槟榔活性成分诱导口腔黏膜下纤维化的机制：基于网络药理学结合临床样本验证

Oral submucosal fibrosis induced by active components in areca nut: a network pharmacology-based analysis and validation of the mechanism

摘要

目的 探究槟榔的成分及其促进口腔黏膜下纤维化的机制。 方法 采用Thermo QE plus液相色谱串联高分辨质谱仪和Compound discover 3.2数据处理软件进行槟榔中药化学成分分析，将检测到的化合物以质谱响应值排序，分析排名前20化合物的活性。化合物活性来源根据《中国药典（2015版）》汇总，数据查询基于PubChem、Chemical book 以及Scifinder数据库。借助网络药理学方法分析槟榔影响口腔黏膜下纤维化（OSF）的潜在活性成分、核心靶点及主要影响的生物功能、信号通路。通过整合人类基因数据库（Genecards）、基因组百科全书数据库（KEGG）等数据库获取OSF的作用靶点。以OB≥30%为条件，在中药系统药理学技术平台（TCMSP）中筛选出槟榔可作用于靶点的化合物，并构建靶点-化合物、化合物-中药、靶点-化合物-中药网络。运用MOE软件的分子对接技术，分析成分-靶点结合的可能性，再利用Pymol软件进行分子对接可视化。最后通过免疫组化在临床样本中验证槟榔是否影响PI3K-Akt、MAPK两条通路涉及的主要蛋白，初步验证槟榔诱导OSF的潜在作用机制。 结果 基于网络药理学和槟榔粗提物中筛选出前10的化合物与OSF核心靶点中核心交集基因，确定了槟榔可能通过调控PI3K-Akt与MAPK通路。通过免疫组化在临床样本中验证，细胞膜上的PI3K蛋白表达量在OSF患者组中表达下降（P=0.0002），p-PI3K（P=0.0002）表达量上升，进一步激活下游的AKT1蛋白表达增加（P=0.0006），加剧磷酸化蛋白p-AKT蛋白的表达及堆积（P=0.0013）；而在MAPK通路中，OSF患者组对比正常组，通过上调JNK蛋白（P=0.0130），诱导下游AP-1复合蛋白c-jun及c-fos转录因子的活性增加，促使其向细胞核聚集；且OSF患者组较正常组血浆的IL-6（P<0.0001）与IL-8（P=0.0095）含量均上升。 结论 槟榔碱、槟榔次碱、异去甲槟榔碱等槟榔中的主要活性成分可能通过刺激PI3K-Akt与MAPK信号通路，促进炎症介质IL-6及IL-8的表达，诱导胶原增生，导致口腔黏膜下纤维化病变。

Abstract

Objective To explore the pharmacologically active components in areca nut that induce oral submucosal fibrosis (OSF) and the possible mechanism. Methods The chemical components in areca nut were analyzed using Thermo QE plus liquid chromatography tandem high-resolution mass spectrometer and Compound discover 3.2 data processing software. The chemical activity of the top 20 compounds was analyzed based on Chinese Pharmacopoeia (2015), PubChem, Chemical book, and SciFinder databases. The potential active components, core targets, biological functions and signaling pathways affecting OSF were analyzed by network pharmacology. The targets of OSF were obtained by integrating Genecards and KEGG databases. The compounds acting on the targets were selected from the Systematic Pharmacology Technology Platform of Traditional Chinese Medicine (TCMSP), and the target-compound, compound-TCM, target-compound-TCM network was constructed. Molecular docking was used to analyze the component-target binding. Immunohistochemistry was used to examine the expressions of key proteins in the PI3K-Akt and MAPK pathways in clinical samples of OSF. Results The core intersection target genes between the top 10 active ingredients in areca nut extract and OSF involved mainly the PI3K-Akt and MAPK pathways. In the clinical samples, the expressions of PI3K protein decreased and the expressions p-PI3K, AKT1 and P-Akt all increased significantly in OSF tissue, where increased JNK protein expression and enhanced activity of c-Jun and c-Fos transcriptional factors were also detected. The OSF patients had significantly elevated plasma levels of IL-6 and IL-8 compared with healthy individuals. Conclusion The main active ingredients including arecoline, arecaine, and guvacine are capable of activating the PI3K-Akt and MAPK pathways to promote the expressions of inflammatory mediators IL-6 and IL-8 and induce collagen hyperplasia, thus leading to the occurrence of oral submucosal fibrosis.

Graphical abstract

关键词

槟榔 / 口腔黏膜下纤维化性变 / 网络药理学 / 分子对接

Key words

areca nut / oral submucosal fibrosis / network pharmacology / molecular docking

槟榔在中国主要种植分布于云南、海南及台湾等热带地区，其主要活性在临床上也具有很高的药用价值^［1］。槟榔化学成分复杂，含有丰富的生物碱，及鞣质、脂肪酸、氨基酸及多糖^［2-4］。

口腔黏膜下纤维化（OSF）是一种渐进性炎症性口腔黏膜病变。病理特征为胶原纤维在口腔黏膜下层大量堆积，具有隐匿性和癌变倾向性^{［5， 6］}。随疾病进展可累及咽喉，严重则引发口腔癌、头颈鳞癌等^{［7， 8］}。其主要特征是口腔黏膜下组织中纤维组织的明显增生和沉积，导致口腔组织结构的紊乱和功能的受损，形成纤维条索，进行性张口受限；上皮异常改变，上皮表层过度不全角化、层次增多，尤以棘细胞层增厚明显，上皮钉突肥大等异常病理病变^{［9， 10］}。

OSF多发于长期咀嚼槟榔的人群，尤其是在海南和湖南两地，均有食用槟榔的习俗文化。而槟榔粗纤维刺破口腔黏膜后，造成局部组织水肿、出血，进一步形成瘢痕，出现白色纤维条索，影响患者张口度，造成患者进食困难而影响患者的生活质量^［11］。由于受周边地区咀嚼槟榔的习俗以及广告宣传影响，湖南及海南等地口腔黏膜病的患病几率高于其他地区。90%以上的口腔癌患者发病与咀嚼槟榔有关^［12］。

OSF的研究也存在着病因与疾病信号靶点不明确，难以进行靶向药物递送治疗的问题。目前，国内外针对OSF的治疗均采取减轻症状、延长发病时间，尽可能减少 OSF向口腔鳞状细胞癌（OSCC）发展。临床治疗方法以药物、高压氧及光疗为主，手术治疗多用于晚期OSF。本研究利用网络药理学方法及分子对接技术，深入探索槟榔成分与疾病的发生机制和用药靶点，挖掘槟榔诱导OSF的主要成分及靶点，为 OSF 的临床治疗提供新的靶向治疗思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 口腔黏膜下纤维化临床样本

本实验临床样本纳排标准依据《T∕CHSA 011-2022 口腔黏膜下纤维性变诊断与临床管理指南》^［5］。纳入临床样本20例，患者性别与年龄无显著性差异。正常组10例，为智齿阻生患者，临床实验通过海南大学伦理审核（审批号：No.2022.151）要求；OSF组患者10例，均有咀嚼槟榔病史，活检有OSF病变的患者，样本来源于海南医学院第一附属医院口腔黏膜科。

1.1.2 实验试剂

甲醇（Thermo Scientific™）、Pierce™ 甲酸，LC-MS级（Thermo Scientific™）；Fibronectin Monoclonal antibody（武汉三鹰生物技术有限公司）、 RabbitAnti-AKT1 antibody、RabbitAnti-phospho-AKT1+AKT2+AKT3 antibody、RabbitAnti-PI3 Kinase p110 beta antibody、RabbitAnti-phospho-PI3 Kinase p110 beta antibody、RabbitAnti-JNK1+JNK2+JNK3 antibody、RabbitAnti-c-fos antibody、RabbitAnti-c-jun antibody（稀释比例1∶200，北京博奥森生物科技有限公司）；HE染色试剂盒、甘油明胶封片剂、免疫组化试剂盒（抗兔/抗小鼠二抗）、DAB显色试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）；人白细胞介素6（IL-6）试剂盒（ELISA）、人白细胞介素8（IL-8）试剂盒（ELISA）（泉州市睿信生物科技有限公司）。

1.1.3 实验仪器

低速台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、包埋机（武汉俊杰电子有限公司）、高速冷冻离心机［赛默飞世尔科技（中国）有限公司Sorvall Leged Micro 21R］、脱水机（意大利迪佩斯（DIPATH） Donatello）、病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）、多功能酶标仪（BioTek）、冻台（武汉俊杰电子有限公司）、连续投料粉碎机（瑞安市康源药机有限公司）、组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）、涡旋混匀仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 槟榔冻干提取及成分检测

称取1 kg鲜槟榔Areca catechu L.（海南），超纯水清洗后去蒂，剪碎，分离果肉与果皮于60 ℃恒温干燥箱烘干；研磨机打碎收集干槟榔果粉末与槟榔粗纤维，置于预先高压灭菌冰箱4 ℃预冷超纯水中，粉料：水=1：10冷浸过夜8~12 h，保留槟榔残渣2次浸提8~12 h，纱布过滤出粗滤液，抽滤得精滤液，于离心机中4500~5000 r/min离心15 min后去杂，分装于10 cm无菌大皿中约40 mL/皿，通过真空冷冻干燥机于-80 ℃、真空计1.0 kPa约48 h，可得冻干粉末，技术路线见图1。

取样品 200 mg，加入10 mL 50%甲醇水溶液（v∶v，甲醇∶水=50∶50）超声30 min，取1 mL上清液于离心管中，14 000 r/min离心5 min，再于过0.22 μm微孔滤膜滤过后，加入到进样瓶中。采用Thermo QE plus液相色谱串联高分辨质谱仪和Compound discover 3.2数据处理软件进行槟榔中药化学成分原始Raw质谱数据特征峰分析，特征峰元素匹配、分子式预测及同位素分布匹配的质量偏差均设置为≤5 ppm，利用mzcloud 在线数据库和本地mzVault中药天然产物数据库进行阳性结果筛选，以mzVault best match数据库匹配得分>70分为标准。空白样品采用相同条件处理，实验由上海复达检测技术集团有限公司提供技术支持。

1.2.2 槟榔成分相关靶点及疾病靶点预测

槟榔成分获取：槟榔提取物成分鉴定，依据中国药典2015版总结化合物活性来源。在PubChem数据库（https：// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、chemical book数据库（https：//www.chemicalbook.com/）、scifinder数据库（https：//www.cas.org/）、TCMSP数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、传统中药百科全书的ETCM数据库（http：//www.tcmip. cn/ETCM/）及Drugbank数据库（https：//go.drugbank.com/）汇总去重获得槟榔成分；同时以口服利用度（OB≥30%）为筛选参数，筛入槟榔活性成分^［15-18］。

化合物靶点获取：选择物种属性“Homo sapiens”预测活性成分靶点，基于PubChem数据库，检索槟榔活性成分的“smile”格式输入Swiss Target Prediction 数据库（STP数据库）（http：//www.swisstargetprediction.ch/）预测其靶点，以及比较毒物基因组学CTD数据库（http：//ctdbase.org/）、ETCM数据库与TCMSP数据库中所有活性成分的靶点汇总去重^{［19， 20］}。

口腔黏膜下纤维化靶点获取：以“OSF”、“Oral Submucous Fibrosis”为筛选关键词，通过人类基因注释数据库Genecards（http：//www.genecards.org）、DisGeNET数据库（https：//www.disgenet.org/）、OMIM数据库（https：//omim. org/）与基因组百科全书数据库（https：//www.kegg.jp/）进行筛选、去重汇总相关OSF靶点，利用NCBI数据库（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/）进行基因靶点名称确认及校准^{［14， 16， 19］}。

1.2.3 “活性成分-靶点”网络构建

利用Venny 2.1.0在线工具（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），导入槟榔活性成分与OSF疾病靶点进行交集，获得槟榔活性成分与OSF交集靶点；将交集靶点上传至STRING数据库（https：//string-db.org/），以置信下限（Low confidence=0.015），隐藏离散度较高的点，获取交集靶点互作图；以Cytoscape 3.7.1与3.8.0软件调整蛋白网络互作，利用Centiscape 2.2插件分析靶点度值（Degree）、介数（Betweenness）及紧密度（Closeness），得到槟榔活性成分与OSF的核心潜在靶点基因的可视化蛋白互作网络^{［20， 21］}。

1.2.4 GO和KEGG通路富集分析

将核心靶点上传至DAVID 6.9数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），进行基因本体论（GO）和京都基因组百科全书分析（KEGG），以P<0.05和FDR<0.01为条件筛选出Top 15的基因功能以及Top 20的信号通路，并采用在线生物信息学、可视化云平台（http：//www.bioinformatics.com.cn）绘制条形图和气泡图^{［13， 22］}。

1.2.5 槟榔候选成分与通路靶点分子对接

根据GO与KEGG通路富集分析所得前5内的两条信号通路蛋白取交集后，并同槟榔与OSF疾病的核心靶点进一步取交集所得通路靶点蛋白，在RCSB PDB数据库（http：//www.rcsb.org/pdb/）中下载所需靶点蛋白；并在PubChem数据库下载候选化合物“.sdf”文件，通过MOE分子对接软件进行分子对接^{［17， 18， 22， 23］}。以对接结合能判断靶点蛋白与候选化合物的结合能力。并通过Pymol软件进行分子对接可视化，利用在线生物信息学、可视化云平台（http：//www.bioinformatics.com.cn）绘制结合能热图^{［18， 20， 22， 23］}。

1.2.6 口腔黏膜组织HE染色、Masson染色、SR染色及偏振光拍摄

对4%多聚甲醛固定的口腔黏膜进行石蜡包埋、切片及苏木精-伊红染色法（HE）、马松染色（Masson）、天狼星红染色（SR），观察从上皮到固有层的表皮细胞排列变化情况，病理判断依据为《T∕CHSA 011-2022口腔黏膜下纤维性变诊断与临床管理指南》。根据SR染色中胶原纤维的折光性，通过偏振光拍摄，可区分Ⅰ型胶原纤维（COL Ⅰ）、Ⅲ型胶原纤维（COL Ⅲ），实验由武汉赛维尔生物有限公司提供技术支持。

1.2.7 免疫组化及半定量分析

利用人体内的抗原抗体反应，从而对这些抗原进行定位、定性、定量的研究。通过对4%多聚甲醛固定的口腔黏膜组织进行石蜡包埋、切片、抗原位点修复后，进行免疫组化染色，分析黏膜下固有层各种蛋白表达情况及蛋白在空间表达中所处的位置，并利用Image-Pro Plus 6.0软件对IHC结果进行半定量分析，实验由武汉赛维尔生物有限公司提供技术支持。

1.2.8 ELISA实验

将血浆于4000 r/min条件下离心20 min，缓慢吸取上层血浆，存于-20 ℃以下，避免反复冻融。通ELISA，经过温育与多次洗涤，保留在96孔板固相表面形成抗体-抗原-酶标抗体的夹心复合物。添加底物A和B，底物在辣根过氧化物酶（HRP）催化下变成蓝色，在终止液（2 mol硫酸）作用下，最终转化为黄色。于酶标仪450 nm波长上测定吸光度A，通过四参数方程拟合校准品曲线，计算样本中IL-6及IL-8的含量。

1.2.9 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0软件分析数据，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 槟榔活性成分获取及网络药理学

2.1.1 槟榔主要活性成分及口腔黏膜下纤维化靶点筛选

利用数据库进行阳性结果匹配分析，其结果包括化合物中英文名称、分子式、结构式、峰面积、TIC图、MS¹和MS²质谱图，经过手动确证和剔除重复结果后，将检测到的化合物以质谱响应值排序列表（表1）。

通过网络药理学技术手段筛选化合物及其靶点（图2A）。综合槟榔成分鉴定、文献调研与数据库，以口服利用度（OB≥30%）为标准，筛入34个活性成分（表2）。基于槟榔34个活性成分，依据TCMSP数据库、CTD数据库、Drugbank数据库、STP数据库预测靶点，去重后得到10 397个潜在靶点。利用疾病靶点相关数据库以“Homo sapiens”为筛选条件，“OSF”与“Oral submucous fibrosis”作为疾病筛选关键词，整合去重后获得929个OSF疾病相关靶点。Venny 2.1.0在线平台中导入槟榔活性成分与OSF疾病靶点，求得交集靶点583个（图2B）。

2.1.2 PPI网络（PPI）构建与槟榔核心靶点筛选

依据韦恩图求得OSF与槟榔活性成分583个交集基因，经过STRING数据库的靶点网络互作相关性优化分析限制最小互作得分（low confidence=0.015）后，得到543个互作基因（图2C）。运用Cytoscape 3.8与3.7.1软件，通过Centiscape 2.2插件限制条件Betweenness≥775.5764273，Closeness≥7.8E-04，Degree≥39.05709024，获得94个成分与疾病的核心靶点基因（图2D）。节点表示蛋白，边表示蛋白之间相互关联性，节点大小、颜色深浅及边的粗细，与度值（Degree）正相关。互作网络图有94个节点，2461条边（图2E）。进一步构建“槟榔-成分-靶点-口腔黏膜下纤维化”靶点互作图得157个节点，755条边（图2F）。

2.1.3 GO和KEGG富集分析

运用DAVID数据库对94个核心基因进行GO生物学过程富集分析得到1532个条目，及KEGG pathway分析167个条目。以P<0.05筛选为筛选条件，获得GO-BP条目996个，GO-CC条目158个，GO-MF条目165个，将富集Top 20条目利用微生信在线数据平台可视化。生物学过程（BP）主要涉及细胞凋亡调控过程及炎症反应等，细胞组分（CC）主要涉及细胞质、线粒体等细胞相关功能细胞器，分子功能（MF）主要涉及蛋白靶标结合及酶活性等相关方面（图2G）。通路富集以P<0.05筛选槟榔活性成分主要可影响的KEGG pathway涉及的164条信号通路，包括PI3K-Akt、MAPK其Top 20信号通路（图2H），并对涉及通路进行二级分类分析（图2I）。

2.1.4 核心靶点与Top 10化合物分子对接

通过MOE软件进行化合物与靶点的结合能分析，虚拟筛选槟榔中的化合物与通路靶点的结合情况。结合能绝对值越小，则分子与靶点越容易结合。筛选出（OB≥30%的前5个化合物）去甲槟榔碱、槟榔次碱、异去甲槟榔次碱、4，4'-二氯二苯砜、原花青素B1，及（槟榔提取物成分含量≥5%的化合物）槟榔碱、表儿茶素、右奎宁酸、柠檬酸、盐酸胡芦巴碱化合物共10个化合物，PubChem数据库中查找化合物的“.sdf”格式文件，排除Trigonelline HCl无活性靶点，共纳入9个化合物进入分子对接（图3A）。RCSB PDB数据库中下载KEGG富集分析中排名前5的两条PI3K-Akt与MAPK信号通路相交，且与核心靶点Top20有交集的8个靶点蛋白AKT1、INS、EGF等，配体与受体结合能越低表示分子与靶标结合越稳固，但在计算中成分与靶点也并非都有较高的亲和性（表3）。柠檬酸与目标蛋白均无结合，排除其与疾病的相关性，并对8个活性成分与目标蛋白进行结合能热图分析（图2J）。再利用Pymol软件将分子对接图可视化，展示部分对接氢键结合位点图（图3B）。

2.2 临床口腔黏膜下纤维化结果

2.2.1 临床组织样本病理染色

根据临床口腔黏膜样本进行病理结果染色分析，OSF患者组较正常组的HE染色出现角化层萎缩，口腔黏膜上皮层变薄、钉突减少、固有层增厚，基底层细胞排列紊乱，固有层胶原纤维致密，粉色沉积物累积，黏膜下层类玻璃样性变（图4A）；分析OSF患者组与正常组的Masson染色中，固有层有大量蓝色胶原沉积（图4A）；而SR染色中，OSF患者组较正常组的阳性指标明显增加，出现大量红色胶原纤维（图4A）。

2.2.2 临床纤维化指标

根据临床口腔黏膜样本进行纤维化指标分析，免疫组化染色纤连蛋白1（FN1）OSF患者组较正常组阳性染色加深，FN1的表达上升（P=0.0408，图4B）。根据SR染色中胶原纤维的折光性，通过偏振光可区分Ⅰ型与Ⅲ型胶原纤维。对比正常组与OSF患者组中，COL Ⅰ在OSF患者组中表达量较高（P<0.0001），有强双折光性，Ⅰ型胶原纤维呈现黄色及红色；COL Ⅲ在OSF的患者中表达下降（P<0.0001），正常组可见弱的绿色双折光Ⅲ型胶原纤维（图4C）。

2.2.3 临床样本机制通路验证

通过免疫组化验证槟榔是否影响PI3K-Akt、MAPK两条通路涉及的主要蛋白PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT123、JNK、c-Jun及c-fos组成的复合蛋白。对比正常及OSF组患者，细胞膜上的PI3K蛋白表达量在OSF中表达下降（P=0.0002），活化的PI3K蛋白通过p110亚基催化产生p-PI3K（P=0.0002），进一步激活下游的Akt蛋白募集到质膜上，其AKT1蛋白表达增加（P=0.0006），加剧磷酸化蛋白p-AKT蛋白的表达及堆积（P=0.0013，图4D、E）；而在MAPK通路中，正常组对比OSF患者组，通过上调JNK蛋白（包括JNK1+JNK2+JNK3各亚型，JNK1/2/3）（P=0.0130），诱导下游AP-1复合蛋白c-jun及c-fos转录因子的活性增加，促使其向细胞核聚集（图4F）。

2.2.4 临床血浆样本的IL-6和IL-8检测

Elisa检测显示，OSF患者组的IL-6（P<0.0001）与IL-8（P=0.0095）含量均上升（图5）。

3 讨论

本研究通过液相色谱串联高分辨质谱仪和Compound discover数据处理软件，对海南槟榔进行化学成分分析，其中生物碱主要为槟榔碱、槟榔次碱、异去甲槟榔碱，均与鞣酸呈结合态。鞣质主要为表儿茶素，原矢车菊素A-1，B1和B2等。脂肪酸主要有月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸等，及少量的苯甲酸等。氨基酸主要有脯氨酸、色氨酸，酪氨酸等。另含微量多糖及皂甙等，与目前槟榔的研究成分结果一致^{［1， 2］}。

咀嚼槟榔与口腔黏膜病有一定相关性，其机制通路依旧是海南口腔黏膜疾病研究的热点及难点问题^{［6， 8， 9， 12］}。长期咀嚼槟榔是诱导OSF的重要诱因，其中槟榔碱可以诱导角质形成细胞生成大量的TGF-β1，进一步影响口腔黏膜成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，加深纤维化的作用。目前TGF-β通路在纤维化疾病过程中，充当抑制胶原降解、激活血浆纤溶酶原激活物抑制物的角色，在DNA和蛋白水平影响基质金属蛋白酶与基质金属蛋白酶抑制剂的平衡，促进上皮细胞的间充质转化，造成胶原代谢失衡；而成纤维细胞在槟榔碱的诱导下，出现明显的氧化应激反应，造成细胞的DNA损伤、脂质过氧化和细胞凋亡等^{［7， 8］}。

本研究借助网络药理学进一步明确槟榔碱、槟榔次碱、异去甲槟榔碱等槟榔中活性成分与OSF疾病交集靶点583个，经过STRING数据库的靶点网络互作相关性优化分析得543个互作基因。运用Cytoscape 3.8及3.7.1软件，通过Centiscape 2.2插件限制条件获得94个槟榔活性成分与疾病的核心靶点基因，度值愈大，即评分越高，靶点相互影响程度越深。运用DAVID数据库对94个核心基因进行GO生物学过程富集分析，以P<0.05筛选为筛选条件，获得GO-BP条目996个，GO-CC条目158个，GO-MF条目165个；BP主要涉及细胞凋亡调控过程及炎症反应等，CC主要涉及细胞质、线粒体等细胞相关功能细胞器，MF主要涉及蛋白靶标结合及酶活性等；KEGG pathway共164条信号通路，包括PI3K-Akt、MAPK通路，对涉及通路进行二级分类分析，其Top 20信号通路主要涉及癌症、内分泌代谢疾病及信号转导等。

本研究进一步筛选出OB≥30%和槟榔提取物成分含量≥5%的前5个化合物，共10个化合物，排除Trigonelline HCl未搜集到活性靶点，共纳入9个化合物进入分子对接。通过KEGG富集分析中排名前5的两条PI3K-Akt、MAPK信号通路与核心靶点Top 20取交集，确定了8个靶点蛋白。由于柠檬酸与目标蛋白均无结合，排除了柠檬酸与OSF的相关性。明确了槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱、表儿茶素等8个主要活性成分与疾病涉及通路的相关性。

分子对接中显示，槟榔的主要成分可与AKT1、INS、EGF、EGFR、VEGFA、TP53、MAPK3及MYC蛋白靶向结合，其中EGFRs通过与配体结合并形成同源或异源二聚体，激活下游I类和II类PI3K信号转导。EGFRs属于RTK-ErbB家族，该家族还包括ErbB-3、ErbB-4和HER2。配体TGF-α也可结合EGFR，激活PI3K信号通路。VEGFRs家族主要为VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（KDR，Flk-1）和VEGFR-3（Flt-4）。其中，内皮细胞中主要为VEGFR-1和VEGFR-2，而淋巴管内皮细胞中则存在VEGFR-3^{［24， 25］}。

PI3K-Akt信号通路的激活与其上游许多因素有关，包括RTK家族、Toll样受体（TLRs）和B细胞抗原受体（BCRs）等。RTKs是一个具有内在磷酸酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白家族，主要包括EGFRs、VEGFRs和FGFRs。RTKs在被配体激活之前在质膜中保持失活。同源生长因子、细胞因子和激素等配体通过激活RTKs来激活PI3K信号通路，可调节细胞生长、运动、存活、代谢和血管生成^［24］。这一过程是通过一系列下游底物的丝氨酸或苏氨酸磷酸化介导的，涉及的关键基因是PI3K和AKT^{［24， 26］}。

在人体多器官纤维化过程中已有验证PI3K-Akt 与MAPK通路可能参与器官纤维化^［25］。活化的Akt蛋白可促使前体凋亡蛋白磷酸化，并在短时间内抑制凋亡途径的激活，从而可能促进口腔黏膜细胞的异常增殖，组织中表现为上皮层的堆积，或固有层的成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。本研究基于网络药理学在OSF临床样本上验证了PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT123、JNK1/2/3蛋白的表达，结果显示PI3K-Akt通路可能被激活。

MAPK级联激活的特点是多种与细胞增殖相关的信号从细胞膜外转导入细胞核，在各类器官纤维化中起到关键作用^{［27， 28］}。受到生长因子（EGF）或其他信号分子刺激后，MAPK家族中的JNK家族蛋白表达异常，JNK主要包括JNK1/2/3。JNK/SAPK信号通路可被应激刺激（如紫外线、热休克及蛋白合成抑制剂等）、细胞因子（TNF‑α，IL-1）、EGF及某些G蛋白偶联的受体激活^{［28， 29］}。JNK磷酸化激活后，可促使其下游多种转录因子（JUN、ELK1、ETS2等）与激酶（主要是MNK），产生促进生长、分化、存活、凋亡等多种生理效应^{［27， 29-31］}。本实验验证了c-Jun、c-fos蛋白作为转录因子AP-1的复合物，向细胞核聚集表达，促进下游的炎症因子IL-6与IL-8的表达升高。基于以上分析，本研究认为咀嚼槟榔可能通过MAPK通路在转录水平调节下游靶基因出现异常。

综上所述，本研究基于网络药理学方法明确了槟榔诱导OSF疾病发生的主要成分，确定了咀嚼槟榔可能通过PI3K-Akt与MAPK通路共同调节了OSF的病变。借助OSF临床样本进行免疫组化，验证了PI3K-Akt与MAPK通路蛋白表达出现异常，促进下游炎症因子IL-6及IL-8的增加，造成OSF的发生。初步阐明了槟榔诱导OSF疾病的分子机制，也为治疗OSF提供了潜在干预靶点。但是仍未能阐明具体影响疾病的槟榔成分及其影响剂量，后续需要进一步在动物体内实验和体外细胞实验中开展研究。

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