黄芩苷通过调控PI3K/AKT信号通路抑制登革病毒感染诱导的人静脉内皮细胞的自噬

摘要

目的 探究2型登革病毒（DENV-2）感染人脐静脉内皮细胞（HUVECs）对细胞自噬的影响及黄芩苷（BA）抗DENV-2感染的具体作用机制。方法 HUVECs体外培养，设置对照组：HUVECs正常培养；DENV-2感染组：HUVECs+DENV-2；黄芩苷组：HUVECs+DENV-2+BA。用DENV-2感染HUVECs通过透射电镜观察自噬；Western blotting检测细胞自噬相关蛋白LC3、P62的表达，采用溶酶体红色荧光探针染色法观察DENV-2感染后HUVECs内溶酶体的pH变化；蛋白质组学筛查DENV-2感染HUVECs后差异蛋白的表达情况；使用CCK-8法测定黄芩苷对HUVECs活性的影响；RT-qPCR检测细胞内病毒RNA的复制情况；检测病毒NS1蛋白的表达情况；通过透射电镜观察细胞自噬；采用Lyso-Tracker Red染色法观察黄芩苷对DENV-2感染后HUVECs内溶酶体酸化的影响；检测细胞自噬相关蛋白ATG5、Beclin-1、LC3、P62的表达，自噬小体和溶酶体融合的关键蛋白STX17、SNAP29、VAMP8表达情况及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。结果 DENV-2感染可诱导细胞自噬小体的形成；DENV-2感染后LC3Ⅱ/LC3 I表达逐渐增高，48 h达到峰值（P<0.05）;p62表达水平在感染前中期无明显变化，48 h后降低（P<0.05）;Lysotracker red染色结果显示DENV-2感染组红色亮点较多，且染色明亮。CCK-8结果显示50μg/mL被视为黄芩苷对HUVECs细胞的最大无毒剂量。RT-qPCR结果显示随着黄芩苷浓度增加药物对病毒的抑制作用增强。黄芩苷可降低DENV-2 NS1蛋白的表达（P<0.001）。与DENV-2组相比，经过黄芩苷（50μg/mL）处理后，自噬减少，加入黄芩苷后抑制溶酶体酸化。黄芩苷组48 h LC3 II/LC3 I比值降低（P<0.05）,48 h时p62表达增加（P<0.05）。经过黄芩苷处理后DENV-2诱导的自噬相关蛋白Beclin-1、ATG 5、STX17、SNAP29和VAMP8的表达下调（P<0.01）。蛋白组学结果显示PI3K-AKT通路在DENV的发病机制中可能发挥重要作用。加入PI3K抑制剂（LY294002）后，DENV-2的RNA表达水平降低，各组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达水平的蛋白表达水平降低（P<0.01）。用黄芩苷处理后，DENV-2感染组PI3K、AKT的mRNA表达水平均显著降低（P<0.05），而mTOR mRNA表达无明显变化。DENV-2感染组上调的p-PI3K、p-AKT的蛋白表达水平均降低（P<0.05），而p-mTOR表达无明显变化。DENV-2诱导的LC3、P62蛋白表达降低（P<0.05）；在黄芩苷治疗组中也抑制了病毒诱导的自噬。结论 DENV-2感染可促进HUVECs细胞自噬的发生，黄芩苷可抑制DENV-2的RNA和NS1蛋白的表达，可能通过抑制自噬发生及自噬体和溶酶体融合，降低DENV-2诱导的自噬，其作用机制可能是通过PI3K/AKT信号通路调控。

关键词

登革病毒 / 黄芩苷 / 自噬 / PI3K/AKT / 人脐静脉内皮细胞