澳洲茄碱通过调控Bcl-2/Bax/caspase-3信号通路促进非小细胞肺癌发生凋亡

Solasonine promotes apoptosis of non-small cell lung cancer cells by regulating the Bcl-2/Bax/caspase-3 pathway

摘要

目的 探讨龙葵活性成分澳洲茄碱对非小细胞肺癌细胞PC9增殖、凋亡的影响。 方法 体外培养PC9细胞，设对照组（0 μmol/L）及澳洲茄碱不同剂量组（0、2、5、10、15、20、25 μmol/L），CCK-8试剂盒检测澳洲茄碱对PC9细胞的增殖抑制作用；TMRE检测线粒膜电位；caspase3/7活性试剂盒联合GreenNuc™ Caspase-3/Annexin V-mCherry染色检测caspase-3活性；Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率；给药处理或者使用PTEN抑制剂后，Western blot检测细胞中相关蛋白的表达量。 结果 与对照组相比，经澳洲茄碱干预24、48、72 h后，PC9细胞的活力均明显降低（P<0.05）；经澳洲茄碱干预24 h后，细胞线粒体膜电位明显降低，而细胞凋亡比例明显升高（P<0.05）；caspase-3/7活力、活细胞Caspase-3活性及cleaved caspase-3蛋白表达均显著升高（P<0.01）；PI3K和Akt磷酸化水平降低（P<0.05）；而PTEN、Bax蛋白表达上调（P<0.05）；抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达下调（P<0.05）。 结论 澳洲茄碱可通过调控Bcl-2/Bax/caspase-3通路及其上游蛋白活性而抑制PC9细胞增殖，促进其凋亡。

Abstract

Objective To investigate the effect of solasonine, an active component of Solanum nigrum, on proliferation and apoptosis of non-small cell lung cancer PC9 cells. Methods PC9 cells were treated with 2, 5, 10, 15, 20, or 25 μmol/L solasonine, and the changes in cell proliferation were examined using CCK-8 assay. Tetramethyl rhodamine ethyl ester (TMRE) was used to detect the changes in mitochondrial membrane potential, and caspase-3/7 detection kit and GreenNuc™ caspase-3/Annexin V-mCherry kit for live cell were used to analyze the changes in caspase-3 of the cells. Annexin V-FITC/PI double staining was employed to analyze the apoptosis rate of the cells. The effect of PTEN inhibitors on solasonine-induced cell apoptosis was examined by detecting apoptosis-related protein expressions using Western blotting. Results Solasonine treatment for 24, 48, and 72 h significantly lowered the viability of PC9 cells. The cells treated with solasonine for 24 h showed significantly decreased mitochondrial membrane potential and increased cell apoptosis with enhanced caspase-3/7 and caspase-3 activities and expression of cleaved caspase-3. Solasonine treatment significantly decreased phosphorylation levels of PI3K and Akt, increased the protein expressions of PTEN and Bax, and lowered the expression of Bcl-2 protein in the cells. Conclusion Solasonine inhibits proliferation and induces apoptosis of PC9 cells by regulating the Bcl-2/Bax/caspase-3 pathway and its upstream proteins.

Graphical abstract

关键词

澳洲茄碱 / 肺癌 / Bcl-2/Bax/caspase-3通路 / 同源性磷酸酶-张力蛋白 / 细胞凋亡

Key words

solasonine / lung cancer / Bcl-2/Bax/caspase-3 signaling pathway / homologous phosphatase tensin protein / apoptosis

全球肺癌的新发病率及死亡率高居恶性肿瘤榜首^{［1， 2］}。多数肺癌患者确诊时已属中晚期，癌细胞已经发生侵袭转移，失去手术根除治疗的机会，而非手术治疗（放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗）普遍存在其病理类型的局限性，如放疗/化疗抵抗、耐药、毒副作用明显等。因此，我们需要探索促进肺癌发生、侵袭转移的非特异性分子机制，确定新的临床治疗靶点，提高治疗中晚期肺癌患者的治疗效率。

龙葵是重要的抗癌药物，别名苦葵、山辣椒、天茄子等，在我国各地均有分布。文献报道表明，龙葵具有较广泛、效果较明显的抑制肿瘤生长的作用，龙葵主要抑瘤活性成分有生物碱、多糖、糖蛋白等，龙葵所含的这三类物质在抗肿瘤方面都有较多的研究，其中较有前景的是其生物碱。澳洲茄碱（SS，C45H73O16N）是龙葵的主要活性成分之一，属于甾体生物碱中的胆甾烷衍生物^{［3， 4］}，其水解后分解出苷元澳洲茄胺，进而发挥化学活性，具有明确的抗肿瘤作用^{［5， 6］}。既往研究表明^［7-14］，澳洲茄碱对不同肿瘤细胞系，如小鼠黑色素瘤（B16F10），人结肠癌（HT29），人乳腺癌（MCF-7），人宫颈腺癌（HeLa），人肝细胞肝癌（HepG2）和人胶质母细胞瘤（MO59J，U343和U251）、人非小细胞肺癌（A549、Calu-1）具有明显的抗增殖作用。然而，澳洲茄碱在肺癌治疗中的效果及其分子机制研究仍有欠缺。

PI3K/Akt通路的持续活化，在肺癌及其他肿瘤细胞的增殖和凋亡中，起到了至关重要的作用^［15］。PTEN是一种抑癌基因，负反馈调节PI3K/Akt通路活性^{［16， 17］}。caspase-3是细胞凋亡途径的关键执行者，cleaved caspase-3是其活化状态，介导细胞凋亡。Bcl-2和Bax是Bcl-2蛋白家族的两个重要成员，在细胞凋亡中起关键作用。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，抑制caspase-3活化；而Bax是一种促凋亡蛋白，促进caspase-3活化^{［18， 19］}。最近研究发现^［13］，澳洲茄碱可能通过抑制caspase-3通路，进而诱导A549细胞凋亡，但具体分子机制尚未做深入研究。由此，本实验拟从PI3K/Akt信号通路及其上下游因子出发，探讨澳洲茄碱对肺癌PC9细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞

人肺腺癌细胞PC9由广州中医药大学第二附属医院李龙妹博士赠送。PC9，贴壁细胞，培养于含10%胎牛血清和1%双抗（100 µg/mL^{链霉素、100 U/L青霉素）的DMEM基础培养基，培养条件为37℃，5% CO₂。当细胞汇合度为80%~90%时进行传代或铺板。}

1.1.2 药物

澳洲茄碱（纯度≥98.98%，上海陶素生化科技，分子式为C45H73NO16，相对分子质量为884.07），冻干粉状态下-20 ℃冰箱保存。药物储存液制备：采用细胞级DMSO将澳洲茄碱粉末10 mg溶解，制备成50 mmol/L储存液，分装后-20℃保存备用，实验时采用完全培养基将其稀释为实验所需的药物浓度。

1.1.3 主要试剂

DMEM基础培养基、胎牛血清、胰酶（Gibco）；磷酸盐缓冲液（PBS，HyClone）；预染蛋白Marker、BCA蛋白检测试剂盒（Thermo）；线粒体膜电位检测试剂盒（TMRE）、GreenNuc™活细胞caspase-3活性检测试剂盒（碧云天）；caspase-3/7活力检测试剂盒（Promega）；CCK8试剂盒（翌圣）；Annexin V-FITC/PI（联科生物）；cleaved caspase-3、PTEN、PI3Kp85、p-PI3Kp85、Akt、p-Akt、Bcl2、Bax、GAPDH抗体、蛋白上样缓冲液、总蛋白裂解液（CST）；发光液、PVDF膜（Millipore）；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂（Roche）。

1.1.4 主要仪器

生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；二氧化碳培养箱（Sanyo）；全自动细胞计数仪（Inno-Aliance）；常温离心机（京立离心机）；多功能酶标仪（BioTek）；冷冻离心机（Eppendorf）；流式细胞仪（BD）；高灵敏化学发光成像仪、垂直电泳系统、半干转印槽转膜仪（Bio-Rad）；全自动倒置荧光显微分析系统（Nikon）。

1.2 实验方法

1.2.1 CCK8法检测澳洲茄碱对PC9细胞活力的影响

收集处于对数生长期的PC9细胞，按5×10³/孔的标准接种于96孔细胞板中，常规培养24 h后，分组进行给药处理，SS浓度为：0、2、5、10、15、20、25 µmol/L，继续常规培养24、48和72 h。药物作用后，吸去旧培养液，加入含10%（体积分数）CCK8溶液的新培养基，常规培养箱避光孵育2 h，用酶标仪在450 nm波长下检测各孔吸光值（A），取各复孔平均值，按照以下公式计算细胞活力，绘制PC9细胞在不同浓度SS作用24、48、72 h后的生长曲线并计算出IC₅₀。

\mathrm{细胞}\mathrm{活率}=\frac{A_{\mathrm{加药}\mathrm{组}}-A_{\mathrm{空白}\mathrm{组}}}{A_{\mathrm{对照}\mathrm{组}}-A_{\mathrm{空白}\mathrm{组}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

1.2.2 线粒体膜电位检测

取适量TMRE （×1000），按照每1 µL TMRE（×1000）加入1 mL检测缓冲液的比例稀释TMRE，混匀后即为TMRE染色工作液。分别收集对照组和经15 μmol/L 澳洲茄碱作用24 h的细胞，1000 r/min离心3 min，PBS洗涤1次后加入1 mL TMRE染色工作液，混匀后于细胞培养箱中孵育30 min，弃上清，用预热的细胞培养液洗涤2次，加入1 mL预热的细胞培养液，置于荧光显微镜下观察橘红色荧光强度，并拍照保存。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡情况

收集对数生长期细胞，按细胞浓度2×10⁵/孔接种于6孔板，待细胞贴壁，分为对照组（不加澳洲茄碱）和给药组（澳洲茄碱浓度为15 μmol/L），继续常规培养24 h。药物处理完毕后，收集细胞并根据细胞凋亡试剂盒（联科生物）说明书对各组细胞进行PI染色，继而使用流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.4 Caspase-3/7活力检测

按细胞浓度2×10⁴/0.1 mL/孔接种于96孔板中，细胞贴壁后，分为对照组（澳洲茄碱浓度为0 μmol/L ）和给药组（澳洲茄碱浓度为10、15、20 μmol/L组），常规培养24 h，加入Apo-ONE caspase-3/7混合液100 μL，常温避光孵育1 h，采用多功能酶标仪检测，记录并计算活力。

1.2.5 活细胞caspase-3活性的原位荧光显微镜检测

按细胞浓度1×10⁵/孔接种于12孔板，贴壁后，对照组和经15 μmol/L澳洲茄碱作用24 h的细胞，每孔先加入194 μL Annexin V-mCherry Binding Buffer，再加入5 μL Annexin V-mCherry和1 μL GreenNuc™Caspase-3 Substrate （1 mmol/L），轻轻混匀，室温避光孵育30 min，随即在荧光显微镜下观察，拍照并处理图像。

1.2.6 Western blotting法检测澳洲茄碱对PC9细胞蛋白表达的影响

取对数生长期的PC9细胞以2×10⁵/孔接种于6孔板，待细胞贴壁后，分组给药，药物处理24 h后收集细胞，冰上操作，加入含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的裂解液提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，加入上样缓冲液并混匀，加热变性，-80 ℃保存。每组样品取25 μg总蛋白上样，80 V电泳20 min后110 V电泳50 min，20 V半干转45 min，用5%脱脂牛奶封闭1 h，洗去封闭液，加入对应蛋白一抗，4 ℃孵育过夜，第2天以TBST洗涤3次后，加入二抗室温孵育1 h，显影成像。

1.2.6 统计学方法

所有实验均至少重复3次，采用SPSS 23.0进行正态性及方差齐性检验，当满足正态性及方差齐性时，采用单因素方差分析；若不满足正态性或方差齐性时，采用非参数检验。当P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 澳洲茄碱对PC9细胞增殖的抑制作用

CCK8实验结果显示，与对照组相比，澳洲茄碱组PC9细胞活力明显下降并呈剂量和时间依赖性：澳洲茄碱作用于细胞24 h后，从给药浓度10 μmol/L起，细胞活力的差异具有统计学意义（P<0.05），且随浓度的增大而逐渐降低；而澳洲茄碱干预细胞48 h及72 h后，从给药浓度为2 μmol/L起，细胞活力的差异具有统计学意义（P<0.05），且随浓度的增大而逐渐降低（图1）。经计算，澳洲茄碱对PC9细胞24、48、72 h的IC₅₀分别为21.72、14.60、11.90 μmol/L。

2.2 澳洲茄碱对PC9细胞线粒体膜电位的影响

荧光显微镜下，与对照组相比，经澳洲茄碱 （15 μmol/L）作用24 h后，澳洲茄碱组细胞橘红色荧光强度明显减弱，几乎完全消失（图2）。

2.3 澳洲茄碱对PC9细胞凋亡的影响

Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，澳洲茄碱各组（10、15、20 μmol/L）细胞早期凋亡比率均增加，且随着药物浓度增加而升高，差异均有统计学意义（P<0.05，图3）。

2.4 澳洲茄碱对PC9细胞cleaved caspase-3蛋白、caspase-3/7活力和caspase-3活性的影响

Western blotting实验结果显示，与对照组相比，澳洲茄碱各组（5、10、15、20和25 μmol/L）中PC9细胞的cleaved caspase-3蛋白表达明显上调，差异均有统计学意义（P<0.05），且随着给药浓度的增大，cleaved caspase-3蛋白表达量呈明显上调趋势（图4A、B）。caspase-3/7活性试剂盒检测结果显示，与对照组相比，澳洲茄碱各组（10、15、20 μmol/L）中PC9细胞的caspase-3/7活力明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05），且随着药物浓度增大而逐渐降低（图4C）。同时GreenNuc™ caspase-3/Annexin V-mCherry双染结果显示，对照组细胞不会被GreenNuc™和Annexin V-mCherry所染色。澳洲茄碱处理24 h后，PC9细胞内caspase-3活性高的凋亡细胞核呈明亮的绿色荧光，凋亡细胞的细胞膜显示红色荧光（图5）。

2.5 澳洲茄碱对PC9细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达水平的影响

Western blotting结果显示，与对照组相比，澳洲茄碱15、20和25 μmol/L组中PC9细胞的Bcl-2蛋白表达明显下调，而澳洲茄碱20和25 μmol/L组细胞Bax蛋白表达明显上调，差异均有统计学意义（P<0.05）；且随着给药浓度的增大，Bcl-2蛋白表达量呈明显下降趋势，Bax蛋白表达量呈明显上升趋势（图6）。

2.6 澳洲茄碱对PC9细胞中PI3K、Akt蛋白磷酸化水平的影响

澳洲茄碱作用4 h可抑制PI3K和Akt的磷酸化（p-PI3K、p-Akt蛋白表达减低），且随着时间的推移抑制作用越明显；与空白对照组相比，澳洲茄碱作用细胞12、24 h后，细胞中p-PI3K、p-Akt的表达量差异具有统计学意义（P<0.05，图7）。

2.7 澳洲茄碱对PC9细胞中PTEN蛋白表达水平的影响

药物作用24 h后，澳洲茄碱15、20和25 μmol/L组中PC9细胞的PTEN蛋白表达明显上调，差异有统计学意义（P<0.05），且随给药液浓度的增大，PTEN蛋白表达逐渐升高；这种上调趋势可被PTEN蛋白抑制剂SF1670逆转（图8）。

3 讨论

肺癌仍是我国乃至世界范围内癌症相关性死亡的首要原因^［1，2］，寻找行之有效的治疗手段及治疗靶点是非常必要的。澳洲茄碱已被证实可以通过线粒体介导的凋亡等不同方式对不同肿瘤类型具有抑制增殖、促进凋亡的作用^{［4-14，19-21］}。在本研究中，以人肺腺癌细胞系PC9作为研究对象，澳洲茄碱作为作为治疗药物，探索了澳洲茄碱在肺癌治疗中的潜力及相关机制。本研究结果显示，澳洲茄碱显著抑制PC9细胞的增殖，且呈剂量依赖性及时间依赖性，对PC9细胞24、48、72 h的IC₅₀分别为21.72、14.60、11.90 μmol/L；且与对照组相比，澳洲茄碱组细胞线粒体膜电位水平显著降低，细胞凋亡比例显著升高。以上结果与既往研究结果一致^{［13， 14， 22］}，进一步验证了澳洲茄碱可以通过线粒体介导的凋亡促进癌细胞凋亡，抑制其增殖的结论。

Bcl-2/Bax/caspase-3信号通路与细胞的凋亡过程密切相关^{［23， 24］}在癌细胞中，高表达的Bcl-2与Bax形成异源二聚体，抑制下游caspase-3的激活，抵抗细胞凋亡的发生^［25］。李龙妹等^［13］研究显示，澳洲茄碱可明显抑制肺腺癌细胞A549中p65、Bcl-2蛋白表达，并增强Bik、Bak蛋白表达，降低pro caspase-3水平，从而推测澳洲茄碱通过激活caspase-3通路诱导A549细胞凋亡。此外，Zeng等^［14］研究显示，澳洲茄碱引起肺腺癌细胞A549和Calu-1中铁死亡和线粒体氧化应激诱导细胞凋亡。本研究结果显示，澳洲茄碱作用于PC9细胞后，Bax和cleaved caspase-3蛋白表达显著上调，且caspase-3/7活力及caspase-3活性同样明显升高，而Bcl-2蛋白表达显著下调，且呈现浓度依赖性，对李龙妹等和Zeng等关于澳洲茄碱通过激活caspase-3通路或线粒体相关途径诱导肺癌细胞凋亡的结论进行了细胞类型上的验证和补充，增加了澳洲茄碱抑制肺癌的普遍性。因此我们推测澳洲茄碱对PC9细胞的增殖抑制、凋亡诱导可能通过调控Bcl-2/Bax/caspase-3通路发挥抑癌作用。

多项研究表明PI3K/Akt/Bax信号通路的调控是多种药物抑制肺癌细胞增殖生长的关键^［26-29］。Akt易被PI3K的活化产物PIP3激活，在苏氨酸308位点或丝氨酸473位点发生磷酸化，直接抑制促凋亡蛋白Bax表达，抵抗细胞凋亡进程^［15］。我们推测，澳洲茄碱对PC9细胞中Bax的上调与PI3K/Akt通路活性有关。Western blot实验结果显示，澳洲茄碱可以显著抑制p-PI3K、p-Akt蛋白磷酸化，呈时间依赖性，与我们的预期相符。PTEN是PI3K/Akt通路中重要的负调控因子，可下调PI3K/Akt通路活性而抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡^［16］。本研究结果显示，澳洲茄碱剂量依赖性激活PTEN蛋白表达，但这种作用可以被PTEN抑制剂SF1670抵消。综上，澳洲茄碱可能通过上调抑癌基因PTEN的蛋白表达，从而负调节PI3K/Akt通路活性，诱导细胞凋亡。

综上所述，澳洲茄碱确切可以抑制肺腺癌细胞增殖、诱导凋亡。具体可能通过上调PTEN蛋白表达，抑制PI3K/Akt信号通路的活化，解除Bcl-2与Bax的结合，激活caspase-3，进而诱导PC9细胞凋亡，为中草药龙葵治疗肺癌的机制研究中提供了新的思路。本研究尚存在着一定不足：本实验仅进行了细胞层面的实验，未进行动物层面的研究，下一步将构建实验动物模型，进一步确认澳洲茄碱对肺癌的生长抑制作用。此外，在文献中已明确澳洲茄碱可通过不同途径抑制肺癌细胞A549和Calu-1（含H-ras癌基因），而本研究证实澳洲茄碱也可抑制肺癌细胞PC9（EGFR突变型），可见澳洲茄碱针对肺癌的抑制效应具有普遍性。接下来我们将研究澳洲茄碱对肺癌细胞EGFR-TKI药物的原发性及获得性耐药是否具有增效减毒作用。

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