茵陈蒿汤治疗肝纤维化的核心功能成分群以及潜在通路

Analysis of core functional components in Yinchenhao Decoction and their pathways for treating liver fibrosis

摘要

目的 基于网络药理学和体外实验分析验证茵陈蒿汤（YCHD）治疗肝纤维化（HF）的核心功能成分群（CFCG）以及潜在通路。 方法 在DisGeNET、Genecards、CMGRN和PTHGRN提取了HF的PPI数据，使用Cytoscape 3.9.1构建权重网络。从TCMSP中收集茵陈蒿汤所有化学成分，用PreADMET Web服务器和SwissTargetPrediction选择茵陈蒿汤潜在活性成分和靶点。构建融合模型获取功能效应空间并评估有效蛋白，得到CFCG，再进一步对所有目标进行GO和KEGG通路富集分析。细胞实验：体外培养人肝星状细胞（LX-2），分别设置空白组（不加TGF-β1刺激）、对照组NC（20 ng/mL TGF-β1刺激）和化合物组（0、50、100、200 μmol/L），CCK-8实验检测药物敏感性，qPCR实验检测化合物对LX-2中Ⅰ型胶原Α1（COL1A1）的影响，Western blotting实验分析评估化合物在TGF-β1刺激下对LX-2中潜在通路的影响，验证潜在治疗机制。 结果 分析得到1005个致病基因，茵陈蒿汤潜在活性成分和靶点分别有226个和1529个，核心功能成分群有52个。根据模型计算结果，选取得分最高的乙酸苄酯、香草酸、苯甲酸甲酯、虎杖苷、月桂酸、阿魏酸进行CCK-8验证发现在200 μmol/L内无细胞毒性；在qPCR实验中，与TGF-β1组相比苯甲酸甲酯、虎杖苷、月桂酸和阿魏酸能够抑制TGF-β1诱导的LX-2活化。GO和KEGG分析及Western blotting验证发现，这4种成分在200 μmol/L浓度时对PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、P38 MAPK、p-P38 MAPK有不同程度的抑制。 结论 茵陈蒿汤抗肝纤维化可能是其中的乙酸苄酯、香草酸、苯甲酸甲酯、虎杖苷、月桂酸、阿魏酸等成分通过抑制PI3K-AKT和MAPK通路实现的。

Abstract

Objective To analyze the core functional component groups (CFCG) in Yinchenhao Decoction (YCHD) and their possible pathways for treating hepatic fibrosis based on network pharmacology. Methods PPI data were extracted from DisGeNET, Genecards, CMGRN and PTHGRN to construct a weighted network using Cytoscape 3.9.1. The data of the chemical components in YCHD were obtained from Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP), and the potential active components and targets were selected using PreADMET Web server and SwissTargetPrediction. A fusion model was constructed to obtain the functional effect space and evaluate the effective proteins to identify the CFCG followed by GO and KEGG pathway enrichment analyses for all the targets. In cultured human hepatic stellate cells (LX-2 cells), the cytotoxicity of different compounds in YCHD was tested using CCK-8 assay; the effects of these compounds on collagen α1 (Col1a1) mRNA expression and the pathways in 20 ng/mL TGF-β1-stimulated cells were analyzed using RT-qPCR and Western blotting. Results A total of 1005 pathogenic genes, 226 potential active components and 1529 potential targets in YCHD and 52 potential targets of CFCG were obtained. Benzyl acetate, vanillic acid, clorius, polydatin, lauric acid and ferulic acid were selected for CCK-8 verification, and they all showed minimal cytotoxicity below the concentration of 200 μmol/L. Clorius, polydatin, lauric acid and ferulic acid all effectively inhibited TGF-β1-induced LX-2 cell activation. At the concentration of 200 μmol/L, all these 4 components inhibited PI3K, p-PI3K, AKT, p-AKT, ERK, p-ERK, P38 MAPK and p-P38 MAPK expressions in TGF-β1-induced LX-2 cells. Conclusion The therapeutic effect of YCHD on hepatic fibrosis is probably mediated by its core functional components including benzyl acetate, vanillic acid, clorius, polydatin, lauric acid and ferulic acid, which inhibit the PI3K-AKT and MAPK pathways in hepatic stellate cells.

Graphical abstract

关键词

茵陈蒿汤 / 核心功能成分群 / 网络药理学 / 成分贡献率 / 肝纤维化 / LX-2细胞

Key words

Yinchenhao Decoction / core functional component groups / network pharmacology / CDR / hepatic fibrosis / LX-2 cells

肝纤维化（HF）是激活增殖的肝星状细胞和大量产生与代谢紊乱的细胞外基质（EMC）导致的慢性损伤恢复反应^［1］。由于肝纤维化的发展过程非常复杂，目前临床应用中尚无直接针对肝纤维化的生物或化学疗法^［2］。

近些年来不断增加的实验证据和临床应用显示中药方剂在治疗肝纤维化有较显著的效果。研究表明^［3-5］，茵陈蒿汤对肝纤维化患者和肝纤维化动物模型均有抗肝纤维化作用。中药方剂在预防和治疗疾病方面一直提倡组方配伍^［6］，茵陈蒿汤由茵陈蒿、栀子和大黄组成，具有缓解胆汁淤积和抗肝损伤，预防脂肪肝和抗肝纤维化等作用^{［7， 8］}，能减轻肝损伤和氧化损伤来治疗梗阻性黄疸肝损伤^［9］，在治疗慢性乙型肝炎中显著改善患者症状^［10］。但是方剂中这3种药用植物的具体成分在治疗肝纤维化过程中产生的影响，目前还发现甚少。

近年来建立了网络药理学模型，以优化中药配方并推测其潜在机制^［11］，有学者研究相关技术并通过建立模型来解码治疗复杂疾病中的公式分子机制^［12-14］。因此本研究以茵陈蒿汤治疗肝纤维化为例，筛选建立融合模型这一量化的网络药理学模型确定核心功能成分群（CFCG）和分析潜在机制。设计融合模型进行筛选并构建功能效应空间（FES）来获取有效蛋白；最后根据以上获得的数据分析茵陈蒿汤治疗肝纤维化的核心功能成分群和潜在机制并进行相关细胞实验验证。

1 材料和方法

1.1 基于网络药理学的茵陈蒿汤抗HF潜在机制研究

1.1.1 致病基因的收集

在突变位点数据库（DisGeNET）、人类基因数据库（Genecards）中以“liver fibrosis”、“hepatic fibrosis”查询肝纤维化相关基因，在DisGeNET和Genecards中分别获得1216和6167个基因与肝纤维化有关。取Disgenet和Genecards中与肝纤维化相关基因的交集作为肝纤维化的致病基因处理。

1.1.2 构建肝纤维化致病基因权重网络

从DisGeNET和 Genecards获得疾病基因列表，其中从DisGeNET获得每个基因的文献数目进行归一化，归一化后的值认定为文献权重；从Genecards获得相关系数进行归一化，获得基因对疾病相关性的权重，运算后形成每个致病基因的最终权重值，再把带权重的致病基因比对到整合的人类蛋白数据库中，其中涉及运用到CMGRN（http：//bioinfo.icts.hkbu.edu.hk/cmgrn）和PTHGRN（http：//www.byanbioinfo.org/pthgrn）获取蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。用Cytoscape 3.9.1可视化基因权重网络。

1.1.3 收集茵陈蒿汤的化学成分

茵陈蒿汤的所有化学成分摘自中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库 （https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php），TCM@台湾（http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw），TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid/）^［15］，SymMap^［16］和ETCM（http：//www.nrc.ac.cn：9090/ETCM/index.php/Home/Index/index.html）^［17］。从已经发表的文献中收集了经过HPLC实验带浓度信息的成分。所有的成分的化学结构统一采用SMILES格式，对没有该格式的化学成分统一使用Open Babel Toolkit 2.4.1转为SMILES格式。

--引用第三方内容--

1.1.4 基于3类预测模型的茵陈蒿汤潜在活性成分选择 将收集到的化学成分用PreADMET Web服务器（https：//preadmet.webservice.bmdrc.org/）进行类药性预测、ADME预测和毒性预测。这其中根据文献筛选后汇总为茵陈蒿汤的潜在活性成分。

1.1.5 目标靶点的预测

通过相似集成方法（SEA）、HitPick和小分子药物靶点预测在线平台（SwissTargetPrediction），预测茵陈蒿汤中活性成分的目标，获得茵陈蒿汤中潜在成分的目标靶点。OpenBabel工具包（2.4.1版）用于转换标准SMILES。

1.1.6 成分靶点网络构建及网络拓扑参数分析

利用Cytoscape 3.9.1建立了茵陈蒿汤的成分-靶点（C-T）网络。Network Analyzer用于分析网络的拓扑参数。Cytoscape 3.9.1用于构建成分靶点网络并计算成分靶点网络的拓扑参数。

1.1.7 构建功能效应空间并评估有效蛋白

设计一种新的方法计算节点重要性，这是为了在一个网络中界定一个节点的影响力和重要程度。融合模型的具体计算法则如下：

\mathrm{N}\left(v\right)=\sqrt[\mathrm{3}]{\left[\sum _{s,t\in V}\frac{\sigma \left(s,t\left|v\right.\right)}{\sigma \left(s,t\right)}\right]*\left[\frac{\mathrm{1}}{\underset{s\in v}{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}\left(d\left(v,s\right)\right)}\right]*\left[\frac{{\sum }_{s\in S}j\left(v,s\right)}{N\times S}\right]}

公式中，N代表节点的重要性，V是网络中的节点集合，\sigma \left(s,t\right)代表节点s到节点t的最短路径数量之和。\sigma \left(s,t\left|v\right.\right)代表节点s到节点t的最短路径中，经过节点v的最短路径数量之和。如果节点s=t，则\sigma \left(s,t\right)=\mathrm{1}。如果节点v=s或节点v=\mathrm{t}，则\sigma \left(s,t\left|v\right.\right)=\mathrm{0}；d\left(v,s\right)代表节点v到节点s的距离；S代表与节点v有共享节点s的集合。j\left(v,s\right)代表节点v和节点s之间共享节点的数目。N代表节点v相邻节点的数目。如果节点v和节点s之间存在直接连接，则j\left(v,s\right)+\mathrm{1}。当节点v少于两个邻里时，则系数定义为0。

当算出构建的网络中所有节点重要性分数后，对其进行排序，将这一系列定义为I。

\begin{array}{l}\mathrm{I}=\left[I_{\mathrm{1}},I_{\mathrm{2}},I_{\mathrm{3}},\dots \dots ,I_{\left|V\right|}\right]=\left[N{\left(v\right)}_s,N{\left(v\right)}_{s+\mathrm{1}},N{\left(v\right)}_{s+\mathrm{2}},\dots \dots ,N{\left(v\right)}_{s+n}\right],\\ s\in \left[\mathrm{1},\left|V\right|\right]ands+n=\left|V\right|\end{array}

根据以上计算法则得到所有节点重要性分数后进行平均，得出平均数\overline{I}，将重要性分数高于平均数的节点进行整合并定义为新变量K，构建为功能效应空间（FES）：

\mathrm{F}\mathrm{E}\mathrm{S}\in \left(K,\mathrm{K}>\overline{\mathrm{I}}\right),\overline{I}=\frac{I_{\mathrm{1}}+I_{\mathrm{2}}+I_{\mathrm{3}}+\dots +I_{\left|V\right|}}{\left|V\right|}

FES表示在致病基因和茵陈蒿汤成分对应的所有靶点中，用融合模型筛选出的一组基因，从中医药作用的复杂网络构建FES可以最大程度地保留高度相关的小分子靶点和致病基因，因此这些基因也被定义为有效蛋白。

1.1.8 核心功能成分群的选择

为了优化潜在活性成分，根据FES选择更能表达茵陈蒿汤治疗肝纤维化机制的核心功能成分群，设计一个计算成分贡献率（CDR）的算法来选择核心功能成分群：

CD{R}_I=\frac{unique\left[T_{\mathrm{C}\mathrm{O}\mathrm{M}\mathrm{1}}+T_{\mathrm{C}\mathrm{O}\mathrm{M}\mathrm{2}}+T_{\mathrm{C}\mathrm{O}\mathrm{M}\mathrm{3}}+\dots +T_{\mathrm{C}\mathrm{O}\mathrm{M}\mathrm{i}}\right]}{T}\mathrm{Q}=CO{M}_{\left(CD{R}_I\le \mathrm{90}\%\right)}

CFCG=Q

T代表FES中所有的基因；COM为FES中基因相对应的成分；CO{M}_i代表第i个成分；T_{\mathrm{C}\mathrm{O}\mathrm{M}\mathrm{1}}代表第一个成分所对应的FES里面的基因，以此类推；Q代表所有CDR小于90%靶点对应的成分。

1.1.9 基因富集分析

使用R（4.3.0）软件对文中筛选得到的致病基因、茵陈蒿汤所有化合物对应的靶点和功能效应空间（FES）中的有效蛋白进行GO和KEGG富集分析。两者的富集分析的筛选条件都选择P值小于0.05。分析筛选得到的结果选择P值排名前20的GO项和通路绘制气泡图和柱状图展示。

1.2 基于细胞实验的茵陈蒿汤抗HF机制验证研究

1.2.1 实验材料

胎牛血清（FBS）和DMEM（1X）购自赛默飞世尔生化制品（北京）有限公司。乙酸苄酯、香草酸、苯甲酸甲酯、虎杖苷、月桂酸和阿魏酸（均为HPLC级标准物质，纯度≥98%）（南京狄尔格医药科技有限公司），CCK-8试剂盒（多津多实验室）。COL1A1、β-actin 、TGF‑β1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、P38、p-P38、HRP-山羊抗小鼠 IgG（H+L）和HRP 山羊抗兔 IgG（H+L）等抗体（Cell Signaling Technology），LX-2细胞系来自Scott Friedman（美国纽约西奈山医学院）。青霉素、链霉素（上海贝奥蒂姆）。重组人TGF-β1（PeproTech）。 裂解缓冲液和BCA蛋白质分析试剂盒（Beyotime）。

1.2.2 细胞培养

LX-2细胞在37 ℃、5%CO₂敷箱中培养，并补充100 mg/mL青霉素、100 mg/mL链霉素和10%胎牛血清。用重组人TGF-β1激活LX-2细胞48 h。

1.2.3 细胞毒性试验测定

CCK-8测定用于进行药物敏感性试验。在96孔板中接种约10 000/孔LX-2细胞。加入药物培育24 h后，将细胞改为在含有10 μL CCK-8的新鲜完整的100 μL培养基中再培养2 h。通过酶标记仪在450 nm处测量每个孔的吸光度。将药物分为0、50、100、200 μmol/L 4组浓度进行实验。实验重复3次，每次3个复合孔。

1.2.4 细胞内mRNA表达

用RNA提取试剂盒从LX-2中提取总RNA。经纯度分析和总RNA含量计算后，通过逆转录获得CDNA，获得的CDNA保存在-20 ℃。实时荧光定量PCR检测COL1A1.

1.2.5 蛋白质水平表达分析

使用放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液，提取LX-2细胞蛋白质，并使用BCA蛋白质分析试剂盒对其进行定量。配制聚丙烯酰胺凝胶，电泳，将蛋白转印至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，所用的一级抗体有TGF-β1（1∶1000）、β-actin（1∶1000）、PI3K（1∶1000）、p-PI3K （1∶1000）、AKT（1∶1000）、p-AKT（1∶2000）、ERK（1∶1000）、p-ERK（1∶2000）、P38（1∶1000）、p-P38（1∶1000）。TBST漂洗10 min×3次，二抗室温孵育2h，使用的二级抗体有HRP-山羊抗小鼠 IgG（H+L）（1∶2000）和 HRP 山羊抗兔 IgG（H+L）（1∶2000）。TBST漂洗10 min×3次，加入ECL超敏发光液显影。使用 Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像系统进行分析。

1.2.6 统计分析

使用Iamge J和Graphpad Prism 8.0进行分析，结果以均数±标准差表示，两组间均数比较采用t检验，多组间差异比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝纤维化致病基因权重网络的构建

在GeneCards数据库中检索到6167个致病基因，DisGeNET数据库中检索到1216个致病基因，取交集获得1005个肝纤维化致病基因并进行富集分析（图1B、C），得到3813条GO项和151条通路。接着构建一个关于肝纤维化全面的PPI网络，该网络共包含790个节点和5906条边（图1A）。

2.2 茵陈蒿汤中药成分检索及活性成分筛选

从已发表的数据库中收集到茵陈蒿汤的330个中药成分，其中大黄、茵陈和栀子含有的成分分别为124、98和108个。基于中药大黄、茵陈蒿、茵陈蒿汤方剂和栀子的ADMET属性，从330个成分中筛选到257个活性成分。查阅文献对茵陈蒿汤的成分补充72个成分，大黄、茵陈、栀子和茵陈蒿方剂分别补充29、12、12和20个成分（表1）。最后经过统计确定226个潜在活性成分（图2）。

2.3 茵陈蒿汤潜在活性成分靶点预测

对茵陈蒿汤的活性成分的靶点进行预测并得到了1529个靶点。Degree在90以上的靶点有10个，包括CA12、CA2、CA1、CA9、CA7、CA4、CA14、CYP1B1、AKR1B1、CA3。

2.4 成分靶点网络的构建

使用209个潜在活性成分及其1529个靶点来构建成分-靶点（C-T）网络。这个网络中209个潜在活性成分和1529个靶点之间有18074个C-T关联，包括1755个节点和18074条边，平均每个成分对应靶点数为7.32个。

2.5 基于功能效应空间的有效蛋白质筛选与验证

在GO层次中，功能效应空间（FES）中的有效蛋白在茵陈蒿汤靶点中和在肝纤维化的致病基因中的覆盖率分别能够达到90.39%和62.94%；在KEGG通路层次中，有效蛋白富集的通路在茵陈蒿汤靶点和在肝纤维化致病基因富集的通路中覆盖率分别达到96.10%和86.33%。在FES中，构建的C-T网络含有1414个节点和15583条边。

其次模型分析比较显示：优化前茵陈蒿汤成分对应的靶点和肝纤维化致病基因分别为1529和1005，交集得到的未处理有效目标（UVTs）有266个基因，UVTs与有效蛋白交集占UVTs的86.84%；优化前茵陈蒿汤靶点和致病基因的GO项分析个数分别为3471和3813，两者交集得到2639个GO项，再交集结果占UVTs个数的85.60%；3）优化前茵陈蒿汤靶点和致病基因的KEGG通路有203和151条，两者交集得到128条通路，有效蛋白的KEGG通路占其100%。

最后在FES有效蛋白的富集分析时得到2983个GO项富集分析和204条有效蛋白通路途径。

2.6 核心功能成分群的筛选及功能推测

将209个潜在有效成分进一步分析获得含有52个化学成分的核心功能成分群，它们进行相互作用的靶点可以覆盖90% FES中的有效蛋白质（图3）。其次核心功能成分群的靶点KEGG分析后得到164条通路，与致病基因的通路交集达到123条，可以覆盖81.46%的致病基因丰富途径，其中富集到基因最多的两条通路是PI3K-AKT信号通路和MAPK信号通路（图4），因此我们构建了PI3K-AKT和 MAPK的综合信号通路（图5）。

2.7 核心功能成分群的细胞实验验证

在CCK-8和qPCR实验中，根据成分贡献率模型（CDR）计算，综合选取进行实验的乙酸苄酯、香草酸和苯甲酸甲酯、虎杖苷、月桂酸和阿魏酸在CCK-8实验中发现化合物在200 μmol/L内明显无细胞毒性（图6）。qPCR结果中发现（图7），与TGF-β1相比，苯甲酸甲酯、虎杖苷、月桂酸和阿魏酸在200 μmol/L显著抑制了LX-2细胞中肝纤维化标志基因COL1A1的表达（P<0.001）。

Fig.7 qPCR experimental results. Clorius, polydatin, lauric acid and ferulic acid dose-dependently repressed the mRNA expressions of COL1A1 in TGF-β1-induced LX-2 cells (Mean±SD, n=3). The inhibitory effect of benzyl acetate and vanillic acid was not obvious and is not displayed. ***P<0.001.

Western blotting分析显示（图8），通路PI3K、AKT、ERK、P38和其磷酸化的蛋白表达在TGF-β1处理后显著升高，但经这4种成分处理后发现不同程度的下调，其中p-PI3K、p-AKT、p-ERK、P38和p-P38下调最明显。

3 讨论

为了更好地优化茵陈蒿汤，本文提出了一种综合策略获得了茵陈蒿汤的核心功能成分群，并通过对靶基因的富集分析讨论和细胞实验研究了这些化学成分的潜在机制。

本研究设计了成分贡献率模型来获取核心功能成分群，最终得到包含52个成分的核心功能成分群。核心功能成分群靶点的丰富途径可覆盖致病基因途径的90%，可以说明这些核心功能成分群靶点与致病基因密切相关，说明了本研究建立的模型具有一定的可靠性。此外，茵陈蒿汤的核心功能成分群中前六种成分（乙酸苄酯、香草酸、苯甲酸甲酯、虎杖苷、月桂酸和阿魏酸）的靶点在有效蛋白质的覆盖率可达到50%以上，并且已经有研究发现一些成分有利于肝纤维化的治疗。例如月桂酸在肝脏炎症中能够抑制促炎细胞因子水平，并下调肝组织中 TLR4/NF-κB的表达，减少炎症对肝脏带来的损害^{［18， 19］}。阿魏酸通过抑制TGF-β1及其受体的表达导致人细胞信号转导分子3和子4（Smad3、4）的下调，从而使肝星状细胞失去活性，抑制肝纤维化发展^{［20， 21］}。虎杖苷可以对抗氧化应激引起的肝损伤，抑制炎症因子损伤肝细胞、调节脂质代谢过程和过氧化引起的细胞自噬，达到保护肝脏的作用^{［22， 23］}。因此可以看出核心功能成分群能够代表茵陈蒿汤在治疗肝纤维化中的关键作用，本研究所使用的成分贡献率对茵陈蒿汤的优化是有效的。

此外，在对核心功能成分群的通路分析中得到的两条通路显示了核心功能成分群对肝纤维化治疗的潜在贡献（图5）。例如许多证据表明^{［22， 23］}，通过内在或者外界手段抑制PI3K-AKT信号通路就能从源头上阻止肝星状细胞（HSCs）的产生，从而阻止HSCs活化分泌损伤肝细胞的因子和过多的ECM蛋白，从而延缓肝纤维化的进展。还有研究表明MAPK通路中的p38-ERK通路在炎症和肝纤维化发展中具有关键作用，该通路激活HSCs后释放的生长因子刺激产生氧化应激相关因子，促进HSCs增殖最终加速肝纤维化^［27-30］。结合核心功能成分群靶点和这2条途径，我们推测茵陈蒿汤的潜在机制有2个重要方面：核心功能成分群能够抑制HSCs增殖和存活，减少ECM的产生，改善肝纤维化过程中的炎症损伤；核心功能成分群在相互作用的蛋白质特别是细胞增殖、炎症和抗细胞凋亡相关的蛋白质途径中产生影响，继而使茵陈蒿汤达到治疗肝纤维化的目的。

为了验证以上结果的可靠性进行了体外实验，核心功能成分群中成分贡献率较高的乙酸苄酯、香草酸、苯甲酸甲酯、虎杖苷、月桂酸和阿魏酸这六种成分在大剂量对LX-2细胞无明显毒性，苯甲酸甲酯、虎杖苷、月桂酸和阿魏酸显著抑制了LX-2细胞中肝纤维化标志基因COL1A1的mRNA表达，不同程度的下调了PI3K-AKT、ERK、P38和其磷酸化蛋白的表达水平，表明了这些成分治疗肝纤维化的有效性和选择的模型的准确性。

综上所述，本研究设计了融合模型这一新的计算节点重要性的方法，该方法考虑了节点位置的重要性、节点控制力和节点控制邻近节点的能力；同时为了更好的分析成分，构建成分贡献率（CDR）模型，更可能发现药用植物中更具体的成分对肝纤维化的治疗作用。该策略可为促进单一靶点向多靶点模式的转变和二次开发提供方法学参考。

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基金资助

广东省基础与应用基础研究基金(2020A1515010412)

广东省基础与应用基础研究基金(2022A1515010121)

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