表达TGF-βⅡ受体的腺相关病毒载体抑制小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞的增殖和肺转移

摘要

目的 研究腺相关病毒（AAV2）介导的TGF-βⅡ受体（TβRⅡ）胞外结构域和IgG2a Fc段融合基因对小鼠4T1细胞在体内增殖和迁移的影响。方法 通过分子克隆构建表达sTβRⅡ-Fc的腺相关病毒核心质粒载体pAAV-sTβRⅡ-Fc，转染至HEK 293T细胞验证分泌性sTβRⅡ的表达。在HEK 293T细胞中共转染重组腺相关病毒核心质粒pAAV-sTβRⅡ-Fc、衣壳蛋白表达质粒pAAV2和辅助质粒pHelper以制备AAV2-sTβRⅡ，碘克沙醇密度梯度离心法纯化病毒。Western blot检测AAV2-sTβRⅡ对TGF-β信号通路下游关键蛋白Smad2/3磷酸化水平的影响，以及经治疗后各组小鼠4T1移植瘤内E-钙黏蛋白、波形蛋白、p-Smad2/3的表达水平。构建Luciferase标记的4T1细胞并荷瘤BALB/c小鼠，荷瘤小鼠随机分为处理组AAV2-sTβRⅡ、对照组AAV2-GFP和溶剂对照组PBS(6只/组)，各组病毒均经尾静注射到小鼠体内。小动物活体成像观察AAV2-sTβRⅡ在小鼠体内对4T1移植瘤增殖的影响。免疫组织化学检测肿瘤组织Ki67蛋白的表达水平。免疫荧光检测小鼠肝脏内sTβRⅡ蛋白的表达水平。H&E染色观察小鼠肺部肿瘤转移灶和主要脏器的病理学改变。结果 pAAV-sTβRⅡ-Fc重组质粒构建成功并在HEK 293T细胞中分泌表达sTβRⅡ。AAV2-sTβRⅡ能够感染4T1细胞并显著降低TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化（P<0.05）。AAV2-sTβRⅡ可显著抑制小鼠4T1移植瘤在体内的增殖（P<0.05）与肺转移，同时处理组肿瘤组织中E-钙黏蛋白表达水平显著上升（P<0.05）、波形蛋白表达水平显著下降（P<0.01）、Smad2/3磷酸化水平显著下降（P<0.05）、肿瘤组织Ki67蛋白显著下降。sTβRⅡ可在肝脏中表达，AAV2-sTβRⅡ未引起小鼠体质量下降和心、肝、脾、肾组织的病理学变化（P>0.05）。结论 重组腺相关病毒载体AAV2介导的TβRⅡ胞外结构域编码序列，可阻断4T1细胞中的TGF-β信号通路，显著抑制小鼠体内4T1细胞增殖和肺转移。

关键词

三阴性乳腺癌 / TGF-βⅡ / 迁移 / TGF-β信号通路 / 腺相关病毒