异功散通过调控肠道微生物改善痴呆症模型大鼠的认知下降

Yigong San improves cognitive decline in a rat model of Alzheimer's disease by regulating intestinal microorganisms

摘要

目的 研究异功散对脂多糖（LPS）诱导认知下降大鼠学习记忆能力的影响，并通过肠道微生物分析其作用机制。 方法 将40只SD大鼠随机分成空白组、模型组、盐酸多奈哌齐组（1.17 mg/kg）和异功散高剂量组（5.25 g/kg）、异功散低剂量组（2.63 g/kg），8只/组。各组灌胃给予相应药物或纯水干预24 d后，除空白组腹腔注射生理盐水外，其余各组每天腹腔注射LPS（0.5 mg/kg）造模，并开始水迷宫评价其学习记忆能力改变；HE染色观察海马病理形态学变化；16S rRNA检测各组肠道微生物物种变化；酶联免疫吸附测定法检测脑组织和血清中IL-6、TNF-α和IL-1β水平。 结果 与对照组比较，模型组大鼠第5天逃避潜伏期明显延长（P<0.01），穿越平台次数、平台象限活动累积时间和平均游泳速度均下降，其中穿越平台次数具有统计学差异（P<0.05）；海马区可见神经细胞排列散乱、神经细胞变性或坏死等病变且细胞损伤病理评分明显升高（P<0.01）；脑组织和血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平均明显升高（P<0.01）；Alph多样性评价指标如ACE、Chao1等均明显升高（P<0.05），在科水平的Prevotellaceae等物种丰度明显降低而Desulfovibrionaceae等物种丰度则升高。与模型组比较，异功散组第5天的逃避潜伏期均明显缩短（P<0.01），高剂量组穿越平台次数具有统计学差异（P<0.05）；海马区神经细胞变性或坏死等病变均有好转且细胞损伤病理评分明显降低（P<0.05）；脑组织和血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平也均明显下降（P<0.01）；Alph多样性评价指标如ACE、Chao1等均明显降低（P<0.05），在科水平的Prevotellaceae等物种丰度明显升高而Desulfovibrionaceae等物种丰度则降低。 结论 异功散改善认知下降大鼠的学习记忆能力和海马病理形态学等病变可能与调控肠道Prevotellaceae等的丰度，以及信号转导、辅因子和维生素的代谢等代谢途径有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of Yigong San (YGS) on learning and memory abilities of rats with lipopolysaccharide (LPS)‑induced cognitive decline and explore its possible mechanism in light of intestinal microbiota. Methods Forty SD rats were randomly divided into control group, model group, donepezil (1.3 mg/kg) group, and high-dose (5.25 g/kg) and low-dose (2.63 g/kg) YGS treatment groups. After 24 days of treatment with the corresponding drugs or water by gavage, the rats in the latter 4 groups received an intraperitoneal injection of LPS (0.5 mg/kg) to establish models of Alzheimer's disease (AD). Water maze test and HE staining were used to evaluate the changes in learning and memory abilities and pathomorphology of the hippocampus. The changes in gut microbial species of the rats were analyzed with 16S rRNA sequencing, and the levels of IL-6, TNF-α, and IL-1β in the brain tissue and serum were detected using ELISA. Results Compared with the AD model group, the YGS-treated rats showed significantly shortened escape latency on day 5 after modeling, reduced neuronal degeneration and necrosis in the hippocampus, lowered pathological score of cell damage, and decreased levels IL-6, TNF-α and IL-1β in the brain tissue and serum. The YGS-treated rats showed also obvious reduction of Alpha diversity indicators (ACE and Chao1) of intestinal microbiota with significantly increased abundance of Prevotellaceae species at the family level and decreased abundance of Desulfovibrionaceae, which were involved in such metabolic signaling pathways as cell community prokaryotes, membrane transport, and energy metabolism. Conclusion YGS improves learning and memory abilities and hippocampal pathomorphology in AD rat models possibly by regulating the abundance of intestinal microbial species such as Prevotellaceae to affect the metabolic pathways for signal transduction, cofactors, and vitamin metabolism.

Graphical abstract

关键词

异功散 / 脂多糖 / 认知下降 / 肠道微生物

Key words

Yigong San / lipopolysaccharide / cognitive decline / intestinal microbiota

水足髓充则元神清湛而强记不忘矣（《灵枢·经脉》）等诸多中医论述强调了津液对认知功能的重要影响。津液以水分为主体，含有大量营养物质，其代谢活动主要由脾、胃、肠等多个脏腑共同参与^［1］，其中胃肠是津液生产的主要脏腑，而脾是津液输布全身的首要执行者，即津液代谢异常主要与这些脏腑功能有关。

现代研究发现胃肠道，尤其是肠道中存在数量庞大的微生物，这些微生物及其代谢产物在痴呆症如阿尔茨海默病（AD）^［2-4］等疾病过程中扮演重要角色。例如，肠道微生物本身可以激活小胶质细胞或星形胶质细胞，进而引起Aβ或tau病变；肠道微生物的代谢物如短链脂肪酸、脂多糖和氨基酸等均可进入血液循环，通过直接或间接作用参与Aβ或tau病变^［4］。值得注意的是，这些代谢产物均属于津液范畴，故对肠道微生物种群变化的检测可在一定程度上反映外周津液的变化规律。

异功散是调理脾胃的经典古方，方中诸药均具有益脾和生津液功效。课题组前期研究显示异功散能够明显改善D-半乳糖诱导的快老化小鼠学习记忆能力和海马病理形态学改变^［5］，但这未体现它调理脾胃、生津液的功能。基于此，本研究以脂多糖诱导大鼠为研究载体，通过分析异功散干预前后，肠道微生物种群变化来间接阐释其调控外周津液变化而发挥抗痴呆的作用机制，可为其他调理脾胃方剂治疗痴呆症提供思路和借鉴。

1 材料和方法1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

40只SPF级雄性SD大鼠，体质量180~220 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号SCXK（湘）2019-0004，动物合格证号：430727230100232662。本研究动物实验由重庆市中药研究院实验动物福利伦理审查委员会审查批准（YHS2022-06）。

1.1.2 药品与试剂

脂多糖（Sigma-Aldrich），盐酸多奈派齐片（卫材［中国］药业有限公司），大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA试剂盒（欣博盛生物科技有限公司）。

1.1.3 仪器

MD-DG30E101煎药壶（广东美的生活电器制造有限公司），VGT-2013QT超声波清洗机（广东图特超声股份有限公司），PS-60AL超声仪（深圳市雷德邦电子有限公司），Morris水迷宫视频分析系统（安徽正华仪器设备有限公司），HHZK-6恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司），UPR-Ⅱ-20L超纯水机（四川优普超纯科技有限公司），Vanquish超高液相系统和Orbitrap Exploris 120高分辨质谱仪（Thermo Fisher Scientific），BSA124S-CW分析天平（Sartorius），Heraeus Pico 17离心机（Thermo Electron），KE-5F-3D三维冷冻研磨仪（武汉塞维尔生物科技有限公司），ReadMax 1200光吸收全波长酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司），R5001E小动物麻醉剂（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 异功散质量控制及剂量

异功散饮片来源、制备和质量控制同前期研究^［5］，根据《脾胃论》《小儿药证直诀》中异功散各药味用量比例和《中国药典》中各药用量范围确定5味药均为9 g，即人日用量总计45 g。以人用量的7倍剂量为大鼠的临床等效剂量（5.25 g/kg^{），降低1倍为低剂量（2.63 g/kg）。}

1.2.2 动物分组与给药

根据体质量将SD大鼠随机分为空白组（Control）、模型组（Model）、盐酸多奈哌齐组（Donezepil，1.17 mg/kg）、异功散高（YGS-H，5.25 g/kg）组和低（YGS-L，2.63 g/kg）剂量组，8只/组。连续灌胃给予相应药物4周（空白组和模型组给予等体积纯水）。灌胃第4周开始进行行为学评价，在每次行为学评价开始前4 h，除空白组外，各组大鼠均接受腹腔注射LPS液（0.5 mg/kg）诱导认知下降大鼠模型，而空白组大鼠接受腹腔注射等体积的生理盐水。

1.2.3 Morris水迷宫

给药第25~30天采用Morris水迷宫实验评价各组大鼠学习记忆能力变化^［5］。以隐藏平台实验的逃避潜伏期，空间探索实验的平台象限停留时间、穿越平台次数和平均游泳速度为评价指标。

1.2.4 HE染色

水迷宫结束后24 h异氟烷麻醉大鼠，腹主动脉采血后处死大鼠，切取左半脑置于4%的多聚甲醛中固定，常规HE染色后观察海马区的病理形态学变化，并对损伤的神经细胞评分^［6］。

1.2.5 16S RNA测序及分析

将从各组收集的大鼠粪便和小鼠进行16S rRNA高通量测序。从每组粪便中提取细菌的总RNA，取RNA模板10 ng，根据16SV3+V4区序列，并使用带Barcode的特异引物（引物序列为F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA；R：GGACTACHVG GGTWTCTAAT）进行PCR扩增、产物纯化、PCR产物定量和均质化，构建测序文库，上机测序，选取OTUs代表性序列，通过Mothur法与SILVA SSUr RNA数据库结合对个样品进行物种注释，并获得分类学信息。根据得到的检测结果，分析各组大鼠的肠道菌群异同点。

使用Trimmomatic（0.33版）对原始数据进行质量过滤，而Cutadapt（1.9.1版）用于识别和去除引物序列以获得干净的读数。然后使用Usearch v10软件通过叠加拼接每个样本的干净读数，并根据不同区域的长度范围过滤拼接数据。最后，使用QIME2 2020.6软件中的dada2方法对数据进行去噪并去除嵌合序列，获得最终有效数据（非嵌合读数）。SILVA（版本138，http：//www.arb-silva.de）作为参考数据库，使用朴素贝叶斯分类器对分类学中的特征序列进行注释，获得并计算出每个特征对应的物种分类信息以及每个样本群落在每个级别的组成。QIME2软件（https：//qiime2.org/）用于生成不同分类级别的物种丰度表。用R软件分析α多样性指数的组间差异，用主坐标分析（PCoA）和非度量多维标定法（NMDS）分析进行β多样性分析。使用PICRUSt2将特征序列（16S rRNA）与微生物基因组数据库参考序列对齐（aliign）构建进化树，找到特征序列的“最近物种”，并根据已知物种的基因种类和丰度信息预测未知物种的基因信息，从而结合基因的KEGG通路信息预测整个群落的通路情况^［7］。

1.2.6 ELISA检测

根据各试剂盒说明书要求制备脑组织样本匀浆液，然后按照说明书要求依次测量TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.2.7 统计学分析

计量资料表示为均数±标准差，Morris水迷宫的逃避潜伏期组间差异采用双因素方差分析，其余测量数据组间差异使用单因素方差分析进行分析；齐性方差采用Tukey多重比较分析，异质方差采用Tamhane T2多重比较分析。P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 异功散对LPS诱导痴呆模型大鼠学习记忆能力的影响

在隐藏平台实验中，随着训练时间的增加各组大鼠的逃避潜伏期均显著下降［F（4，170）=287.7，P<0.0001］，各组间大鼠逃避潜伏期差异也有统计学意义 ［F （4，170）=11.62，P<0.0001］（图1A、B）。与空白组比较，模型组大鼠第5天的逃避潜伏期明显增加［F（4， 170）=9.076，P<0.0001］；与模型组比较，异功散高剂量组［F（4，170）=6.483，P=0.0022］和低剂量组［F（4，170）=6.946，P=0.0006］ 大鼠第5天的逃避潜伏期均缩短。在空间探索实验中（表1、图1C），与空白组比较，模型大鼠的穿越平台次数、平台象限累积时间和平均游泳速度均下降，其中前两者的差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，异功散高、低剂量组大鼠的穿越平台次数、平台象限累积时间和平均游泳速度均升高，其中高剂量组穿越平台次数差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.2 异功散对LPS诱导痴呆模型大鼠海马病理形态学的影响

与空白组比较，模型组大鼠海马神经细胞多散乱排列（图2，绿色箭头），细胞层内细胞空缺较多、细胞间间隙变大（黄色箭头），较多神经细胞体积变小、变性或死亡（红色箭头），神经损伤病理评分明显升高（P<0.01）；与模型组比较，异功散高、低剂量组大鼠海马神经细胞排列相对整齐，可见细胞层内少量细胞缺少，偶可见个别神经细胞体积缩小、变性或死亡，神经损伤病理评分均明显降低（P<0.05）。

2.3 异功散对LPS诱导痴呆大鼠脑组织和血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量变化

与空白组比较，模型组大鼠脑组织和血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6含量均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，异功散高剂量组大鼠脑组织和血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6含量均均明显降低（P<0.05，图3）。

2.4 异功散对LPS诱导痴呆大鼠肠道微生物多样性的影响

与空白组比较，模型组大鼠肠道微生物的Alpha多样性指数-ACE指数、Chao1指数、Shannon指数和PD_whole_tree均升高，其中ACE指数、Chao1指数和PD_whole_tree的差异均具有统计学意义（P<0.05，图4A）；与模型组比较，异功散高剂量组大鼠的ACE指数、Chao1指数、Shannon指数和PD_whole_tree指数均明显降低（P<0.05）。PCoA和NMDS分析图（图4B、C）中不同颜色的点表示不同组的样本，点与点之间的距离表示差异程度，在坐标图上距离越近的样品，相似性越高。PCoA分析图各组间样本距离相对近，相似性较高；NMDS分析stess等于0.1671。

2.5 各组肠道微生物丰度变化结果

在门水平（图5A），与空白组比较，模型组大鼠肠道Firmicutes、Desulfobacterota、Campylobacterota等物种丰度明显升高，而Bacteroidota、Actinobacteriota等物种丰度则明显降低，且其Firmicutes/Bacteroidota丰度比值明显升高（2.67±0.42 vs 1.56±0.56，P<0.01）；与模型组比较，异功散高剂量组大鼠肠道Firmicutes、Desulfobacterota、Campylobacterota物种丰度明显降低，而Bacteroidota、Actinobacteriota物种丰度则明显升高，且其Firmicutes/Bacteroidota丰度比值明显降低（1.93±0.34 vs 2.67±0.42，P<0.01）。

在目水平上（图5B），与空白组比较，模型组大鼠肠道Lactobacillales、Lachnospirales、Desulfovibrionales物种丰度升高，而Bacteroidales、Oscillospirales、Christensenellales物种丰度降低；与模型组比较，异功散组大鼠肠道的Lactobacillales、Lachnospirales、Desulfovibrionales物种丰度降低而其Bacteroidales、Oscillospirales和Clostridia_UCG_014物种丰度升高。

在科水平上（图5C、D），模型组大鼠肠道Prevotellaceae、Ruminococcaceae和Corynebacteriaceae的物种丰度低于正常组（P<0.05），而其Lachnospiraceae、Peptococcaceae、Desulfovibrionaceae和Anaerovo-racaceae的物种丰度则明显高于正常组（P<0.05）；异功散组大鼠肠道Prevotellaceae、Ruminococcaceae和Corynebacteriaceae的物种丰度高于模型组（P<0.05）而Lachnospiraceae、Peptococcaceae、Desulfovibrionaceae和Anaerovoracaceae的物种丰度则明显低于模型组（P<0.05）。

2.6 功能基因预测分析

目水平的微生物与衰老、氨基酸代谢、其他次生代谢产物的生物合成、碳水化合物代谢、细胞生长和死亡、细胞运动性等43个信号通路有关（图6A）。

空白组与模型组之间的最优差异代谢途径（前10）主要包括信号转导、辅因子和维生素的代谢、内分泌系统、细胞群落-原核生物、内分泌和代谢疾病等，而模型组与异功散组的前10条代谢途径主要为细胞群落-原核生物、消化系统、膜传输、能量代谢、信号转导、神经系统等，其中信号转导、辅因子和维生素的代谢、膜传输、细胞运动性等7条途径为共同代谢途径（图6B）。

3 讨论

中医认为津液代谢异常所致的痰饮血瘀久酿形成的浊毒损伤脑络（毒损脑络）是痴呆症发生发展的核心病机^{［8， 9］}。而共存于人体肠道中的微生物对人体津液代谢具有“双刃剑”效应，如肠道微生物产生的短链脂肪酸可干扰有毒可溶性Aβ聚集体的形成等而预防痴呆症^{［10， 11］}；产生的毒性产物如LPS则通过非正常激活小胶质细胞等而促进或加重痴呆症的发生发展^［12］。LPS腹腔注射诱导也成为痴呆症常用模型，其不仅表现出神经炎症，还呈现出明显的认知障碍^［13-16］。本研究的水迷宫实验结果显示，模型组大鼠第5天的逃避潜伏期长于空白组、穿越平台次数和平台象限累积活动时间显著降低，提示模型动物存在明显的认知障碍，这与上述文献报道一致。同时，HE染色观察到其海马区神经细胞变性或坏死等病变以及血清何脑组织中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显升高。经过异功散干预后可见上述指标均明显回调，提示异功散能够通过调控LPS诱导所致的认知下降及其相关神经炎症病变。

有研究发现肠道微生物及其代谢产物在维护肠道屏障的完整性、调节和促进免疫系统形成功能、调控神经系统活动等生理过程中扮演重要角色^{［2， 17-19］}。据报道人体肠道中有1000多种类约10¹⁴个微生物，其中Firmicutes和Bacteroidota是优势菌门，而Firmicutes多为有害菌而Bacteroidota多为有益菌，Firmicutes/Bacteroidota比值变化常被用于表征肠道菌群紊乱^［20］。本研究发现异功散能够明显改善模型大鼠肠道物种的丰富度和多样性变化，降低其肠道Firmicutes/Bacteroidota比值的升高，这与文献报道一致^［21］，提示异功散能够改善LPS诱导的肠道菌群紊乱。在目/科水平，异功散能够降低模型大鼠肠道Desulfovibrionales/Desulfovibrionaceae的丰度而升高Bacteroidales/Prevotellaceae的丰度，这种变化在多种痴呆模型动物被证实^{［19， 22， 23］}。其中，Bacteroidales是人体短链脂肪酸（SCFAs）的产生菌^{［24， 25］}，Prevotellaceae自然也是SCFAs的产生菌^{［26， 27］}。同时，有研究发现Prevotellaceae在APOE3/E3携带者体内的水平高于其他基因型亚群，而Ruminococcaceae的水平与APOE2/E3基因型相关^［28］。Prevotellaceae的减少影响粘蛋白的合成并增加粘膜通透性，使局部和全身暴露于细菌内毒素，这可能导致α-突触核蛋白在结肠中的积聚^{［29， 30］}，进而可通过迷走神经入脑而参与帕金森氏病和AD等神经退行性疾病的发生^{［28， 31］}。有意思的是，Ruminococcaceae也参与SCFAs的产生^［27］，它的耗竭与炎症有直接关系^［32］。本研究中，异功散能够提高Prevotellaceae和Ruminococcaceae相对丰度，提示异功散可能通过调控它们的丰度而维持粘膜通透性和抑制炎症。此外，值得强调的是，Peptococcaceae和Lachnospiraceae也是SCFAs的生产菌^［33］。但前者在本研究模型大鼠肠道的相对丰度升高，这与其在APP/PS1小鼠肠道内的丰度变化一致^［34］；Lachnospiraceae在本研究模型大鼠肠道的丰度变化与AD患者体内的丰度变化相反^{［35， 36］}，这可能与种属差异和微生物种群本身的竞争性生长有关。

肠道微生物丰度的变化直接影响它代谢产物如SCFAs等的含量变化，这将导致机体相关代谢发生变化。本研究通过功能基因预测分析发现目水平的微生物与衰老、氨基酸代谢、其他次生代谢产物的生物合成、细胞生长和死亡等43个信号通路有关。其中，衰老被认为是痴呆症的主要风险因素^［37］；谷氨酸、γ-氨基丁酸等氨基酸都是重要的神经递质，在痴呆症的疾病过程中也占据重要作用^{［38， 39］}。通过对不同组间的差异代谢通路比较发现，信号转导、辅因子和维生素的代谢、膜传输、细胞运动性等优势代谢途径为3组的共同代谢途径，这提示异功散可能通过调控这些代谢通路而改善痴呆症的神经病变，但这需要进一步的实验验证。

综上，本研究表明异功散能够明显改善LPS诱导的大鼠血清和脑内TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高、海马神经细胞损伤及认知下降，其作用可能与调控不同水平肠道微生物的丰度及其相关代谢物有关，可为异功散通过调控外周津液代谢而治疗痴呆症提供一定的实验依据。

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基金资助

重庆市技术创新与应用发展专项重点项目(cstc2021jscx-dxwtBX0012)

重庆市自然科学基金项目博士后项目(cstc2021jscx-bshX0054)

重庆市中药研究院基本科研业务费项目(jbky20210003)

湖南省卫健委一般指导课题项目(D202313058007)

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