艰难梭菌的感染特征及其危险因素：基于中南地区某市住院腹泻患者的标本

Analysis of Clostridioides difficile infection characteristics and risk factors in patients hospitalized for diarrhea in 3 university hospitals in a mid-south city of China

摘要

目的 调查并分析中南地区某市住院腹泻患者艰难梭菌感染情况及相关危险因素。 方法 收集2020年10~12月湘南学院附属医院、附属第一医院和附属第三医院的住院腹泻患者粪便标本共306例，厌氧培养法分离艰难梭菌菌株，采用实时荧光定量PCR检测A、B毒素基因tcdA、tcdB及二元毒素基因cdtA、cdtB；16S rDNA确定无杂菌携带的艰难梭菌菌株，进行多位点序列分型（MLST）；使用Etest条进行耐药性检测；以是否感染艰难梭菌为分组依据，比较分析住院腹泻患者艰难梭菌感染的危险因素。 结果 住院腹泻患者产毒艰难梭菌感染率为8.17%（25/306），毒素基因均为tcdA+tcdB+，未检出二元毒素；分离出无杂菌携带艰难梭菌7株，5种ST型，分别为ST54 3株，ST129、ST98、ST53和ST631各1株，均位于clade1群；所有菌株对甲硝唑和万古霉素敏感。半年内住院史（OR=3.675，95% CI：1.405~9.612）、PPI用药史（OR=7.107，95% CI：2.575~19.613）、近1个月抗生素使用≥1周（OR=7.306，95% CI：2.274~23.472）、非甾体类抗炎药用药史（OR=4.754，95% CI：1.504~15.031）、患胃肠疾病（OR=5.050，95% CI：1.826~13.968）是腹泻患者艰难梭菌感染的危险因素。 结论 目前该市住院腹泻患者艰难梭菌感染率水平不高，感染毒素类型为A+B+，基因型以clade1群和ST54型为主，对甲硝唑和万古霉素敏感。建议临床重视对有艰难梭菌感染危险因素暴露史的患者加强预防，减少艰难梭菌院内感染。

Abstract

Objective To investigate the characteristics of Clostridioides difficile infection (CDI) in patients hospitalized for diarrhea and analyze the risk factors for CDI. Methods Stool samples were collected from 306 patients with diarrhea hospitalized in 3 university hospitals in a mid-south city of China from October to December, 2020. C. difficile was isolated by anaerobic culture, and qRT-PCR was used to detect the expressions of toxin A (tcdA) and B(tcdB) genes and the binary toxin genes (cdtA and cdtB). Multilocus sequence typing (MLST) was performed for the isolated strains without contaminating strains as confirmed by 16S rDNA sequencing. Etest strips were used to determine the drug resistance profiles of the isolated strains, and the risk factors of CDI in the patients were analyzed. Results CDI was detected in 25 (8.17%) out of the 306 patients. All the patients tested positive for tcdA and tcdB but negative for the binary toxin genes. Seven noncontaminated C. difficile strains with 5 ST types were isolated, including 3 ST54 strains and one strain of ST129, ST98, ST53, and ST631 types each, all belonging to clade 1 and sensitive to metronidazole and vancomycin. Hospitalization within the past 6 months (OR=3.675; 95% CI: 1.405-9.612), use of PPIs (OR=7.107; 95% CI: 2.575-19.613), antibiotics for ≥1 week (OR=7.306; 95% CI: 2.274-23.472), non-steroidal anti-inflammatory drugs (OR=4.754; 95% CI: 1.504-15.031) in the past month, and gastrointestinal disorders (OR=5.050; 95% CI: 1.826-13.968) were all risk factors for CDI in the patients hospitalized for diarrhea. Conclusion The CDI rate remains low in the hospitalized patients with diarrhea in the investigated hospitals, but early precaution measures are recommended when exposure to the risk factors is reported to reduce the risk of CDI in the hospitalized patients.

关键词

艰难梭菌 / 毒素基因 / 多位点序列分型 / 耐药性 / 危险因素

Key words

Clostridioides difficile / toxin gene / multilocus sequence typing / drug resistance / risk factors

艰难梭菌（CD）是一种革兰阳性、产芽孢的专性厌氧菌，被认为是医疗机构相关性腹泻的主要病原^［1，2］。艰难梭菌感染（CDI）的主要临床表现为腹泻，也可伴有腹痛和发热等，重度可致死^［3］，被美国疾控中心列为与抗生素相关的紧急公共卫生威胁^［4］。过去20年里，随着监测、干预、治疗的加强以及相关指南的完善，欧美国家的CDI发生率和致死率目前基本维持在相对稳定的水平^［2］。近10年，我国学者开始重视对艰难梭菌的研究，一项针对综合性医院的老年住院患者调查，发现了6例聚集性CDI病例^［5］。学者通过基因组学研究医院出现的聚集性CDI病例，分析了艰难梭菌院内传播的可能途径^［6］。国内一项针对住院腹泻患者艰难梭菌的调查显示，院内艰难梭菌感染率达到了30%^［7］，提示该菌在我国已成为医院感染的一种重要病原菌。但相对于欧美发达国家，我国针对艰难梭菌的监测和研究仍然有限。国内已有的研究资料表明，艰难梭菌的人群分布和地区分布特点具有明显差异，华东、华东南、华北、西南部等地区的艰难梭菌感染各具特点^［8］，而从目前检索的结果来看，中南地区缺乏相关研究报道。因此，本研究拟通过调查中南地区某市3所三级医院住院腹泻患者CDI的情况，分析其相关危险因素，为预防控制此类感染提供有益补充。

1 资料和方法

1.1 研究对象

本研究最小样本量估算依据为：n=4p（1-p）/d²=233，P=0.30^［7］，d=0.2p。研究对象选自2020年10月~12月湖南省郴州市湘南学院附属医院、附属第一医院和附属第三医院的住院腹泻患者。纳入标准：存在腹泻症状，腹泻次数≥3次/d，水样便或糊状。排除标准：除艰难梭菌以外，明确由其他病原体感染导致的腹泻；近期灌肠或使用过泻药；食物中毒导致的腹泻。按照上述标准，共纳入306例研究对象，按是否感染艰难梭菌分为2组，其中感染组25例：男性15例，女性10例，平均年龄63（49~70）岁，平均住院时间11（8~15）d；非感染组281例：男性178例，女性103例，平均年龄55（44~66）岁，平均住院时间10（6~13）d。本研究符合《赫尔辛基宣言》原则，不违背医学伦理，患者知情同意，自愿参与研究，并通过湘南学院伦理委员会审批（审批号：XNXY2020022）。

1.2 流行病学资料采集

通过询问病史及查阅病例资料收集患者流行病学资料，包括：性别、年龄、住院时间、半年内住院史、近1个月内抗生素用药情况、近1个月抑酸药用药情况、近1个月糖皮质激素用药情况、近1个月免疫抑制剂用药情况、近1个月胰岛素用药情况、近1个月内过非甾体类抗炎药用药情况、胃肠道手术史、临床症状（腹痛、水样便、呕吐、发热、大便隐血），记录实验室相关检查指标（血液白细胞计数、血清C反应蛋白、降钙素原PCT、血钠）、基础性疾病（糖尿病、恶性肿瘤、神经性疾病、心血管疾病、胃肠疾病、肝胆疾病）等。

1.3 艰难梭菌检测主要试剂与仪器

RR390A PCR反应体系试剂盒（TaKaRa）；艰难梭菌毒素基因提取试剂盒（TIANGEN）；艰难梭菌毒素基因tcdA、B荧光定量PCR试剂盒（探针法）（青岛中创汇科生物公司）；冷冻离心机（Thermo）；7500实时荧光定量PCR仪（ABI）。

1.4 艰难梭菌检测方法

1.4.1 粪便标本采集

采集患者新鲜粪便标本置于灭菌容器，1 h内送检。将每份粪便分为2份，一份进行厌氧培养，并对可疑阳性菌株进行tcdA、tcdB毒素及二元毒素基因的PCR检测，另一份保存于超低温冰箱。

1.4.2 艰难梭菌培养与镜检

标本与无水酒精混匀，室温下静置60 min，3000 r/min离心10 min，沉淀全部移入艰难梭菌选择培养基（CCFA），厌氧环境37 ℃培养48 h。典型艰难梭菌菌落呈“摊鸡蛋样”，淡黄色或灰白色、有特殊臭味、紫外线下可见荧光。艰难梭菌是粗大杆菌，形似火柴棍，革兰氏染色阳性，芽胞位于菌体的次极端。

1.4.3 艰难梭菌毒素A/B及二元毒素基因cdtA、cdtB检测

使用基因提取试剂盒提取疑似菌株毒素DNA，PCR检测A、B毒素基因tcdA、tcdB及二元毒素基因cdtA、cdtB。合成引物、探针由中国疾病预防控制中心提供，检测方法参考文献［9, 10］。反应体系：Premix Ex Taq（Probe qPCR）2×（TakaraRR390A）10 μL，PCR Forward primer（10 μmol）0.4 μL，PCR Reverse primer（10 μmol）0.4 μL，Probe（10 μmol）0.8 μL，Rox Reference DyeⅡ0.2 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O6.2 μL。反应条件：95 ℃ 20 s，1个循环；95 ℃ 3 s，58 ℃ 30 s，40个循环。同时设置对照，以出现典型扩增曲线，Ct值<35为阳性，无典型扩增曲线出现为阴性。

1.5 16S rDNA扩增产物测序比对

由于临床粪便标本中杂菌较多，在厌氧培养过程，培养出的艰难梭菌易携带杂菌^［11］，本研究筛选毒素基因PCR检测为阳性的菌落，接种至脑心浸液肉汤培养基（BHI），厌氧环境37 ℃培养24 h后，提取DNA，16S rDNA基因扩增，目的条带1465 bp，将结果与NCBI（blast.ncbi.nlm.gov/Blast.cgi）比对，确定是否为无杂菌携带的艰难梭菌，然后进行MLST分型和药敏试验。

1.6 多位点序列分型（MLST）

选取adk、recA、sodA、tpi、atpA、dxr、glyA等7个管家基因，PCR扩增，引物参考相关研究^［12］，反应体系为50 μL：Premix Taq酶（TAKARA）25 μL，ddH₂O 20 μL，上/下游引物（20 pmol/μL）1/1 μL，DNA模板（20~80 ng/μL）3 μL。PCR循环参数：95 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 70 s，35个循环，最后72 ℃ 5 min。拼接DNA序列，与数据库（http：//pubmlst.org/clostridium difficile）比对，得到等位基因谱，生成相应的序列型（ST）及clade群。

1.7 药敏试验

根据美国临床实验室标准化协会文件2021 CLSI-M100推荐的药敏试验抗生素确定抗生素名单，本次测试8类9种抗生素：万古霉素（VAN）、甲硝唑（MTZ）、利福平（RIF）、莫西沙星（MXF）、四环素（TET）、美罗培南（MEM）、氯霉素（CHL）、红霉素（ERY）、克林霉素（CLI），使用Etest条测试艰难梭菌分离株的耐药性，Etest条的折点参考相关研究^［13］，结果分为对抗生素的耐药、中介和敏感，对≥3类抗生素产生耐药的菌株定义为多重耐药株（MDR），质控菌株为ATCC700057。

1.8 统计学分析

采用SPSS25.0软件进行统计分析。计数资料以n（%）表示，组间比较采用χ^２检验，理论频数小于5时进行连续性校正。正态分布的连续变量以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。住院时间为偏态分布，用M（P₂₅~P₇₅）表示，组间比较采用非参数秩和检验，检验统计量为z值。采用logistic回归分析筛选可能得危险因素。当P<0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 腹泻患者艰难梭菌检测结果

2.1.1 毒素基因检测结果

腹泻患者粪便标本共306例，其中检出艰难梭菌毒素基因25例，感染阳性率8.17%。25例均同时含有tcdA和tcdB毒素基因，cdtA、cdtB二元毒素未检出。

2.1.2 MLST分型和药敏试验结果

经16S rDNA测序后，分离出无杂菌携带的艰难梭菌7株。经MLST分型，分出5种ST型，分别为ST54型3株，ST129型1株，ST98型1株，ST53型1株和ST631型1株，均位于clade1群。药敏试验显示，菌株对9种抗生素出现不同程度的耐药，其中ST53型和ST631型该2株菌株为多重耐药菌株；ST129型该菌株对9种抗生素均敏感；所有菌株对万古霉素和甲硝唑均敏感（表1）。

2.2 腹泻患者艰难梭菌感染危险因素分析

本次研究分析的因素共27项。其中患者基本情况、病史、用药史等因素18项，单因素分析结果显示，年龄、半年内住院史、近1个月PPI用药史、近1个月糖皮质激素用药史、近1个月抗生素使用史、近1个月非甾体类抗炎药用药史、患胃肠疾病和肝胆疾病，共8个因素为住院腹泻患者艰难梭菌感染的主要危险因素（P>0.05），其他因素未显示统计学意义（P>0.05，表2）；临床表现和实验室检查指标9项，分析结果显示，除发现CDI组更易出现大便隐血外，其余临床表现在两组间无统计学差异（P>0.05，表3）。

2.3 多因素Logistic回归分析

将单因素分析筛选出的8个危险因素作自变量，以腹泻患者艰难梭菌感染为因变量，进一步进行多因素Logistic回归分析，结果显示，半年内住院史、PPI用药史、近1个月抗生素使用≥1周、非甾体类抗炎药用药史、患胃肠疾病是腹泻患者艰难梭菌感染的危险因素（P<0.05，表4）。

3 讨论

本次研究发现住院腹泻患者艰难梭菌感染率为8.17%（25/306），该结果低于欧美国家住院腹泻患者12.1%的CDI发病率^［14］；略高于中国西部ICU患者4.3%的艰难梭菌感染率^［15］，但低于其他大多数地区^{［7， 16， 17］}。目前在我国中南地区开展的相关研究不多，通过上述比较分析，初步判断中南地区艰难梭菌感染率整体水平不高。不同地区的住院腹泻患者艰难梭菌感染率存在差异，可能与各地的病原微生物流行病学以及抗菌谱存在差异有关，也与饮食习惯、地理位置有一定关系。进一步检测CD毒素基因型，发现均为tcdA+tcdB+cdtA-cdtB-，说明该地区CDI以同时产A/B毒素（tcdA+tcdB+）为主，且二元毒素ctdA、B基因均为阴性，与国内其他地区基本一致^{［18，19］}。这与欧美国家不同，欧美的艰难梭菌毒素基因型以tcdA+tcdB+cdtA+cdtB+为主^［20］。

艰难梭菌的优势ST型和耐药性具有地区差异。clade1群是中国艰难梭菌菌株的主要种群，其中ST54是优势型别，大约占29.2%^{［21， 22］}；我国艰难梭菌对红霉素、克林霉素、沙星类药物和氟喹诺酮类药物的耐药率较高，对甲硝唑和万古霉素几乎没有耐药^［23］。本次研究分离出7株艰难梭菌确定无杂菌携带并进一步进行MLST分型和耐药性分析，结果显示7株艰难梭菌均位于clade1群，ST54型占比最高（3/7）；对大环内酯类药物红霉素和克林霉素的耐药率最高（6/7），对万古霉素和甲硝唑均敏感。但是由于例数不多，对分析结论的可靠性和推广性会造成影响，只能为分析该地区艰难梭菌的特点提供一些参考。

本研究进一步探索CDI可能的危险因素结果表明，有半年内住院史、近1个月PPI用药史、近1个月非甾体类抗炎药用药史、胃肠疾病患者、近1个月抗生素使用≥1周更易被艰难梭菌感染，可能与CDI发生有关。长时间的住院明显增加了患者发生艰难梭菌定植和院内感染的风险，这与其他学者的研究结果一致^{［24， 25］}。当胃粘膜受到损害时，人体消化道更易受到艰难梭菌的侵害，PPI抑酸制剂使胃酸分泌受到抑制，影响胃酸对细菌的杀灭作用；非甾体类抗炎药能抑制COX-1环氧化酶从而削弱COX-1对胃粘膜的保护；胃肠道疾病导致胃肠道保护屏障被破坏，它们都是CDI的危险暴露因素^{［26， 27］}。

本研究发现，抗生素与CDI的关系与其使用时长有关，与刘俊枫等^［26］的结论一致。抗生素暴露作为CDI的独立危险因素已经成为共识^{［28, 29］}，其主要机制为广谱抗生素致使宿主肠道菌群的多样性和平衡性受到破坏，有益肠道微生物数量减少，导致艰难梭菌在肠道过度生长并释放毒素引起腹泻。虽然本次单因素分析表明近1个月抗生素使用史为住院腹泻患者CDI的危险因素（χ^２=12.762，P=0.002），但进一步多因素分析则发现，使用抗生素≤1周在两组间并无差异（Wald χ^２=2.011，P=0.156），说明抗菌药物使用的时长是引起CDI相关腹泻需要考虑的因素，当患者长时间使用抗生素，需密切监测患者的艰难梭菌感染情况并及时采取措施。

既往研究显示^{［30， 31］}，老年人群更易罹患CDI，但本次研究结果未发现两组年龄差异有统计学意义。这可能与老年人群发病率、复发率及病情复杂程度更高有关。虽然单因素结果显示老年人群CDI风险增加，但潜在的其他原因较多，实际年龄可能只是混杂因素，这一结果与某些学者观点一致^［32］。因此关于年龄与CDI的关系需要进一步研究。

本研究存在一些局限性：本研究的样本主要来自该市三家综合医院，可能无法代表整个中南地区的住院腹泻患者情况；部分变量的某些水平结局事件数过少，从而导致OR值可信区间较宽。因此今后还需要扩大菌株来源和人群范围，进行更系统的分析住院腹泻患者艰难梭菌感染相关影响因素、毒素基因和耐药特点。

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