水灌胃作为对照。（2）将BALB/c裸鼠随机分为sh-NC组和sh-LSD1组，10只/组。sh-LSD1组注射慢病毒，以降低U87细胞中LSD1的表达；而sh-NC组则注射sh-NC-U87细胞作为对照。（3）将BALB/c裸鼠随机分为CON组、ORY-1001组、oe-NC组、oe-Notch1组和oe-Notch1+ORY-1001组，10只/组。CON组和ORY-1001组注射正常对数期生长的U87细胞；oe-Notch1组和oe-Notch1+ORY-1001组注射慢病毒感染后过表达Notch1的U87细胞；oe-NC组则注射oe-NC-U87细胞作为对照。在种植了肿瘤细胞后，ORY-1001组和oe-Notch1+ORY-1001组每7 d使用Selleck生产的ORY-1001（400 µg/kg）进行灌胃1次，而其他组则以相同体积的生理盐水进行灌胃作为对照。肿瘤细胞以2×10⁶/100 µL注射到小鼠左肩皮下。每隔3 d测量皮下肿瘤的大小，并绘制肿瘤生长曲线。当皮下肿瘤体积达到150~200 mm³时，将小鼠随机分配到治疗组。在肿瘤移植后，监测不同组动物的生存情况，并绘制生存曲线。当移植瘤体积接近1500 mm³时，采用颈椎脱臼的方法对小鼠实施安乐死，并解剖皮下肿瘤。肿瘤体积计算公式如下：V=X×Y²/2（其中V为肿瘤体积，X为长径，Y为短径）。在喂食过程中，若小鼠处于濒死状态或体质量明显下降，将实施安乐死。

1.7 细胞活力测定

用胰酶消化细胞，制备细胞悬液。在不同剂量（0、4、8、16 nmol）ORY-1001下，测定不同细胞的细胞活力。将悬浮细胞接种于96孔板中（1×10⁴/100 µL），3孔/组。与上述化合物孵育24 h后，每孔加入10 µL MTT （5 mg/mL），37℃，5%CO₂孵育4 h，上清液离心后加入150 μL/孔的二甲基亚砜。用Bio-Tek酶平板分析仪 （Heaples） 测量A_490nm值。

1.8 染色质免疫共沉淀

按照Millipore说明书进行实验。首先，将16 nmol的ORY-1001处理过的U87细胞置于1%甲醛中，室温下固定10 min，随后加入甘氨酸。接着，用含有蛋白酶抑制剂的冷PBS洗涤细胞，并将其重新悬浮于裂解液缓冲液中。离心后，加入蛋白G-琼脂糖磁珠，4 ℃孵育后再离心。取上清液，分别与抗核糖核酸聚合酶II抗体、正常小鼠免疫球蛋白和LSD1抗体在4 ℃孵育过夜，随后加入蛋白G-琼脂糖凝胶，4 ℃孵育1 h，低温离心后依次用低盐、高盐、LiCl和TE缓冲液洗涤，再孵育后离心。接着，加入洗脱缓冲液，常温反应30 min。同时，在溶液中加入相同体积的洗脱缓冲液，并保持在4 ℃。随后，将DNA-protein复合物与5 mol NaCl在65 ℃的洗脱缓冲液中孵育4 h，在37 ℃条件下加入1 µL的RNase A，继续在65 ℃孵育4 h，然后加入1 µL proteinase K、4 µmol EDTA和8 µL 1mol/L Tris-HCl，在45 ℃孵育1 h。最后，按照qRT-PCR的方法，使用苯酚和乙醇提取DNA。ChIP所用的启动子引物序列见表2。

1.9 统计分析

所有实验至少重复3次，实验结果用SPSS28.0软件进行单因素方差分析或t检验。结果以均数±标准差表示，P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 药物抑制LSD1延长GBM动物模型的存活时间

数据分析显示，在胶质母细胞瘤（GBM）中，LSD1 mRNA的转录水平显著上调（P<0.001，图1A）。从人类蛋白质图谱HPA数据库下载的数据表明，在GBM中，LSD1的表达水平高于正常脑组织（图1B）。Kaplan-Meier生存分析显示，LSD1高表达的患者的生存时间显著缩短（图1C，P<0.001）。ROC曲线显示LSD1诊断GBM的灵敏度和特异度分别为81.3%和81.0%，曲线下面积（AUC）为87.3%（图1D）。利用BALB/c裸鼠建立的GBM动物模型显示，与对照组相比，ORY-1001抑制了肿瘤的生长（P<0.05，图1E、F）。当对照组小鼠全部死亡时，ORY-1001处理组小鼠存活率为87.5%（P<0.001，图1G）。在治疗期间，没有观察到治疗组额外的疼痛症状，体质量与对照组无明显差异（图1H）。对于GBM细胞系U87、U251和A172，ORY-1001显示明显的细胞毒性作用（P<0.05，图1I~K）。LSD1酶活性测定结果显示ORY-1001以剂量依赖性的方式抑制LSD1活性（P<0.05，图1L）。

2.2 LSD1基因靶向反映LSD1对GBM的药理抑制作用

Western blotting结果显示，与对照组相比，不同剂量的ORY-1001 （4、8、16 nmol） 能降低U87细胞LSD1的表达，降幅分别为12.76%、36.17%和76.58%（P<0.05，图2A、B）。随着ORY-1001剂量的增加（4、8、16 nmol），H3K4me2的表达分别增加了17.89%、25.83%和33.65%（P<0.01，图2C、D）。qPCR结果显示LSD1的沉默效率（图2E），选择敲低效率最高的sh-LSD1-1进行后续实验。与sh-NC组相比，LSD1的表达降低了60%（P<0.01，图2F~G），sh-LSD1细胞显示出细胞活力降低（P<0.01，图2H）。Western blotting结果显示，LSD1沉默后，Cleaved Caspase-3的表达明显增加（P<0.01，图2I、J）。细胞活力检测表明，ORY-1001对sh-LSD1组的抑制活性降低（P<0.05，图2K），在GBM-U87动物模型中，与对照组相比，注射sh-LSD1细胞的小鼠肿瘤体积较小（P<0.05，图2L），生存时间较长（P<0.001，图2M）。在死亡时，LSD1沉默的肿瘤的LSD1mRNA的表达量与对照组无统计学意义（图2N）。

2.3 靶向LSD1影响GBM中Notch/HES1信号通路

将LSD1沉默后测序的数据进行分析处理并可视化。对LSD1沉默后的测序数据进行了分析处理，富集了与LSD1表达显著相关的基因（图3A、B）。对差异表达基因（DEGs）进行了功能富集分析，结果显示一些DEGs富集在Notch途径（图3C）。接着进行了qPCR和Western blotting实验证明LSD1沉默后Notch1和Notch下游靶标HES1的表达下降（图3D、E）。ORY-1001呈剂量依赖性地抑制Notch1的表达（P<0.05，图3F），与对照组相比，ORY-1001处理导致Notch1及其下游蛋白NICD、CSL和HES1的表达呈下降趋势（图3G）。16 nmol ORY-1001处理对U87细胞Notch1、NICD、CSL和HES1的下降率分别为39.67%、41.32%、64.35%和51.23%（P<0.001，图3H）。

2.4 ORY-1001的抗肿瘤作用依赖于LSD1对Notch/HES1通路的调节

Western blotting结果显示，在沉默Notch1后，与对照组相比，其表达降低了79.5%（P<0.01，图4A）。细胞活力测定表明ORY-1001对sh-Notch1组表现出较差的抑制活性（P<0.05，图4B）。而在过表达Notch1后（图4C、D），Notch通路主要下游分子HES1、HES4、HEY1和HEY2的表达显著增加（图4E，P<0.05），ORY-1001对过表达Notch1的GBM细胞活力没有明显的抑制作用（图4F）。动物实验结果显示oe-Notch1组和oe-Notch1+ORY-1001组的肿瘤生长快于其他处理组（P<0.05，图4G）。与ORY-1001组相比，oe-Notch1+ORY-1001组的肿瘤生长速度更快，肿瘤负荷更重（P<0.001，图4G），同时生存时间显著减少（P<0.001，图4H）。

2.5 ORY-1001影响LSD1与GBM中Notch靶基因启动子区域的结合

ChIP分析结果显示16 nmol ORY-1001作用于GBM细胞24 h后，LSD1与Notch3、HES1和CR2启动子的结合能力显著降低（P<0.05，图5），而DTX1无明显变化。Notch3的结合位点位于转录起始点下游3000 bp，HES1位于转录起始点的上游2200 bp和下游2600 bp，CR2位于转录起始点的下游21 000 bp。

3 讨论

GBM是最具治疗挑战性的肿瘤之一，在当前的治疗方案下，其复发率和死亡率居高不下^［22］，因此急需改进GBM的治疗方法。通过对TCGA和HPA数据库的分析，本研究发现LSD1在GBM中高度表达，并且与患者的预后呈负相关（P<0.001），这提示LSD1可能是治疗GBM的一个潜在靶点。在这项研究中，LSD1抑制剂ORY-1001在多种GBM细胞系中均表现出对细胞活力的抑制效果（P<0.05），并且呈剂量依赖性地下调LSD1的表达（P<0.05）。在GBM动物模型中，ORY-1001有效地减轻了肿瘤负荷（P<0.05），提高了存活率 （P<0.001），且该药物没有明显的毒性迹象。为了证明ORY-1001是通过抑制LSD1产生的抗肿瘤效应，对LSD1基因进行了沉默，结果显示沉默LSD1后，ORY-1001对sh-LSD1组细胞活力的抑制作用下降（P<0.01），表明ORY-1001对细胞活力的抑制依赖于对LSD1的调节。同时，sh-LSD1组Cleaved Caspase-3的表达显著上升（P<0.01），Caspase-3是细胞凋亡的生物标志物，Cleaved Caspase-3是Caspase-3的活化形式^［23］，表明其促进了细胞的凋亡。在动物成瘤实验中，LSD1沉默显著减小了肿瘤的体积（P<0.05），延长了荷瘤小鼠的寿命（P<0.001）。基因沉默的结果验证了ORY-1001药物抑制获得的表型特异性。

通过对LSD1沉默后的整体转录图谱进行生物信息学分析，发现一些差异基因富集在Notch通路，这提示Notch信号通路可能受到LSD1的调控。在GBM的发生发展中，Notch通路扮演着关键角色，特别是Notch1^{［24， 25］}。已有研究表明Notch1参与了GBM生长和凋亡的多个途径^［26-29］。本研究发现，在沉默LSD1后，Notch1及HES1的表达明显下降，同时ORY-1001抑制LSD1可导致Notch通路的关键标志物，如Notch1及NICD、CSL和HES1迅速且显著地减少（P<0.05），这表明ORY-1001可以通过靶向LSD1对Notch/HES1通路形成有效的抑制。与对照组相比，ORY-1001对sh-Notch1组及oe-Notch1组细胞活力的抑制作用明显下降（P<0.05），这提示Notch通路与ORY-1001的抑瘤效应相关。在动物成瘤实验中，ORY-1001的抗肿瘤作用在过表达Notch1后被逆转（P<0.001），表明ORY-1001的抗肿瘤作用可能需要Notch/HES1通路的下调。然而，即使Notch通路的抑制被阻止，相较于oe-Notch1组，ORY-1001仍然延长了oe-Notch1+ORY-1001小鼠的存活时间（P<0.05）。这表明除了Notch途径外，可能还有其他通路或机制影响ORY-1001对GBM的抗肿瘤作用，这需要在今后的研究中进一步深入探讨。

ChIP分析结果证明了ORY-1001对LSD1与Notch3、HES1和CR2启动子的结合的干扰，这揭示了LSD1通过结合Notch靶基因的启动子区域来调节Notch信号通路的机制。在本研究中，ORY-1001的抗肿瘤作用依赖于LSD1对Notch信号通路的抑制。已有大量研究表明，Notch信号在癌症中扮演着自主和非自主的角色，包括肿瘤抑制和致癌^［30］。抑制LSD1可以促进或抑制不同肿瘤中的Notch信号通路^{［31， 32］}，这或许有助于解释靶向LSD1在不同肿瘤治疗中的作用差异^［33］。LSD1在GBM的特异性富集可以区分肿瘤和正常脑组织，为LSD1抑制剂在GBM治疗中的应用提供了可靠依据。考虑到LSD1在体内的广泛表达及其在几个生理过程中的重要作用^［34-36］，对于在临床环境中使用LSD1靶向治疗，还需要进行更深入和全面的讨论。此外，使用免疫缺陷的动物模型，可能限制了对GBM细胞与炎症环境之间相互作用的描述。未来，通过利用免疫活性的GBM模型，研究LSD1抑制对肿瘤免疫的影响将是非常重要的。

综上所述，本研究表明ORY-1001或shRNA阻断LSD1信号可以有效地抑制GBM的生长，提高存活率。这种抑制作用主要是通过下调Notch/HES1信号通路来实现的。因此，本研究为LSD1抑制剂用于GBM治疗提供了理论依据。

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基金资助

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