表达 TGF-βⅡ受体的腺相关病毒载体抑制小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞的增殖和肺转移

A recombinant adeno-associated virus expressing secretory TGF‑β type II receptor inhibits triple-negative murine breast cancer 4T1 cell proliferation and lung metastasis in mice

摘要

目的 研究腺相关病毒（AAV2）介导的TGF-βⅡ受体（TβRⅡ）胞外结构域和IgG2a Fc段融合基因对小鼠4T1细胞在体内增殖和迁移的影响。 方法 通过分子克隆构建表达sTβRⅡ-Fc的腺相关病毒核心质粒载体pAAV-sTβRⅡ-Fc，转染至HEK 293T细胞验证分泌性sTβRⅡ的表达。在HEK 293T细胞中共转染重组腺相关病毒核心质粒pAAV-sTβRⅡ-Fc、衣壳蛋白表达质粒pAAV2和辅助质粒pHelper以制备AAV2-sTβRⅡ，碘克沙醇密度梯度离心法纯化病毒。Western blot检测AAV2-sTβRⅡ对TGF-β信号通路下游关键蛋白Smad2/3磷酸化水平的影响，以及经治疗后各组小鼠4T1移植瘤内E-钙黏蛋白、波形蛋白、p-Smad2/3的表达水平。构建Luciferase标记的4T1细胞并荷瘤BALB/c小鼠，荷瘤小鼠随机分为处理组AAV2-sTβRⅡ、对照组AAV2-GFP和溶剂对照组PBS（6只/组），各组病毒均经尾静注射到小鼠体内。小动物活体成像观察AAV2-sTβRⅡ在小鼠体内对4T1移植瘤增殖的影响。免疫组织化学检测肿瘤组织Ki67蛋白的表达水平。免疫荧光检测小鼠肝脏内sTβRⅡ蛋白的表达水平。H&E染色观察小鼠肺部肿瘤转移灶和主要脏器的病理学改变。 结果 pAAV-sTβRⅡ-Fc重组质粒构建成功并在HEK 293T细胞中分泌表达sTβRⅡ。AAV2-sTβRⅡ能够感染4T1细胞并显著降低TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化（P<0.05）。AAV2-sTβRⅡ可显著抑制小鼠4T1移植瘤在体内的增殖（P<0.05）与肺转移，同时处理组肿瘤组织中E-钙黏蛋白表达水平显著上升（P<0.05）、波形蛋白表达水平显著下降（P<0.01）、Smad2/3磷酸化水平显著下降（P<0.05）、肿瘤组织Ki67蛋白显著下降。sTβRⅡ可在肝脏中表达，AAV2-sTβRⅡ未引起小鼠体质量下降和心、肝、脾、肾组织的病理学变化（P>0.05）。 结论 重组腺相关病毒载体AAV2介导的TβRⅡ胞外结构域编码序列，可阻断4T1细胞中的TGF-β信号通路，显著抑制小鼠体内4T1细胞增殖和肺转移。

Abstract

Objective To investigate the effects of an adeno-associated virus (AAV2) vector expressing secretory transforming growth factor-β (TGF-β) type II receptor (sTβRII) extracellular domain-IgG2a Fc fusion protein (sTβRII-Fc) on proliferation and migration of triple-negative murine breast cancer 4T1 cells in mice. Methods The pAAV-sTβRII-Fc vector expressing sTβRII-Fc fusion protein constructed by molecular cloning, the capsid protein-expressing vector pAAV2 and the helper vector were co-transfected into HEK 293T cells to prepare the recombinant AAV2-sTβRII virus, which was purified by density gradient centrifugation with iodixanol. Western blotting was used to examine the effects of AAV-sTβRII virus on Smad2/3 phosphorylation in 4T1 cells and on expression levels of E-cadherin, vimentin and p-Smad2/3 in 4T1 cell xenografts in mice. BALB/c mice bearing subcutaneous xenografts of luciferase-expressing 4T1 cells received intravenous injections of AAV-sTβRII virus, AAV-GFP virus or PBS (n=6) through the tail vein, and the proliferation and migration of 4T1 cells were analyzed with in vivo imaging. Ki67 expression in the tumor tissues and sTβRII protein expressions in mouse livers were detected with immunohistochemistry and immunofluorescence staining, and tumor metastases in the vital organs were examined with HE staining. Results The recombinant pAAV-sTβRII-Fc vector successfully expressed sTβRII in HEK 293T cells. Infection with AAV2-sTβRII virus significantly reduced TGF-β1-induced Smad2/3 phosphorylation in 4T1 cells and effectively inhibited proliferation and lung metastasis of 4T1 xenografts in mice (P<0.05). In the tumor-bearing mice, intravenous injection of AAV-sTβRII virus significantly increased E-cadherin expression, reduced vimentin and Ki67 protein expressions and Smad2/3 phosphorylation level in the tumor tissues (P<0.05 or 0.01), and induced liver-specific sTβRII expression without causing body weight loss or heart, liver, spleen or kidney pathologies. Conclusion The recombinant AVV2 vector encoding sTβRII extracellular domain is capable of blocking the TGF-β signaling pathway to inhibit the proliferation and lung metastasis of 4T1 cells in mice.

Graphical abstract

关键词

三阴性乳腺癌 / TGF-βⅡ / 迁移 / TGF-β信号通路 / 腺相关病毒

Key words

triple negative breast cancer / TGF‑βII / migration / transforming growth factor‑β signaling pathway / adeno-associated virus

三阴性乳腺癌（TNBC）因其细胞不表达或低表达雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体-2（HER-2），经典乳腺癌内分泌治疗和ER阻断治疗对TNBC治疗效果较差^{［1， 2］}。此外，TNBC具有高侵袭性，TNBC患者体内发生远端器官转移的比例显著高于其他乳腺癌亚型，并且TNBC患者5年生存率比非TNBC患者低8%~16%^{［3， 4］}。当前，TNBC的主要治疗方法是手术结合放疗、化疗。近年来，使用PD-1阿特株单抗联合nab-紫杉醇用于TNBC临床治疗取得了积极的进展，但该疗法与单独使用nab-紫杉醇相比，内分泌和神经系统等不良事件反而显著增加^{［5， 6］}。因此，TNBC临床治疗仍然亟待开发新的有效治疗方案。

近年来研究发现，转化生长因子β（TGF-β）在多种肿瘤细胞包括乳腺癌中异常高表达^［7-9］。在肿瘤组织中，TGF-β主要由肿瘤细胞自身和肿瘤相关成纤维细胞产生，发挥免疫抑制作用来促进肿瘤细胞免疫逃逸，亦可促进肿瘤细胞增殖、肿瘤细胞外基质的纤维化和肿瘤细胞耐药，从而广泛参与肿瘤的发生、发展^［10-12］。肿瘤细胞TGF-β信号通路的持续激活可诱导Snail、ZEB1、ZEB2和HMGA2等多种转录因子的异常表达，使其下游间充质蛋白表达上调、上皮细胞粘附蛋白表达下调，导致癌细胞丧失上皮细胞接触抑制效应，从而增强了癌细胞增殖、侵袭和转移的能力^{［13， 14］}。已有研究证实，高侵袭性乳腺癌组织中TGF-β水平升高导致乳腺癌细胞TGF-β/Smad信号通路过度活化，由此促进乳腺癌细胞的肺转移。上述研究提示TGF-β信号通路是抗乳腺癌治疗的潜在靶点^{［15， 16］}。在TGF-β经典信号通路中，TGF-βII型受体（TβRⅡ）是主要的功能性跨膜受体。研究表明，TβRⅡ的胞外结构域可表达成为分泌型sTβRⅡ并与TGF-β因子结合，重要的是，sTβRⅡ因缺乏膜结合结构域，其对TGF-β1和TGF-β3表现出比TβRⅡ更高的亲和力^［17］。目前，sTβRⅡ已被用于TGF-β信号转导通路阻断研究^{［18， 19］}。

腺相关病毒（AAV）作为基因治疗的载体之一，具有转染效率高、无致病性和免疫原性低，可长期稳定表达等优势，目前已在脂蛋白酶缺乏症、Leber遗传性视神经病、A型血友病和脊髓性肌萎缩症等单基因病治疗中取得临床应用^［20-23］。同时，以AAV为载体的抗肿瘤基因治疗也已成为当前抗肿瘤研究的热点^{［24， 25］}。目前已开发多种阻断TGF-β信号通路的小分子抑制剂，然而以TGF-β信号通路为靶点的基因治疗药物尚未见报道。本研究制备了一种携带小鼠TβRⅡ胞外结构域和IgG2a Fc段的融合编码序列AAV2-sTβRⅡ病毒，通过利用血清2型AAV的肝嗜性实现AAV介导sTβRⅡ基因在小鼠肝脏转导，观察小鼠体内持续高表达sTβRⅡ对TNBC肿瘤细胞增殖和迁移的影响，由此探索新的抗三阴性乳腺癌基因治疗策略。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

小鼠三阴性乳腺癌细胞系4T1细胞由肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室保存；荧光素酶（Luciferase）标记的4T1肿瘤细胞由本实验构建并保存；人胚胎肾细胞（HEK 293T）由北京协和医学院张业老师课题组惠赠由本实验室传代并保存。所有细胞使用含10%胎牛血清（Viva Cell）、500 IU/mL青/链霉素双抗（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）的DMEM（Gibco）完全培养基，在5% CO₂、37 ℃恒温恒湿的培养箱中培养。

1.2 质粒构建与病毒包装

通过UniProt数据库获取小鼠TβRⅡ的胞外结构域序列即sTβRⅡ，在NCBI数据库进行序列比对。在sTβRⅡ的5'端加入Kozak序列提高其翻译效率，在其3'端加入小鼠IgG2a Fc序列，形成pAAV-sTβRⅡ-Fc基因编码序列。DNA序列由苏州金唯智科技有限公司合成并插入核心质粒载体pAAV2-CAG。HEK 293T细胞传代16 h后，细胞融合度达到70%~80%时采用阳离子转染试剂CytoKey^TM（中吉当康生物科技有限公司）进行核心质粒pAAV-sTβRⅡ-Fc、衣壳蛋白表达质粒pAAV2和辅助质粒pHelper三质粒共转染72 h后收集细胞与培养基上清。细胞经3次反复冻融裂解后，以12 000 r/min、4 ℃离心15 min。离心后的上清与细胞培养基上清在37 ℃条件下经全能核酸酶（上海翌圣生物科技股份有限公司）消化1 h，随后以碘克沙醇密度梯度离心法纯化病毒。分别以浓度为10、1、0.1、0.01、0.001 ng/µL的核心质粒pAAV-sTβRⅡ-Fc为模板，以该核心质粒的ITR序列为引物进行实时荧光定量PCR扩增并绘制标准曲线，然后以纯化后的病毒颗粒为模板，进行实时荧光定量PCR法病毒滴度测定。

1.3 Western blot实验

AAV2-sTβRⅡ与对照组AAV2-GFP病毒感染4T1细胞36 h，取培养基上清液500 µL与FLAG抗体（Proteintech）1 µg，4 ℃共孵育过夜，加入ProteinG PLUS-Agarose（Santa Cruz Biotechnology）混匀孵育4~6 h，4 ℃条件下1400 r/min离心5 min，弃上清加入1×Loading Buffer混匀后，100 ℃孵育5 min后放置冰上，完成样品制备。样品以12% SDS-PAGE电泳、300 mA恒流转膜1 h，5%的脱脂牛奶室温封闭1 h，随后在含有1%BSA的封闭缓冲液中与一抗FLAG （1∶1000） 4 ℃摇床孵育过夜。用 TBST缓冲液洗膜3次，以羊抗鼠二抗室温孵育1 h、TBST洗膜3次，加入ECL显影液后以化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）获取目的蛋白条带。

1.4 动物实验

8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠18只，体质量18~20 g，由三峡大学实验动物中心提供（动物许可证号：SCXK（鄂）2022-0012）。所有动物在恒温、恒湿、12 h明暗周期的SPF环境饲养。在小鼠第2乳垫皮下注射2.0×10⁵个4T1-Luc细胞，然后将小鼠随机分成处理组AAV2-sTβRⅡ、对照组AAV2-GFP和溶剂对照组PBS， 6只/组，分别尾静脉注射PBS、AAV2-GFP或AAV2-sTβRⅡ（2×10¹² vg/只）。病毒接种后第5天、第21天分别进行小动物活体成像，同时肿瘤细胞接种后以游标卡尺测量小鼠肿瘤纵径、横径和体质量，肿瘤体积=（纵径×横径×横径）/2。到达研究终点后，对小鼠以二氧化碳法实施安乐死、解剖并保存小鼠组织。所有动物实验均经三峡大学动物福利与伦理委员会审核并批准（伦理批号：2023020W）。

1.5 免疫组织化学染色

小鼠组织用4%多聚甲醛，室温固定24 h后进行脱水和石蜡包埋。肿瘤组织与Ki67（1∶200, Abcam）抗体4 ℃孵育过夜，与DAB显色液（福州迈新生物技术开发有限公司）室温避光孵育2 min，然后在光镜下观察并采集图片，肿瘤细胞核中出现棕褐色或棕黄色颗粒为阳性。另外取心、肝、脾、肺、肾等组织标本进行HE染色。1.6 免疫荧光染色

以FLAG抗体（1∶200）与小鼠肝脏组织切片在4 ℃条件下孵育过夜，以PBS清洗3遍，5 min/次，随后用荧光二抗（1∶200， Invitrogen）室温条件下避光孵育1 h，PBS清洗3遍，5 min/次，用含DAPI的封片剂（Sigma-Aldrich）封片，荧光显微镜下观察组织染色。

1.7 统计学分析

实验数据采用Graphpad Prism 8.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，数据比较采用t检验，P<0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AAV2-sTβRⅡ的制备与鉴定

为持续性表达sTβRⅡ蛋白，我们构建了核心质粒载体pAAV-sTβRⅡ-Fc，并在小鼠4T1细胞中进行测试（图1A）。pAAV-sTβRⅡ-Fc质粒含2个XhoI酶切位点，经Xho I酶切后琼脂糖凝胶电泳结果显示在729 bp和4694 bp位置可见2个片段，结果与预期片段大小相符（图1B）。DNA测序和序列比对无碱基突变（图1C）。Western blot显示pAAV-sTβRⅡ‑Fc质粒可在HEK 293T细胞转染后实现分泌性表达（图1D），并在HEK 293T细胞中产生衣壳蛋白完整的AAV病毒（图1E）。AAV2-sTβRⅡ病毒感染的4T1细胞培养基经浓缩后检测到了融合蛋白sTβRⅡ-Fc的表达（图1F）。分别以AAV2-GFP，AAV2-sTβRⅡ病毒感染4T1细胞后用TGF-β1（10 ng/mL）刺激细胞后发现，与AAV2-GFP组相比，AAV2-sTβRⅡ显著抑制了TGF-β1诱导的TGF-β信号通路下游Samd2/3蛋白的磷酸化水平（P<0.01，图1G）。

2.2 AAV2-sTβRⅡ对小鼠体内4T1细胞移植瘤增殖的影响

荷瘤小鼠经尾静脉注射等量的病毒进行治疗（图2A）。小动物活体成像结果显示，在病毒注射后第5天，各组小鼠移植瘤大小无显著差异，平均荧光信号值差异不具有统计学意义（P>0.05）；病毒注射第21天，与对照组相比，AAV2-sTβRⅡ组的肿瘤平均荧光信号值显著下降（P<0.05，图2B、C）。肿瘤增殖曲线和肿瘤重量分析均显示，与对照组相比AAV2-sTβRⅡ组小鼠肿瘤增殖受到显著抑制（P<0.05，图2D~F）。免疫组化结果表明，AAV2-sTβRⅡ组小鼠肿瘤组织中Ki67蛋白表达水平显著低于对照组（图2G）。

2.3 AAV2-sTβRⅡ抑制小鼠4T1移植瘤p-Smad2/3表达

Western blot检测小鼠4T1移植瘤Smad2/3磷酸化水平，结果显示，与对照组相比，AAV2-sTβRⅡ能显著抑制Smad2/3磷酸化（P<0.01），Smad2/3蛋白无显著差别（图3A）。此外在AAV2-sTβRⅡ组的小鼠肝脏组织切片中检测到了融合蛋白sTβRⅡ-Fc的表达（图3B）。

2.4 AAV2-sTβRⅡ对小鼠4T1细胞移植瘤肺转移的影响

小鼠注射AAV2-sTβRⅡ 21 d后，显著降低了4T1细胞的转移性肺结节的数量（图4A）。肺组织HE染色结果显示PBS组与AAV2-GFP组有明显的肺转移病灶（图4B）。AAV2-sTβRⅡ组小鼠肿瘤组织中E-cadherin蛋白表达水平显著增加（P<0.05），Vimentin蛋白表达水平显著降低（P<0.01，图4C）。

2.5 AAV2-sTβRⅡ对小鼠的毒性作用

实验过程中3组小鼠均无死亡、体质量无显著下降（图5A）。HE染色分析显示，在小鼠主要脏器心、肝、脾、肾器官的组织形态中未发现有明显的病理改变（图5B）。

3 讨 论

TGF-β信号通路的异常激活在肿瘤细胞增殖、迁移和肿瘤免疫逃逸过程中发挥着重要作用，阻断过度激活的TGF-β信号通路是抑制肿瘤细胞恶性增殖和迁移的重要策略之一^{［7， 8］}。现有研究表明，重组腺相关病毒能够高效转导哺乳动物肝脏组织并长期稳定表达外源基因，是安全、可靠的基因治疗载体^{［26， 27］}。如利用AAV进行肝脏靶向的凝血因子VIII或IX递送，能够实现对A型或B型血友病的有效治疗^{［28， 29］}。在以往的研究中，AAV病毒注射第7天后，小鼠体内即可检测到较高的外源递送基因表达并长期保持这一表达水平^［30］。本研究选择AAV2，主要是利用其对肝脏的组织嗜性。鉴于抗体Fc段可通过降低免疫原性、增加分子量来提高外源性重组蛋白在血液中的稳定性^［31］，本研究将小鼠IgG2a Fc段编码序列插入TGF-β受体II胞外结构域3'端，构建融合蛋白编码序列并克隆入AAV核心质粒载体。

本研究使用AAV2介导的sTβRⅡ过表达能够有效阻断TGF-β1诱导的4T1细胞TGF-β信号通路下游Smad2/3的磷酸化。在小鼠体内，单次尾静脉注射2×10¹² vg的AAV2-sTβRⅡ能够转导小鼠肝脏并显著下调4T1移植瘤组织的Smad2/3蛋白磷酸化水平。这些结果提示AAV介导的sTβRⅡ能够有效地抑制TGF-β信号通路，与2023年DePeaux等^［32］采用溶瘤病毒递送TGF-β的模拟突变体，产生的TGF-β RⅡ阻断效应比较一致。此外，本研究采用的AAV2-sTβRⅡ有效地抑制了4T1细胞移植瘤的体内增殖和肺转移，具有较好的抗肿瘤作用。

目前临床上AAV主要应用于单基因遗传病的治疗，而AAV介导的肿瘤基因治疗尚未取得突破。本研究首次利用AAV2介导sTβRⅡ在肝脏靶向基因转导，利用AAV转导基因长期持续表达的特点，通过过表达分泌性的TGF-β RⅡ来竞争性阻断TGF-β配体与TGF-β受体的结合，拓宽了AAV在肿瘤等慢性疾病治疗研究中的应用。同时，本研究的结果也证明肿瘤微环境中TGF-β信号通路在肿瘤细胞迁移中发挥关键作用，这与文献报道一致^［7］。但是，TGF-β因子具有肿瘤相关成纤维细胞、肿瘤浸润淋巴细胞以及肿瘤细胞自身等多种来源，而TGF-β信号通路在细胞增殖、迁移和免疫抑制方面也具有多种生物学效应，目前认为其在肿瘤微环境中发挥“双面性”，这一特殊作用的分子机制尚有待揭示^{［33， 34］}。本研究中还对AAV2-sTβRⅡ阻断TGF-β信号通路对小鼠的安全性进行了观察。截止到病毒注射后第22天，实验中未观察到小鼠体质量有显著下降，小鼠心、肝、肾和脾等主要器官的组织形态也没有显著改变。但是长期阻断TGF-β信号通路对肝脏特别是免疫系统的潜在影响不容忽视，本研究将进一步通过改造AAV2衣壳来实现肿瘤靶向的分泌性sTβRⅡ基因转导，以此减轻其毒副作用。

随着肿瘤的进展，肿瘤细胞可利用TGF-β抑制适应性免疫系统和先天免疫系统发挥作用，有研究报道，TGF-β抑制疗法可以恢复抗癌免疫力。目前，TGF-β抑制疗法与其他免疫疗法（包括免疫检查点阻断）协同作用，在临床前癌症模型中表现出抗肿瘤免疫反应^［35］。这进一步提示，sTβRⅡ的抗肿瘤作用可能与肿瘤免疫激活有关。本研究也将进一步利用自发肿瘤小鼠模型和PDX小鼠模型，采用肿瘤靶向性的AAV载体递送sTβRⅡ，观察抑制肿瘤微环境中的TGF-β信号通路对肿瘤免疫逃逸、细胞增殖和迁移的影响并探索其作用机制。综上所述，本研究为阻断TGF-β这一重要的疾病相关信号通路提供了新的策略和研究工具，进一步拓宽了AAV在肿瘤等慢性疾病治疗研究中的应用。

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