小鼠顶叶皮层反复轻度创伤性脑损伤抑制延髓NLG-1和PSD-95的表达

Repeated mild traumatic brain injury in the parietal cortex inhibits expressions of NLG-1 and PSD-95 in the medulla oblongata of mice

摘要

目的 研究反复轻度创伤性脑损伤（rmTBI）对延髓神经元形态和突触可塑性的影响。 方法 32只雄性ICR小鼠随机分为假手术组（SHAM组，n=8）和rmTBI组（n=24）。使用自由落体打击装置建立rmTBI模型，打击后存活小鼠为rmTBI存活组（rmTBI-S），打击后死亡小鼠为rmTBI死亡组（rmTBI-D）。使用神经损伤评分、翻正反射和强迫游泳实验检测小鼠神经功能障碍，使用苏木素-伊红及尼氏染色观察神经细胞病理形态改变，使用免疫印迹及免疫荧光染色检测神经连接蛋白1（NLG-1）和突触后致密蛋白95（PSD-95）表达水平。 结果 SHAM组小鼠无死亡，rmTBI组死亡率41.67%，差异有统计学意义（P<0.05）；和SHAM组相比，rmTBI-S组小鼠神经损伤评分降低（P<0.001）、翻正反射恢复时间（P<0.001）和强迫游泳不动时间（P<0.05）增加，神经元尼氏小体消失、肿胀坏死；延髓NLG-1（P<0.05）和PSD-95（P<0.05）表达水平降低；和rmTBI-S组相比，rmTBI-D组NLG-1（P<0.01）和PSD-95（P<0.01）表达水平降低。rmTBI-D组小鼠延髓神经纤维扭曲水肿，神经元密度降低。 结论 延髓突触结构异常和功能障碍可能与rmTBI导致的死亡及神经功能损害相关。

Abstract

Objective To assess the effects of repeated mild traumatic brain injury (rmTBI) in the parietal cortex on neuronal morphology and synaptic plasticity in the medulla oblongata of mice. Methods Thirty-two male ICR mice were randomly divided into sham operation group (n=8) and rmTBI group (n=24). The mice in the latter group were subjected to repeated mild impact injury of the parietal cortex by a free-falling object. The mice surviving the injuries were evaluated for neurological deficits using neurological severity scores (NSS), righting reflex test and forced swimming test, and pathological changes of the neuronal cells in the medulla oblongata were observed with HE and Nissl staining. Western blotting and immunofluorescence staining were used to detect the expressions of neuroligin 1 (NLG-1) and postsynaptic density protein 95 (PSD-95) in the medulla oblongata of the mice that either survived rmTBI or not. Results None of the mice in the sham-operated group died, while the mortality rate was 41.67% in rmTBI group. The mice surviving rmTBI showed significantly reduced NSS, delayed recovery of righting reflex, increased immobility time in forced swimming test (P<0.05), and loss of Nissl bodies;swelling and necrosis were observed in a large number of neurons in the medulla oblongata, where the expression levels of NLG-1 and PSD-95 were significantly downregulated (P<0.05). The mice that did not survive rmTBI showed distorted and swelling nerve fibers and decreased density of neurons in the medulla oblongina with lowered expression levels of NLG-1 and PSD-95 compared with the mice surviving the injuries (P<0.01). Conclusion The structural and functional anomalies of the synapses in the medulla oblongata may contribute to death and neurological impairment following rmTBI in mice.

Graphical abstract

关键词

反复轻度创伤性脑损伤 / 延髓 / 神经连接蛋白-1 / 突触后致密蛋白-95 / 突触可塑性

Key words

repeated mild traumatic brain injury / medulla oblongata / neuroligin 1 / postsynaptic density protein 95 / synaptic plasticity

创伤性脑损伤（TBI）是法医学和临床医学重要的研究内容^［1］，尤其是反复轻度创伤性脑损伤（rmTBI），其发生率和死亡率较高^［2］。rmTBI多见于军人、运动员和青少年，虽不伴有严重的脑挫裂伤和脑水肿等致死性形态学改变，但可造成脑组织基因转录水平和个体行为改变^［3］。临床研究证实，rmTBI可导致一些伤者罹患慢性创伤性脑病（CTE）^{［4， 5］}。然而，CTE的特异性诊断指标及其与rmTBI之间的确切关联尚不明确^［6］。动物实验亦发现，rmTBI引起白质神经元缺损、慢性神经炎症、氧化应激等累积性损伤^［7］，导致认知缺陷、执行和运动功能障碍以及神经退行性病变^［8］。法医学实践中，部分死者生前外伤史并不明确。如何通过具有诊断价值的形态、代谢和功能指标证实rmTBI及CTE的存在并确定其在死亡中的作用已成为法医学颅脑损伤研究的重要内容之一^［9］。

一项回顾性研究发现，轻度TBI可引起伤者远期致死率升高，其中死亡原因主要为心血管和呼吸系统疾病^［10］。考虑到延髓分布调控呼吸循环功能的神经核团（生命中枢），如孤束核腹外侧的背侧呼吸组，接受来自呼吸系统的传入神经纤维；腹尾侧平面的前包钦格复合体是呼吸节律发起部位；头端腹外侧（RVLM）和尾端腹外侧（CVLM）分别和血压升高、降低相关；RVLM区C1神经元参与的交感缩血管紧张，在麻醉和缺氧情况下对于维持正常血压有重要意义^［11］。因此，本研究以延髓作为目标脑区，通过研究延髓形态和功能异常，探究rmTBI导致死亡和神经损伤的潜在分子机制。

突触是神经系统物质运输和信号传导的基本单元，其结构、功能异常导致神经系统功能障碍。神经连接蛋白1（NLG-1）表达于兴奋性突触后膜，通过特定的PDZ结合基序与突触后致密蛋白95（PSD-95）相互作用^{［12， 13］}，介导和整合突触信号传递，在突触可塑性中发挥重要作用^{［14， 15］}。NLG-1表达含量增加提示神经元突触数量增加，伴有突触兴奋性和稳定性增强^［16］。在小鼠神经退行性疾病模型中，上调大脑皮质和海马PSD-95的表达水平，可恢复突触功能，改善轴突线粒体转运障碍^［17］。本研究以NLG-1和PSD-95蛋白表达变化情况为主要观察内容，研究小鼠顶叶rmTBI对于延髓突触可塑性的改变及其与神经损伤和死亡的潜在关联。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

32只10~12周SPF级雄性ICR小鼠，体质量25~30 g，采购于河南斯克贝斯生物科技股份有限公司（许可证号：SCXK（豫）2020-0005）。本研究经皖南医学院实验动物伦理委员批准（伦理批号：LLSC-2022-058）。动物饲养间温度25 ℃，12 h明暗交替，实验动物自由摄取食物和水。实验动物随机分为假手术组（SHAM，n=8）和反复打击组（rmTBI，n=24），打击后死亡的计入反复打击死亡组（rmTBI-D）；其余为反复打击存活组（rmTBI-S）。

1.1.2 实验试剂

异氟烷（瑞沃德生命科技有限公司）；尼氏染色试剂盒（索莱宝），苏木素-伊红试剂盒、柠檬酸钠（Biosharp）；RIPA裂解液、SDS-上样缓冲液（Beyotime Biotechnology），PAGE凝胶快速制备试剂盒（EpiZyme）；NLG-1、PSD-95（Santa Cruz），β-Actin（北京普利来），HRP标记山羊抗小鼠二抗（Immunoway）；ECL发光试剂盒（上海天能）。

1.1.3 实验仪器

小鼠脑立体定位仪、小动物麻醉机、强迫游泳实验箱（瑞沃德生命科技有限公司）；包埋机、切片机（Leica）；小型垂直蛋白电泳系统（Bio-rad），凝胶成像系统（上海天能）；正置荧光显微镜（Olympus）。

1.2 模型建立

异氟烷（气流量0.5~ 0.7 L/min，浓度3%）吸入麻醉后，脑立体定位仪固定小鼠头部，使用重物自由落体打击装置（图1A）建立rmTBI模型^［18］，打击参数：重物质量量80 g，下落高度5 cm，撞针直径0.2 cm，撞击头皮深度0.2 cm；打击部位：顶叶直径0.5 cm圆形区域（图1B）；打击1次/d，连续打击30 d。

1.3 神经损伤严重程度评分

神经损伤严重程度评分（NSS）于打击结束后1 h进行，包括10项任务，用于评估小鼠运动、平衡、感觉和反射等神经功能^［19］。评分范围0~10分，分数越高提示神经损伤程度越重。

1.4 翻正反射实验

重物自由落体打击后即刻将小鼠从脑立体定位仪取下，以仰卧位姿势置于保温毯上开始计时，待小鼠恢复翻正反射（RORR）停止计时，翻正反射恢复时间作为评价指标。

1.5 强迫游泳实验

将小鼠放入装有20±2 ℃恒温自来水的透明圆桶（直径10 cm；高30 cm），水深20 cm，保证小鼠头部露出水面并且后肢无法触及水桶底部。每只小鼠放入水桶7 min，包括适应 2 min和测试5 min，检测指标为小鼠不动时间。

1.6 组织病理学观察

小鼠麻醉断头后取出脑组织，4%多聚甲醛固定3 d后脱水、浸蜡、包埋，制备5 μm石蜡切片。进行HE染色和Nissl染色。HE染色步骤：石蜡切片依次经二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水后，苏木素染色液浸染2 min，自来水冲洗5 min，盐酸酒精分化10 s，自来水冲洗2 min，伊红染色液浸染1 min，自来水冲洗1 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片后显微镜下观察。Nissl染色步骤：石蜡切片常规脱蜡至水，将焦油紫染色液滴加组织切片上，56 ℃温箱孵育1 h，去离子水冲洗，尼氏分化液分化至背景接近无色，无水乙醇迅速脱水，二甲苯透明，中性树脂封片显微镜采集图像，统计各组Nissl染色阳性神经元数目。

1.7 免疫印迹实验

20 mg顶叶皮层或延髓组织加入裂解液和蛋白酶抑制剂混合液200 μL，超声研磨1 min，4℃条件下12 000 r/min离心20 min后取上清加入SDS上样缓冲液，煮沸10 min；SDS-PAGE电泳时每一泳道蛋白上样量100 μg；湿转法将蛋白转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉封闭1.5 h；4℃一抗孵育过夜后 TBST洗膜3次（5 min/次）；二抗室温孵育1 h后TBST洗膜3次（10 min/次）；ECL发光液显影。使用Image J软件分析条带灰度值。

1.8 免疫荧光实验

脑组织石蜡切片脱蜡，柠檬酸钠抗原修复，PBST漂洗3次，（5 min/次），山羊血清溶液封闭0.5 h，4 ℃一抗孵育过夜后PBST漂洗3次（5 min/次），荧光二抗室温孵育1 h，DAPI染液避光室温孵育3 min，PBST溶液漂洗3次（10 min/次），抗荧光淬灭剂封片。在同一曝光条件下每只小鼠皮层和延髓组织切片随机选择4个不同视野进行拍照，使用Image J软件计算每张切片的总体荧光强度。

1.9 统计学分析

数据以均数±标准差的形式表示，使用 GraphPad Prism 8.0软件统计分析。两组样本间比较使用非配对t检验，多组样本比较使用单因素方差分析结合Tukey事后检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。本研究所有实验均独立重复3次。

2 结果

2.1 反复轻度脑损伤导致小鼠神经功能障碍及行为学改变

rmTBI组小鼠共24只，死亡10只，存活14只，死亡率为41.67%，显著高于SHAM组（P<0.05，图1D）。rmTBI-S组小鼠NSS为7.43±1.95，较SHAM组显著增加（P<0.001，图1E）；翻正反射恢复时间为123.60±12.97 s，较对照组11.10±1.52 s显著延长（P<0.001，图1F）；强迫游泳不动时间为137.28±52.08 s，较SHAM组74.61±41.25 s显著增加（P<0.05，图1G）。

2.2 反复轻度脑损伤的组织病理学表现

反复脑损伤组小鼠顶叶打击区域颅骨凹陷（图1B），硬脑膜粘连出血，对应脑组织缺损、出血；脑干未见明显病理变化。HE染色显示，反复打击死亡组小鼠打击区皮层组织缺失，损伤周边区域蛛网膜纤维化增厚，组织疏松、筛状软化灶形成，神经元固缩、细胞周隙扩大，神经胶质细胞活化，多见含铁血黄素颗粒沉积（图2A、B）；延髓神经纤维疏松水肿、扭曲断裂，神经元肿胀坏死、数目减少（图2C、D）；Nissl染色显示，SHAM组尼氏小体呈蓝紫色斑块状，分布于神经元细胞核周围；rmTBI-D组皮层及延髓Nissl染色阳性细胞数较SHAM组显著降低（P<0.01），部分神经元肿胀坏死（图3）。

2.3 反复轻度脑损伤引起NLG-1、PSD-95表达下调

rmTBI-S组小鼠皮层NLG-1（P<0.05）和PSD-95（P<0.05）表达水平较SHAM组降低；rmTBI-D组NLG-1（P<0.05）和PSD-95（P<0.05）低于rmTBI-S组；rmTBI-S组延髓NLG-1（P<0.05）和PSD-95（P<0.05）表达水平低于SHAM组；与rmTBI-S组相比，rmTBI-D组NLG-1（P<0.01）和PSD-95（P<0.01）显著降低（图4）。

rmTBI-S组NLG-1（P<0.001，图5）和PSD-95（P<0.001，图6）的荧光强度低于SHAM组；rmTBI-D组NLG-1（P<0.01）和PSD-95（P<0.001）的荧光强度较rmTBI-S组下降。延髓区rmTBI-S组NLG-1（P<0.001）和PSD-95（P<0.001）的荧光强度低于SHAM组；rmTBI-D组NLG-1（P<0.001）和PSD-95（P<0.01）的荧光强度低于rmTBI-S组（图7）。

3 讨论

rmTBI是常见的脑损伤类型，男性患者居多，高龄、幼儿、酒精中毒及癫痫均属于高危因素^［20］，其损伤结果受到单次创伤程度、受伤次数以及损伤间隔影响^［21-23］。虽然单次轻度TBI并未造成显著损伤^［24］，但多次被打击产生累积效应，加重了损伤程度，甚至导致死亡。法医学实践中，rmTBI相关的死亡常见于家庭虐待、多人多次打击的伤害案件及既往脑损伤基础上轻度TBI致死案例。目前，关于rmTBI死亡机制的研究较少，原因主要有：rmTBI属于复合型损伤，其损伤及死亡机制较单次mTBI更为复杂，且易受多种因素影响，给研究带来不确定性；模型需要满足“单次损伤程度轻微且又必须造成一定的死亡率”，造模时间长，损伤力度不易控制；动物与人体对于脑损伤的反应及自身修复能力存在差异，给rmTBI的死亡机制研究带来困难。本研究采用重物自由落体打击顶叶的单次mTBI模型^［25］，连续打击30次。第1~10次打击后小鼠进食量及体质量显著下降；第11~20次打击是小鼠死亡高峰期，70%死亡小鼠在此区间打击后死亡。死亡小鼠精神萎靡、毛发粗乱、进食量和体质量显著下降；第21~30次小鼠平均进食量与对照组无明显差异，体重亦逐渐增加，少见死亡发生。该研究成功建立了rmTBI打击致死模型，全过程打击组小鼠呈现“应激—死亡—代偿”规律。

我们亦对反复打击存活组小鼠的神经功能及行为学评估，包括NSS、翻正反射、强迫游泳和旷场实验。NSS是评估实验动物TBI后神经损伤严重程度的常用方法，伤后1 h评分可反映运动功能受损及认知障碍的严重程度^［26］。实验发现rmTBI-S组小鼠NSS显著高于对照组，且随着打击次数增加呈上升改变，证实反复轻微打击造成累积性损伤。翻正反射是指动物被仰卧位放置后出于本能恢复为正常体位的神经反射行为，反射消失是实验动物意识丧失的重要指征^［27］，其时间长短可作为脑外伤病人昏迷时间的模拟指标，用以评估TBI的严重程度^［28］。rmTBI引起翻正反射消失时间显著延长，提示rmTBI引起较严重的神经损伤。强迫游泳是评估啮齿动物抑郁样行为的常用实验方法，评价标准是规定时间内动物在水环境中静止不动的时间。实验结果显示，rmTBI组小鼠静止时间较对照组显著升高，提示rmTBI可诱导小鼠抑郁样行为。

脑损伤后远隔区域损伤及分子机制是神经损伤相关研究的重要内容。动物实验发现，TBI后1周使用GABA激动剂沉默对侧皮层功能可改善外伤引起的前肢运动障碍，但这种远隔环路调控效应具有时间依赖性^［29］。大脑中动脉发生缺血性卒中后，同侧丘脑、黑质、白质神经束和海马等远离原发性梗死区域均发现继发性神经退行性改变^［30］，虽然目前机制尚不清楚，但神经联结、炎症反应和兴奋性代谢毒物的蓄积可能参与远隔区域的损伤。基于这些发现，本研究将延髓作为关注脑区。此外，延髓分布有调控呼吸循环功能的神经核团，其组织形态和突触功能在rmTBI模型中是否亦产生累积性损伤是本研究关注的内容。组织病理学检测发现，顶叶rmTBI引起延髓神经纤维疏松水肿、扭曲断裂，神经元肿胀坏死、数目减少。与此同时，我们检测了该脑区突触可塑性的标记分子NLG-1和PSD-95的表达水平，发现顶叶皮层rmTBI显著降低延髓NLG-1和PSD-95的表达水平，且打击死亡组较存活组下降更显著。研究证实，NLG-1对于突触的发育和正常功能有重要意义^{［31， 32］}，阿尔兹海默症患者不同脑区NLG-1表达水平显著下调，NLG-1有望成为神经退行性标记物^［33］。NLG-1与PSD-95形成功能复合体，共同调节突触可塑性。PSD-95在酒精中毒相关TBI^［34］和癫痫等^［35］等病理生理过程中表达水平显著降低。

综上，顶叶rmTBI可导致小鼠死亡率增加，延髓NLG-1和PSD-95表达水平下降，提示延髓突触结构和功能改变可能参与rmTBI导致的死亡。但顶叶rmTBI引起远隔区域突触可塑性改变的分子机制及其在死亡中的作用，需进一步深入探讨。

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基金资助

安徽省高等学校自然科学研究重点项目(2022AH051222)

安徽省大学生创新创业训练计划项目(S202210368010)

法医病理学公安部重点实验室开放课题(GAFYBL202306)

皖南医学院中青年科研基金(WK2023ZQNZ19)

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