CDHR2过表达通过抑制PI3K/Akt通路抑制乳腺癌细胞增殖

Overexpression of CDHR2 inhibits proliferation of breast cancer cells by inhibiting the PI3K/Akt pathway

摘要

目的 研究CDHR2通过PI3K/Akt信号通路抑制乳腺癌细胞生长和细胞周期的作用机制。 方法 利用生物信息学分析CDHR2在乳腺癌中的表达及生存预后情况，并利用免疫组化验证，采用qRT-PCR、Western blot检测5株乳腺癌细胞株与正常乳腺上皮细胞中CDHR2的表达，并分析CDHR2的表达情况。筛选出CDHR2表达量低的乳腺癌细胞系MDA-MB-231及MCF7进行质粒转染过表达CDHR2，分为NC组（空白质粒对照）和CDHR2组（CDHR2质粒过表达组）。利用CCK-8增殖实验、EdU增殖实验及细胞周期实验探究CDHR2对乳腺癌细胞生长和细胞周期的影响，通过Western blotting检测CDHR2过表达对PI3K/Akt信号通路和周期通路蛋白表达的影响。 结果 生物信息学分析显示在乳腺癌及癌旁中CDHR2表达量均较低且两者间差异无统计学意义（P>0.05），但高表达CDHR2乳腺癌患者预后更好（P<0.05）。免疫组化、qRT-PCR及Western blot实验提示，CDHR2在乳腺癌组织及乳腺癌细胞中表达均显著下调（P<0.01），CDHR2可以抑制乳腺癌细胞增殖及阻滞乳腺癌细胞的细胞周期（P<0.01），CDHR2能够抑制PI3K和Akt磷酸化蛋白表达、抑制周期蛋白Cyclin D1的表达。 结论 过表达CDHR2可能通过PI3K/Akt信号通路抑制乳腺细胞生长及阻滞乳腺癌细胞的细胞周期。

Abstract

Objective To investigate the mechanism by which CDHR2 overexpression inhibits breast cancer cell growth and cell cycle pragression via the PI3K/Akt signaling pathway. Methods Bioinformatic analysis was performed to investigate CDHR2 expression in breast cancer and its correlation with survival outcomes of the patients. Immunohistochemistry was used to examine CDHR2 expressions in surgical specimens of tumor and adjacent tissues from 10 patients with breast cancer. CDHR2 expression levels were also detected in 5 breast cancer cell lines and a normal human mammary epithelial cell line using qRT-PCR and Western blotting. Breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MCF7 with low CDHR2 expression were transfected with a CDHR2-overexpressing plasmid, and the changes in cell proliferation and cell cycle were evaluated using CCK-8 assay, EdU assay, and cell cycle assay; the changes in expressions of PI3K/Akt signaling pathway and cell cycle pathway proteins were detected with Western blotting. Results Bioinformatic analysis showed low CDHR2 expression level in both breast cancer and adjacent tissues without significant difference between them (P>0.05), but breast cancer patients with a high expression of CDHR2 had a more favorable prognosis. Immunohistochemistry, qRT-PCR and Western blotting showed that the expression of CDHR2 was significantly down-regulated in breast cancer tissues and breast cancer cells (P<0.01), and its overexpression strongly inhibited cell proliferation, caused cell cycle arrest, and significantly inhibited PI3K and Akt phosphorylation and the expression of cyclin D1. Conclusion Overexpression of CDHR2 inhibits proliferation and causes cell cycle arrest in breast cancer cells possibly by inhibiting the PI3K/Akt signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

乳腺癌 / CDHR2 / PI3K/Akt通路 / 增殖 / 细胞周期

Key words

breast cancer / CDHR2 / PI3K/Akt pathway / proliferation / cell cycle

乳腺癌已超过肺癌成为世界上最常见的癌症和第五大癌症死亡原因^［1］，尽管乳腺癌的治疗理念随着医学对肿瘤的不断深入认识而逐渐提高，但乳腺癌的发病机制至今仍不明确，乳腺癌患者的长期生存率也不理想。乳腺癌患者根据不同的激素受体表达情况可进分为luminal A、luminal B、HER-2过表达型以及三阴型4种类型乳腺癌。对于乳腺癌患者而言，保乳手术、乳腺癌改良根治术和放疗是最常见的治疗方法。同时，还可根据乳腺癌的分期、分子分型、淋巴结分期等进行个体化化疗、靶向治疗和激素治疗等全身性辅助治疗^［2］。但目前的临床治疗存在一定局限性，比如激素受体阳性乳腺癌患者存在内分泌耐药且复发率较高等问题，人类表皮生长因子受体2 （HER2）阳性型存在靶向治疗耐药^［3］，三阴性乳腺癌患者的早期复发转移率较高，且靶标部位不明确，肿瘤异质性强，患者只能选择化疗。由于不同的乳腺癌亚型在基因表达模式、治疗策略的选择以及对治疗的反应和预后等方面存在差异。因此，为进一步了解乳腺癌的发病机制，改进治疗方法和延长生存期。寻找理想的靶点和新型生物标志物对于早期诊断、改善预后和开展肿瘤分子靶向治疗具有重要意义^［4］。

钙粘蛋白相关家族成员2（CDHR2）也被命名为 PCDH24属于原钙粘蛋白家族，PCDH家族在钙依赖性细胞粘着中扮演重要角色^［5］。在许多人类癌症（包括乳腺癌，白血病，胃癌，结直肠癌，食道癌和肺癌）中已经报道了一些PCDH家族成员（例如PCDH8，PCDH9，PCDH10，PCDH17和PCDH20）的表达丧失^［6-9］，表明 PCDH可以作为人类癌症的肿瘤抑制剂，但目前CDHR2在乳腺癌中尚未有研究。本研究通过阐明CDHR2抑制PI3K/Akt通路抑制乳腺癌细胞的生长，并进一步阻滞乳腺癌细胞周期，有望为乳腺癌治疗提供新靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

选取南方医科大学中西医结合医院手术切除的10例乳腺癌组织及其相应癌旁正常组织，纳入标准：初次确诊为乳腺癌；治疗前未进行放疗、化疗及免疫治疗。本研究通过南方医科大学中西医结合医院伦理委员会批准（伦理审批号：2022-070）。MCF10A、MDA-MB-231、MCF7、HCC1937、T47D和SKBR3细胞系均由南方医科大学中西医结合医院中心实验室保存。

主要试剂：PBS粉末、Tween20/TBS溶液（20×TBST，北京雷根公司）；RIPA蛋白裂解液（Strong）、蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂（康为世纪公司）；RPMI DMEM培养基（Biological Industries）；MCF10A细胞专用培养基（武汉普诺塞公司）；南美源胎牛血清（上海微科公司）；Lipofectamine 2000转染试剂（Invitrogen）；PAGE 凝胶快速制备试剂盒、蛋白预染Marker、ECL发光显影剂（上海雅酶公司）；PVDF膜（Millipore）；RNA提取试剂盒（FOREGENE），细胞周期检测试剂盒购自Dojindo（日本同仁化学）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析

本研究采用GEPIA数据库（http： //gepia.cancer-pku.cn/）对CDHR2在乳腺癌组织和正常乳腺上皮组织中表达情况进行对比，通过两独立样本t检验分析两组间表达差异情况，样本量包括癌组织1085例，正常组织112例。利用Kaplan-Meier Plotter （https：//kmplot.com）对CDHR2与乳腺癌预后的关系进行分析。使用STRING（https：//cn.string-db.org）对CDHR2与PI3K、AKT、CCND1及其他可能存在的蛋白进行相互结合作用预测，网站参数设置：Homo sapiens，confidence（0.15）。

1.2.2 免疫组化

将组织切片置于烤箱60 ℃烘烤120 min，经二甲苯及梯度浓度酒精脱蜡脱水后，向切片滴加适量3% H₂O₂以阻滞内源性过氧化物酶，室温静置15 min，去离子水洗3次，柠檬酸钠抗原修复液高温处理8 min，于室温条件下自然冷却，室温下山羊血清封闭30 min，加入CDHR2抗体（1∶2000）4 ℃处理下过夜。PBS清洗3次，将组织切片与带有HRP结合的二抗孵育30 min，DAB显影，细胞核用苏木素进行染色，免疫组化评分：染色强度分为0~3分，阴性0分，弱阳性1分，阳性2分，强阳性3分。染色范围1%~25%为1分，26%~50%为2分，51%~75%为3分，76%~100%为4分，最终评分=染色强度评分×染色范围评分。

1.2.3 细胞培养

乳腺上皮细胞MCF10A使用专用完全培养基培养，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF7、HCC1937、T47D、SKBR3均使用含10%胎牛血清的RPMI DMEM培养，将细胞放置在37 ℃、5%CO₂条件下静置培养。每3 d传代1次，当细胞生长状态良好、处于对数生长期时，用胰酶消化、离心后使用培养基重悬得到单细胞悬液，然后根据实验需要对细胞进行后续实验。

1.2.4 qRT-PCR

取对数生长期细胞，提取实验细胞中总RNA，检测浓度和纯度合格后取2 μg RNA逆转录合成cDNA，根据试剂盒说明书进行PCR扩增。利用相对量化方法，通过比较2^-ΔΔCt来计算基因的倍数变化，将 GAPDH作为内参。引物从生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列：GAPDH正向引物CAATGACCCCTTCATTGACC；GAPDH反向引物GACAAGCTTCCCGTTCTCAG；CDHR2正向引物CCCCGAAGTTCCTAGCCAAC；CDHR2反向引物GTCTTCCGCTACCAACCAGA。

1.2.5 Western blot实验

计算所提取细胞蛋白含量30 μg，以3∶1的比例蛋白与上样缓冲液4×SDS进行混合，置于95 ℃金属浴锅10 min后放置于冰上2 min。制胶后进行SDS-PAGE电泳，使其在80 V电压下保持30 min，而分离胶在120 V下保持90 min。转膜采用湿式转膜法至PVDF膜。置于含有5% BSA的 TBST密封液的平板中，于室温下培养1 h。将一抗用封闭剂稀释，于室温孵育1 h，4 ℃孵育1夜。TBST 洗膜3次，5 min/次。孵育二抗1 h后，TBST洗膜3次，5 min/次，即可加入ECL显色试剂显影拍照记录。CDHR2多克隆抗体（1∶1000）、GAPDH单克隆抗体（1∶50 000）、Akt S473单克隆抗体（1∶1000）、Cyclin D1多克隆抗体（1∶5000）、β-Tubulin多克隆抗体（1∶12 000），PI3K T458多克隆抗体（1∶1000，CST）。

Western blotting灰度值分析选用Image J软件协助定量分析，对所有条带进行灰度测定后，获得对应研究基因和内参的区域像素值之和，以研究基因/内参基因之比。最后将目的蛋白灰度值除以内参蛋白的灰度值，进行归一化处理。

1.2.6 细胞转染

通过上海吉凯公司订购CDHR2过表达质粒，当MCF-7和MDA-MB231细胞处于对数生长期、细胞状态良好时，消化MCF-7和MDA-MB231细胞，进行细胞计数；向六孔板各孔中接种5×10⁵个细胞；转移培养皿至恒温培养箱（37 ℃，5% CO₂）。待细胞贴壁后按照Lipofectamine™2000转染说明书转染至MCF-7和MDA-MB231细胞。将处理后的细胞分别为对照组（NC组）及过表达CDHR2组（CDHR2组），转染六孔板放至恒温37 ℃，5% CO₂培养箱放置6~8 h后更换新的完全培养基，细胞转染48 h后，可收集瞬时转染的细胞进行Western blotting实验及其他功能试验。

1.2.7 CCK-8实验

CCK8试剂盒购自南京诺唯赞生物公司，将MDA-MB-231及MCF7细胞离心计数接种于96孔板中，2000个细胞每孔，在贴壁后0、24、48、72、96 h检测细胞活力。然后每孔加CCK8试剂10 uL，在37 ℃培养箱继续培养2 h，用酶标仪在450 nm处测定各孔的吸光度（A），A值反映了肿瘤细胞的增殖能力。每组重复3次实验，取平均值，记录生长曲线。

1.2.8 EdU实验

采用锐博的Edu试剂盒进行检测，首先以1∶1000比例对Edu溶液（试剂A）进行稀释，用细胞培养基将其配制为50 μmol/L Edu培养基；在37 ℃恒温培养箱孵育2 h，去除细胞中的培养基；用PBS对细胞进行清洗，每次清洗5 min，清洗3次；在每孔中添加50 μL细胞固定液（即PBS中含有4%的POM），在室温下孵育30 min，去除固定液；添加50 μL 2 mg/mL甘氨酸，在脱色摇床温养5 min，然后丢弃甘氨酸（用于中和的聚甲醛）；在每孔中再添加100 μL的PBS，洗涤5 min的脱色摇床，将PBS除去；在每孔中添加100 μL渗透剂（PBS，0.5%Trition-X-100），在脱色摇床孵育10 min，然后用PBS洗涤5 min 1次；在每孔中添加100 μL的 Apollo染色剂，避光，在脱色摇床室温育20 min，弃染；添加100 μL渗透剂（PBS，0.5%Trition-X-100），在脱色器中洗涤2~3次，每次10 min，除去渗透剂；在每个孔中添加DAPI 100 μL，在光照下，在脱色摇床室温育5 min，除去染色反应溶液；每孔用100 μL PBS冲洗。

1.2.9 流式细胞术检测细胞周期

细胞从培养箱中取出，PBS洗3遍；加胰酶消化，加含有血清的培基终止消化；移入离心管中静置，离心<500 r/min，弃上清； 将细胞重新悬浮在0.5 mL 1×PBS中，并快速注入3.5 mL 70%预冷乙醇中搅拌，室温4 ℃保存1夜，次日将经乙醇提取的细胞进行离心，弃去上清，用1×PBS冲洗3次，除去残余酒精。应用含有0.2 mg RNase A的1 mL PI/Triton X-100染色液（20 μg PI/0.1% Triton X-100）重悬细胞，37 ℃染色15 min。应用流式细胞仪BD FACSCalibur测定细胞周期。

1.2.10 统计学方法

本研究用 SPSS统计24.0和 GraphPad Prism9.0进行绘图，计量资料以均数±标准差表示，使用两独立样本t检验进行两组间的比较，单因素方差分析用于比较多组数据的差异，生存曲线用Logrank比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDHR2在乳腺癌患者中的表达及生存预后

通过TCGA数据集对CDHR2表达进行分析，结果显示在乳腺癌及癌旁中CDHR2表达量均较低且两者间差异无统计学意义（P>0.05，图1），Kaplan-Meier Plotter在线数据分析CDHR2在乳腺癌患者中的生存预后，发现在三阴型、luminal A型、luminal B型、Her2过表达型乳腺癌患者中，CDHR2高表达患者预后更好，其中CDHR2过表达的三阴型、luminal A型、luminal B型乳腺癌患者，其总生存期（OS）均高于低表达CDHR2的乳腺癌患者（P<0.05，图2）。免疫组化显示CDHR2蛋白在乳腺癌组织中表达明显下调（图3，P<0.0001）。

2.2 CDHR2在乳腺癌细胞系及正常人乳腺上皮细胞中的表达水平

qRT-PCR结果显示CDHR2在乳腺癌细胞系中表达较正常人乳腺上皮细胞MCF10A相比显著下降，差异有统计学意义（P<0.01，图4）。Western blotting检测结果提示，CDHR2在乳腺癌细胞中，尤其是在MDA-MB-231、MCF7细胞中表达水平较低（图5）。

2.3 过表达CDHR2转染结果验证

选取MDA-MB-231及MCF7两株细胞进行实验，首先过表达质粒转染乳腺癌细胞系，qRT-PCR测定转染细胞中CDHR2的表达量，在乳腺癌细胞系MDA-MB-231及MCF7中，CDHR2的表达量要远高于对照组（P<0.001，图6）。

2.4 过表达CDHR2抑制乳腺癌细胞增殖

CCK8实验结果显示在MDA-MB-231及MCF7细胞中，CDHR2高表达组在第3、4、5天的增殖活力显著降低（P<0.01，图7）。相较于对照组，CDHR2过表达组MDA-MB-231及MCF7细胞中的S期细胞比例显著减少（P<0.01，图8）。

2.5 过表达CDHR2抑制乳腺癌细胞的细胞周期

流式细胞术结果显示，过表达CDHR2基因能使细胞周期阻滞在G0/G1期，且过表CDHR2后乳腺癌细胞的S期细胞比例明显减少，最终改变乳腺癌细胞增殖能力，差异具有统计学意义（P<0.01，图9）。

2.6 CDHR2通过PI3K/Akt通路抑制乳腺癌细胞生长和细胞周期

Western blotting检测PI3K/Akt通路和细胞周期相关蛋白的表达变化。结果显示：相较于对照组，过表达CDHR2可以抑制p-PI3K和p-Akt蛋白的表达，同时对周期蛋白Cyclin D1的表达也具有抑制作用（P<0.001，图10）。

2.7 CDHR2相互结合作用蛋白

STRING在线工具对CDHR2可能存在的相互结合作用蛋白进行预测（图11），显示CDHR2与CDC42、CDHR5基因存在相关性（r=0.115，0.328）。

3 讨论

乳腺癌是全世界女性最常见的癌症类型^［10］，发病率呈逐年上升，且呈年轻化发展趋势，其病死率在女性恶性肿瘤患者中仅次于肺癌。乳腺癌根据激素受体进行分子分型总共4种。第1种类型是luminal A类型，表示雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）为阳性，而HER-2受体表达为阴性。第2种是luminal B型，即ER和PR均为阳性，而HER-2也呈阳性。第3种是HER-2过表达型，ER阴性，PR阴性和HER-2阳性。第四种类型是ER，PR和HER-2均为阴性，也称为三阴型乳腺癌^［11］。随着肿瘤手术、放化疗、分子治疗等进展^{［12， 13］}，乳腺癌总体预后有了较好的改善，但其复杂的分子机制仍需进一步探讨。

钙粘蛋白相关家族成员2（CDHR2）也被命名为 PCDH24属于原钙粘蛋白家族，PCDH 家族在钙依赖性细胞粘着中扮演重要角色^{［5， 14］}。在许多人类癌症（包括乳腺癌，白血病，成胶质细胞瘤，胃癌，结直肠癌，食道癌和辐射诱发的肺癌）中已经报道了一些 PCDH 家族成员（例如 PCDH8，PCDH9，PCDH10，PCDH17和 PCDH20）的表达丧失，表明PCDH可以作为人类癌症的肿瘤抑制剂^［15-17］。研究表明，CDHR2在上皮细胞侧壁的接触抑制过程中发挥着关键的作用，并可能导致接触抑制起到抑癌作用。CDHR2是一种与多种癌症相关的蛋白，其在多种癌症中发挥着重要的抑制或促进作用。例如CDHR2在肝癌和结肠癌中低表达，在肝癌中通过AKT失活以及COX-2表达下调来实现保护作用^［18］，在HCT116结肠癌细胞中表达升高诱导接触抑制，从而完全消除体内肿瘤的形成^［19］。一致的是，CDHR2可以抑制β-连环蛋白介导的细胞-细胞相互作用，导致细胞增殖抑制和肿瘤生长停滞在结直肠癌^［20］。然而，CDHR2在乳腺癌癌中的作用及其机制还知之甚少。

本研究首先通过TCGA数据集对CDHR2表达进行分析，由于CDHR2相对表达量较低，因此在乳腺癌及癌旁中CDHR2表达量差异无统计学意义，查阅已有文献报道，CDHR2在乳腺癌中亦可能作为抑癌基因起效^［15-17］。进一步使用Kaplan-Meier Plotter在线数据分析CDHR2在三阴型、luminal A型、luminal B型、Her2过表达型乳腺癌患者中的生存预后，我们发现在4种乳腺癌类型中趋势均为CDHR2高表达患者预后更好，但在Her2过表达型乳腺癌患者的生存曲线尚不具有统计学意义，可能与Her2过表达型乳腺癌患者样本数量有关，亦或者CDHR2在三阴型乳腺癌或luminal型乳腺癌中发挥作用更加显著，但总的来说CDHR2高表达有利于乳腺癌患者的生存预后。但总的来说CDHR2高表达有利于乳腺癌患者的生存预后。于是我们利用免疫组化、Western blotting和qRT-PCR实验进一步证明了CDHR2在乳腺癌组织及细胞中表达下调，在表达较低的乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF7中成功过表达CDHR2，通过CCK-8实验和EdU实验表明过表达CDHR2能抑制乳腺癌细胞的增殖能力，进一步通过流式细胞术细胞周期实验发现过表达CDHR2能够使细胞周期阻滞在G0/G1期，从而抑制乳腺癌细胞生长。这提示CDHR2在乳腺癌中是一个抑癌基因。

PI3K/Akt是调控细胞生长、增殖、迁移、生存及凋亡的重要途径，该通路的异常激活可导致多种肿瘤细胞的存活和增殖^［21-23］。CCND1，即G1/S特异性细胞周期蛋白，调节从G1期向S期过渡的细胞周期过程^［24］。越来越多的研究表明，许多基因通过调节 CCND1 影响肿瘤细胞的活力和迁移^［25］。有研究表明CDCA2通过激活 PI3K/AKT途径调节 CCND1的表达促进结直肠癌细胞增殖^［26］。另外，有研究发现多个基因在多种疾病中可以作用于PI3K/AKT信号通路进而影响细胞周期^［27］。本研究通过Western blotting发现过表达CDHR2可以抑制p-PI3K和p-Akt蛋白的表达，下调蛋白Cyclin D1的表达，据此，我们提出假说：CDHR2可能通过调控PI3K/Akt信号途径，下调 CyclinD1的表达，进而影响乳腺癌细胞的增殖和周期。

蛋白质-蛋白质相互作用在细胞的 DNA复制，转录调节，信号转导变异，分子运输以及识别和修饰外来分子等方面发挥着重要作用^［28-30］。我们通过String在线分析CDHR2的候选相互作用蛋白。后续研究中我们可以着眼于蛋白间相互作用，进一步探究细胞内信号传导的分子基础CDHR2调控细胞周期的具体机制。

综合而言，本研究证实了CDHR2在乳腺癌细胞中的表达水平及重要作用，有望为乳腺癌的治疗提供新的靶点和理论依据。

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