5-羟基-6，7-二甲氧基黄酮抑制流感病毒诱导A549细胞炎症反应和铁死亡的作用及机制

Inhibitory effect of 5-hydroxy-6,7-dimethoxyflavone on H1N1 influenza virus-induced ferroptosis and inflammation in A549 cells and its possible mechanisms

摘要

目的 研究四方蒿中提取出的5-羟基-6，7-二甲氧基黄酮（5-HDF）对H1N1流感病毒引起的肺损伤的保护作用及潜在机制。 方法 使用H1N1流感病毒感染A549细胞制作流感病毒感染模型，检测5-HDF的细胞毒性及其对感染病毒后的炎症和铁死亡相关指标及相关信号通路蛋白的影响。采用乙醇回流提取和硅胶色谱法从四方蒿中提取分离获得5-HDF，并采用NMR和MS鉴定其结构。采用MTT法检测不同浓度的5-HDF对A549细胞的毒性；H1N1流感病毒以0.1的感染复数感染A549细胞；采用流式细胞术检测5-HDF对感染H1N1流感病毒后A549细胞中TRAIL和IL-8表达水平的影响；Western blotting检测phospho-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）、phospho-NF-κB p65（Ser536）、cleaved caspase3、cleaved PARP、SLC7A11、GPX4等炎症、细胞凋亡和铁死亡相关蛋白表达的水平。通过鼻腔接种50 μL半数致死量（LD₅₀）的H1N1流感病毒液复制小鼠H1N1流感病毒感染模型，以体质量变化率、肺解剖结果、肺组织病理形态变化为指标，考察5-HDF（30 mg/kg、60 mg/kg）体内抗H1N1流感病毒的作用。 结果 MTT结果显示5-HDF在0~200 μg/mL对A549细胞没有明显的细胞毒性（P>0.05）。流式细胞术和Western blotting结果显示，5-HDF能抑制H1N1流感病毒感染的A549细胞中phospho-NF-κB p65和phospho-p38 MAPK的活化，降低促炎因子IL-8的表达，且5-HDF能上调SLC7A11和GPX4等抗铁死亡相关蛋白表达的水平，并抑制凋亡标志物cleaved caspase3和cleaved PARP及凋亡因子TRAIL的表达（P<0.05）。5-HDF灌胃给药7 d，可提高H1N1流感病毒感染导致的小鼠体质量降低，降低因感染H1N1流感病毒而异常升高的肺指数，并减轻其肺组织病变程度（P<0.05）。 结论 本研究推测5-HDF具有一定的抗小鼠H1N1流感病毒感染作用，可能通过增加SLC7A11和GPX4的表达并抑制phospho-NF-κB p65和phospho-p38 MAPK的活化，降低cleaved caspase3和cleaved PARP的表达，来减弱流感病毒H1N1感染A549细胞所引起的铁死亡、炎症反应和细胞凋亡。

Abstract

Objective To investigate the protective effect of 5-hydroxy-6,7-dimethoxyflavone (5-HDF), a compound extracted from Elsholtzia blanda Benth., against lung injury induced by H1N1 influenza virus and explore its possible mechanism of action. Methods 5-HDF was extracted from Elsholtzia blanda Benth. using ethanol reflux extraction and silica gel chromatography and characterized using NMR and MS analyses. In an A549 cell model of H1N1 influenza virus infection (MOI=0.1), the cytotoxicity of 5-HDF was assessed using MTT assay, and its effect on TRAIL and IL-8 expressions was examined using flow cytometry; Western blotting was used to detect the expression levels of inflammatory, apoptosis, and ferroptosis-related proteins. In a mouse model of H1N1 influenza virus infection established by nasal instillation of 50 μL H1N1 virus at the median lethal dose, the effects of 30 and 60 mg/kg 5-HDF by gavage on body weight, lung index, gross lung anatomy and lung histopathology were observed. Results 5-HDF exhibited no significant cytotoxicity in A549 cells within the concentration range of 0-200 μg/mL. In H1N1-infected A549 cells, treatment with 5-HDF effectively inhibited the activation of phospho-p38 MAPK and phospho-NF‑κB p65, lowered the expressions of IL-8, enhanced the expression of anti-ferroptosis proteins (SLC7A11 and GPX4), and inhibited the expressions of apoptosis markers PARP and caspase-3 and the apoptotic factor TRAIL. In H1N1-infected mice, treatment with 5-HDF for 7 days significantly suppressed body weight loss and increment of lung index and obviously alleviated lung tissue pathologies. Conclusion 5-HDF offers protection against H1N1 influenza virus infection in mice possibly by suppressing H1N1-induced ferroptosis, inflammatory responses, and apoptosis via upregulating SLC7A11 and GPX4, inhibiting the activation of phospho-NF‑κB p65 and phospho-p38 MAPK, and decreasing the expression of cleaved caspase3 and cleaved PARP.

Graphical abstract

关键词

四方蒿 / 5-羟基-6，7-二甲氧基黄酮 / 铁死亡 / 抗炎 / 流感病毒

Key words

Elsholtzia blanda Benth. / 5-hydroxy-6,7-dimethoxyflavone / ferroptosis / anti-inflammation / influenza virus

流感病毒感染是一种对生命威胁性极大的疾病，兼具高传染率和高死亡率^［1］。流感病毒感染肺部会导致急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征，其病理特征主要包括弥漫性肺水肿、炎性细胞浸润、肺泡上皮细胞损伤、细胞凋亡等^［2］。在流感病毒感染过程中，宿主会启动自身免疫应答抵抗病毒感染，免疫细胞会释放大量促炎介质，包括白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、干扰素诱导蛋白-10（IP-10）、肿瘤坏死因子-α、单核细胞趋化蛋白-1等，即“炎症因子风暴”^［3］。研究表明NF-κB信号通路和p38 MAPK信号通路的异常活化与炎症风暴密切相关^［4］。同时，NF-κB、p38 MAPK信号通路介导表达凋亡因子FasL、TRAIL，促使流感病毒感染的肺泡上皮细胞启动凋亡程序使细胞死亡^［5-9］。目前临床上仍未有能够有效治疗流感病毒感染导致肺损伤的药物，因此急需探索一种新的药物来治疗该疾病。

四方蒿是唇形科香薷属植物，以叶、花或全草入药，分布在广西、贵州、云南等省份，四季可采，鲜用或切碎晒干或研细备用，收载于《全国中草药汇编》、《中华本草》等书籍中。四方蒿具有发汗解表，利湿止痛之效，用于治疗感冒、肠炎、痢疾、肾炎等疾病；现代研究表明，四方蒿中主要含有黄酮和挥发油类化学成分。黄酮类化合物具有抗氧化^［10］、抗流感病毒作用^［11］，通过调节Bcl-2来抑制心肌细胞凋亡^［12］。5-羟基-6，7-二甲氧基黄酮（5-HDF）分布在香薷属和石荠苎属植物中，主要集中在香薷、海州香薷、四方蒿、石香薷、苏州荠苎和石荠苧中^［13］。既往研究采用LPS诱导RAW 264.7细胞产生病变，并通过实验证明5-HDF具有体外和体内抗炎活性^{［14， 15］}，但其对A549细胞感染H1N1流感病毒后产生的炎症反应及凋亡发生的作用目前尚无相关文献报道。本研究拟通过从四方蒿中提取分离纯化，获得5-HDF，并采用体外实验进一步研究5-HDF对A549细胞感染H1N1流感病毒后产生的铁死亡、炎症和细胞凋亡的抑制作用，旨在揭示5-HDF抗流感病毒的作用机制。

1 材料和方法

1.1 试剂

四方蒿干燥植物材料，2021年11月采自云南元阳县，经广州医科大学潘锡平教授鉴定为唇形科香薷属植物四方蒿。

DMEM/F 12培养基和PBS购于武汉赛维尔生物科技有限公司；EDTA胰酶细胞消化液（Biosharp）；RIPA裂解液（Beyotime）；山羊抗兔二抗（MULTI SCIENCES联科生物）；BCA试剂（Thermo scientific）；流式抗体IP-10、IL-6和IL-8（BioLegend）；一抗p38 MAPK、Phospho-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）、NF-κB p65、Phospho-NF-κB p65（Ser536）、SLC7A11、GPX4、cleaved caspase3、PARP（Cell Signaling）；GAPDH（武汉Affinity Biosciences）。化学试剂甲醇、二甲基亚砜、MTT（Sigma-Aldrich）。

1.2 细胞株和病毒

人肺泡上皮细胞系A549（美国典型培养物保藏中心）。流感病毒株A/PR/8/34（H1N1）由广州呼吸健康研究所和广州医科大学的李菁博士提供。使用10 d龄鸡胚进行病毒扩增，分装，置-80 ℃冰箱保存备用，在Madin-Darby Canine Kidney狗肾细胞（MDCK）中使用标准噬菌斑测定法测定病毒滴度。

1.3 仪器

二氧化碳培养箱、超净工作台和MK3酶标仪（Thermo）；AXIO OBSERVER A1荧光倒置显微镜（Carl Zeiss）；电泳仪（Bio-RAD）；流式细胞仪（Beckman）。

1.4 提取与分离

取四方蒿干燥全草10 kg，切碎，加入80%乙醇回流提取3次，合并提取液，减压浓缩，得浸膏1.6 kg，取浸膏500 g，加水1 L搅拌至溶解，滤集不溶物，水洗，干燥，再用氯仿回流提取3次，浓缩后得膏状物27 g。将氯仿提取所得膏状物与60 g硅胶混合，拌匀，晾干，研细，过筛，装入300 g硅胶柱，先后以石油醚-乙酸乙酯（10∶1、5∶1、3∶1）洗脱，在TLC指导下合并。石油醚-乙酸乙酯（10∶1）洗脱部分再经过硅胶柱层析和结晶纯化，得到黄色针状结晶（288 mg）。

1.5 5-HDF纯度检测

使用液相色谱法检测5-HDF纯度。色谱仪：岛津LC-10ª；检测器：岛津二极管阵列检测器SPD-M10Avp；色谱柱：岛津ODS 4.6×150 mm，5 μm；流动相：甲醇-0.1%甲酸（80∶20）；检测波长：316 nm；保留时间：5.1 min。

1.6 A549细胞的复苏与培养

液氮中冻存的A549细胞37℃水浴解冻。使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基将其接种于培养皿中，置于37℃，5%CO₂恒温培养箱培养24~48 h，当细胞融合度达到80%后进行传代。

1.7 MTT法

A549细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，调整细胞浓度为1×10⁶/mL，分8组接种于96孔板，分别为对照组、5-HDF（25 mg/mL）组、5-HDF（50 mg/mL）组、5-HDF（75 mg/mL）组、5-HDF（100 mg/mL）组、5-HDF（200 mg/mL）组、5-HDF（300 mg/mL）组、5-HDF（400 mg/mL）组。每组设3个复孔，每孔加入100 μL细胞悬液，置于37℃，5% CO₂培养箱培养24 h。待细胞贴壁后，每孔加入100 μL对应浓度的含5-HDF的无血清DMEM培养基，放入培养箱37℃，5% CO₂培养24 h取出。每孔中加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），再放入培养箱培养4 h，吸弃上清，加入二甲基亚砜，使用酶标仪检测A值。细胞存活率（%）=（给药组均值/对照组均值）×100%。

1.8 流式细胞术检测

采用流式细胞术检测感染H1N1流感病毒后5-HDF对A549细胞炎症因子和凋亡因子的影响。取对数生长期的A549细胞，调整细胞密度为1×10⁶ /孔，接种于6孔板中，37℃、5% CO₂孵育24 h，以0.1的感染复数（MOI）感染H1N1流感病毒24 h，然后加入浓度为0、25、50、75 mg/mL的含5-HDF无血清DMEM培养基处理24 h，用胰酶消化收集细胞。加入1 mL的1×Intracellular Staining Perm Wash Buffer重悬细胞，1800 r/min离心5 min；吸弃上清液，每管留下100 μL，分别加入1 μL IL-8、1 μL TRAIL，室温下避光孵育15~30 min；每管加入500 μL含2% BSA的DMEMF-12培养基，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率，FlowJo软件进行结果分析。

1.9 Western blotting

采用Western blotting检测5-HDF对A549细胞相关蛋白的表达影响，设置6个实验分组：对照组、H1N1模型组、H1N1+5-HDF（25 mg/mL）组、H1N1+5-HDF（50 mg/mL）组、H1N1+5-HDF（75 mg/mL）组、5-HDF（50 mg/mL）组。实验步骤如下：A549细胞用含10 %胎牛血清的DMEM培养基培养24 h后，对照组和5-HDF（50 mg/mL）组分别加入1 mL无血清DMEM培养基，H1N1模型组、H1N1+5-HDF（25 mg/mL）组、H1N1+5-HDF（50 mg/mL）组、H1N1+5-HDF（75 mg/mL）组分别加入1 mL含H1N1病毒的无血清DMEM培养基（MOI=0.1）培养24 h。PBS清洗2次，对照组和H1N1模型组加入1 mL无血清DMEM培养基；H1N1+5-HDF（25 mg/mL）组、H1N1+5-HDF（50 mg/mL）组、H1N1+5-HDF（75 mg/mL）组和5-HDF（50 mg/mL）组分别加入1 mL不同浓度的含药无血清DMEM培养基（25、50、75 mg/mL），培养24 h。

用RIPA裂解液在冰上研磨提取蛋白，并用BCA法检测蛋白浓度，通过10% SDS-PAGE凝胶电泳分离后将其转至PVDF膜；5%奶粉室温封闭1 h，将膜分别置于一抗P-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）（1∶1000）、p38 MAPK（1∶1000）、P-NF-κB-p65（Ser536）（1∶1000）、NF-κB-p65（1∶1000）、cleaved caspase3（1∶1000）、PARP（1∶1000）、SLC7A11（1∶1000）、GPX4（1∶1000）、GAPDH（1∶3000）稀释液中4℃孵育过夜。TBST洗涤3次，加入二抗（1∶5000）溶液室温孵育2 h。TBST洗涤3次，避光条件下使用化学成光成相系统进行扫描，使用Image J和Adobe Phstoshop图像处理软件对各蛋白条带进行灰度值量化分析与整理。

1.10 动物实验

雌性C57BL/6小鼠（广东省医学实验动物中心），6周龄，16只，20±2 g。小鼠饲养于SPF级动物房，恒温恒湿，自由饮水和进食，12 h昼夜交替。实验鼠饲料购买于江苏省协同医药生物工程有限责任公司，所有动物实验方案经广州医科大学实验动物伦理委员会批准（伦理批号：20240328）。

小鼠适应性饲养1周后随机分为对照组、H1N1模型组、H1N1+5-HDF（30 mg/kg）组、H1N1+5-HDF（60 mg/kg）组，4只/组。除对照组外，其余3组小鼠均使用乙醚轻度麻醉，在生物安全柜内经鼻腔接种LD₅₀H1N1流感病毒液，50 μL/只，制作H1N1感染模型。对照组小鼠按照同样方法，鼻腔接种生理盐水，50 μL/只。造模结束后，所有小鼠按照分组隔离，并饲养在相同的环境下。

造模12 h后，以0.1 mL/10 g为标准，对照组、H1N1模型组灌胃生理盐水；其余各组分别灌胃对应浓度的5-HDF生理盐水溶液，1次/d，连续7 d。每天记录小鼠体质量变化并计算体质量变化率［体质量变化率（%）=每日体质量/初始体质量×100%］。末次灌胃24 h后，各组小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼处死，取肺组织。全血保存于冰盒中，133 000 r/min离心10 min，取上清，置于-80 ℃冰箱保存，备用。称定小鼠肺组织质量，并计算肺指数［肺指数（%）=肺组织质量/小鼠体质量×100%］。取左侧肺叶固定于4%多聚甲醛溶液48 h，常规脱水石蜡包埋，切片进行HE染色，在光学显微镜下观察并拍照。另一部分肺组织置于-80 ℃冰箱保存，备用。

1.11 统计学分析

实验重复3次，实验数据采用GraphPad Prism9.5.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间差异的比较采用单因素方差分析法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5-HDF结构鉴定

5-HDF黄色针状结晶，mp 162~163 ℃，易溶于氯仿、醋酸乙酯、乙醇、甲醇，不溶于水。UV λ_max：215、272、316 nm（图1A）。IRν cm^-1：2950、1662（酮羰基）、1625、1589（苯环）、1498、1458、1431、1357、1301、1245、1199、1174、1099、1028、1001、972、912、852。ESI-MS m/z：321｛M+Na］x⁺，示相对分子质量298（图1B）。¹HNMR（δ,400MHz, CDCl₃）：12.68（¹H, s, OH-5），3.93（³H, s, OCH3-6），3.97（³H, s, OCH3-7），6.67（¹H, s, H-3），6.57 （¹H, s, H-8），7.88 （²H, m, H-2', 6'），7.53 （²H, m, H-3',5'），7.53 （¹H, m, H-4')）。¹³CNMR（δ,100MHz, CDCl₃）：159.34（C-2），106.03（C-3），183.12（C-4），153.48（C-5），133.20（C-6），164.37（C-7），91.08（C-8），153.74（C-9），106.73（C-10），131.76（C-1'），126.65（C-2'，6'），129.49（C-3'，5'），132.22（C-4'），56.73（OCH3-6），61.23（OCH3-7）。检测图谱（图1C、D）。本品化学结构式（图1E）。纯度检测结果为98.6%（峰面积归一化法，图1F）。

2.2 MTT法检测5-HDF对A549细胞的毒性

A549细胞在5-HDF处理24 h后，对照组细胞存活率为（100.0±1.3）%，当给药浓度在25、50、75、100、200 μg/mL时细胞存活率分别为（96.1±3.1）%、（98.0±2.9）%、（96.7±2.0）%、（100.0±4.6）%、（89.8±5.6）%，与对照组的细胞存活率相比，差异无统计学意义（P>0.05）；当给药浓度为300 μg/mL和400 μg/mL时细胞存活率分别为（32.5±9.3）%、（13.2±0.5）%，与对照组的细胞存活率相比，差异有统计学意义（P<0.001，图2A）。5-HDF的半数抑制浓度为272.4 μg/mL（图2B）。

2.3 5-HDF抗小鼠H1N1流感病毒作用

2.3.1 小鼠体质量变化率及肺指数

造模后第3天起，除对照组外的其余3组小鼠的体质量均下降。造模第7天，与空白组相比，H1N1模型组小鼠的体质量降低（P<0.001），肺指数显著升高（P<0.001）；与H1N1模型组相比，H1N1+5-HDF（30 mg/kg）、H1N1+5-HDF（60 mg/kg）组的小鼠体质量升高（P<0.05），肺指数降低（P<0.01，图3A、B）。

2.3.2 小鼠肺部形态及肺组织病理形态观察结果

对照组小鼠肺泡结构清晰，肺泡大小均匀，气道粘膜上皮结构完整。H1N1模型组小鼠肺组织间肺间隔增厚，支气管部分上皮细胞脱落，有肺泡炎症、肺血管炎症和气管外周炎症等。H1N1+5-HDF（30 mg/kg）、H1N1+5-HDF（60 mg/kg）和H1N1模型组相比，上述病理状态均有减轻（图3C~E）。

2.4 5-HDF抑制H1N1流感病毒感染A549细胞活化P-NF-κB-p65和p38 MAPK信号的通路

与对照组相比，H1N1组的P-p38 MAPK以及 P-NF-κB-p65蛋白的表达水平上升（P<0.01），与H1N1组相比，H1N1+5HDF（25、50、75 μg/mL）组中两种蛋白的表达水平降低（P<0.05，图4A、B）。5-HDF处理抑制了H1N1流感病毒感染A549细胞后上调表达的促炎介质IL-8（P<0.001，图4C~E）。

2.5 5-HDF能抑制H1N1感染引起的细胞凋亡和铁死亡

与对照组相比，H1N1组中凋亡标志物cleaved caspase3和cleaved PARP的蛋白表达水平升高（P<0.001），铁死亡标志物GPX4和SLC7A11的蛋白表达水平降低（P<0.05）；而与H1N1组相比，H1N1+ 5HDF（25、50、75 μg/mL）中cleaved caspase3和cleaved PARP的蛋白表达水平降低（P<0.05，图5A、B），GPX4和SLC7A11的蛋白表达水平升高（P<0.05，图5C、D）。与对照组相比，H1N1组中细胞凋亡因子TRAIL的表达水平升高（P<0.001）；与H1N1组相比，H1N1+5-HDF（25、50、75 μg/mL）组中TRAIL表达水平降低（P<0.05，图5E、F）。

3 讨论

甲型流感病毒感染可以激活肺上皮细胞的细胞死亡程序，包括细胞凋亡和非细胞凋亡。而非细胞凋亡包括铁死亡、坏死性凋亡等^［16］。现代研究表明，四方蒿黄酮类化合物具有抗氧化、抗流感病毒和抗炎作用，但其作用的物质基础和作用机制尚不明确。本研究对四方蒿抗流感药效物质进行了研究，首次发现5-HDF是其有效成分之一，其波谱检测数据与文献报道的5-羟基-6，7-二甲氧基黄酮吻合^［17］，初步验证了5-HDF抗流感病毒、抗炎的作用机制。

研究表明，病原体引起细胞的炎症反应与铁死亡有关系^{［18， 19］}。铁死亡是一种新型的调节性细胞死亡程序之一^［20］，其主要特征是细胞内铁的过度累积和脂质过氧化。研究发现，铁死亡参与了流感病毒引起的肺损伤^［21-25］。System X_c^-（SLC7A11和SLC3A2）和GPX4是抵抗铁死亡脂质过氧化的重要调节机制之一^{［26， 27］}。本研究通过Western blotting检验铁死亡信号通路蛋白表达的变化，结果显示，A549细胞感染H1N1流感病毒后铁死亡关键蛋白SLC7A11和GPX4的表达水平显著下降，而5-HDF的干预可以显著增加其表达水平。SLCA11激活后可以通过调控GPX4的生成来影响脂质过氧化产生，以此保护细胞，避免发生铁死亡。当SLC7A11被抑制后，GSH合成减少，GPX4抗氧化活性降低，活性氧含量增加，过氧化产物如MDA增多，进而导致细胞发生铁死亡^{［28， 29］}。由此推断，5-HDF的干预可以降低被H1N1流感病毒感染后A549细胞内的活性氧含量。

研究显示，细胞内活性氧含量持续增加最终会激活caspase3通路，导致线粒体功能受损，继而导致细胞凋亡^［30］。Caspase3是细胞凋亡过程中的关键因子，cleaved caspase3是caspase3的活化形式，是促进细胞凋亡的主要裂解酶。TRAIL是一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，由281个氨基酸组成，与死亡受体DR4和DR5相结合，形成死亡诱导信号复合物，激活caspase级联反应，进而激活PARP，导致细胞凋亡^［31］。本研究流式细胞术和Western blotting检测结果显示，当A549细胞被病毒感染后，会增强TRAIL的表达水平，增加cleaved caspase3和cleaved PARP的表达，增加细胞凋亡；而5-HDF的干预可以明显抑制这种趋势。因此，本研究认为5-HDF发挥抗流感作用与TRAIL/caspase3/PARP信号通路的激活相关。

激活TRAIL导致细胞凋亡的过程也会同时激活NF-κB信号通路，继而促进IL-8的分泌^［31］。IL-8能够促进炎症介质的合成与分泌，趋化并激活炎症因子聚集于肺部，促进肺部炎症的发生，加重肺损伤，是重要的促炎细胞因子之一^{［32， 33］}。另一方面，当TRAIL与其受体结合后，可以激活一系列的激酶，这些激酶进一步激活MAPK信号通路。MAPK和NF-κB通路是氧化-还原敏感信号通路，活性氧的增加可能会激活这两条通路产生炎症反应^{［34， 35］}。流感病毒感染会使MAPK和NF-κB信号通路异常活化，导致急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征^{［36， 37］}。在A549细胞中，活性氧可激活p38 MAPK和caspase3，并通过激活活性氧/p38 MAPK通路诱导细胞凋亡^［35-38］。实验结果表明，H1N1流感病毒的感染会增加A549细胞中P-NF-κB-p65和IL-8的表达，增加P-p38 MAPK的表达，加重细胞的炎症反应。加入5-HDF进行干预后可以降低P-NF-κB-p65、IL-8和P-p38 MAPK的表达，减轻炎症反应。由此推断，5-HDF抗流感作用机制可能与NF-κB、MAPK信号通路有关。

动物实验结果表明，与对照组小鼠相比，H1N1模型组小鼠的体质量明显降低，肺指数明显升高，肺组织明显受损，病理切片中肺泡壁增厚，肺泡间隙缩小，支气管部分上皮细胞脱落，同时有肺泡炎症、肺血管炎症和气管外周炎症等表现。这表明H1N1流感病毒感染导致了小鼠肺部炎症的产生。而5-HDF的干预可以使感染H1N1流感病毒小鼠的肺指数降低，并抑制小鼠的体质量下降，减少病理切片中的泡壁增厚和炎症表现，这提示5-HDF对H1N1流感病毒导致的小鼠肺部炎症具有一定程度的抵抗作用。

综上所述，本研究表明 5-HDF具有一定的抗小鼠H1N1流感病毒感染作用，在病毒感染导致的线粒体损伤细胞凋亡和炎症反应过程中具有出色的调控作用，其抗凋亡作用可能是通过TRAIL/caspase3/PARP信号通路介导，抗炎症作用可能是通过MAPK/ NF-κB信号通路介导。但5-HDF更具体的作用机制以及其对其他亚型的流感病毒感染的抵抗作用仍需进一步研究。

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