交泰丸通过激活PI3K/AKT信号通路改善阿尔茨海默病模型小鼠大脑的葡萄糖代谢

Jiaotaiwan improves brain glucose metabolism in a mouse model of Alzheimer's disease by activating the PI3K/AKT signaling pathway

摘要

目的 探讨交泰丸对阿尔茨海默病模型小鼠大脑胰岛素PI3K/AKT通路的影响。 方法 50只3月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠随机分为5组：模型组、交泰丸低剂量组（2.1 g/kg）、交泰丸中剂量组（4.2 g/kg）、交泰丸高剂量组（8.4 g/kg）、多奈哌齐组（3 mg/kg），C57BL/6J雄性小鼠为正常组，10只/组。给药4周后，采用水迷宫和旷场实验评估各组小鼠学习记忆能力，采用HE染色、尼氏染色观察小鼠脑组织神经元病理改变，免疫组化法观察小鼠脑组织Aβ淀粉样斑块沉积情况，ELISA试剂盒测定小鼠空腹血清胰岛素水平，采用Western blot和RT-qPCR检测小鼠脑组织中Aβ₄₂、胰岛素PI3K/AKT通路以及下游GLUTs等相关指标蛋白和mRNA表达水平。 结果 与正常组小鼠比较，模型组小鼠学习记忆能力受损，小鼠海马神经元细胞数量减少，排列稀疏，小鼠脑组织Aβ淀粉样斑块沉积显著增多（P<0.001），Aβ₄₂蛋白表达水平升高（P<0.05），胰岛素抵抗指数升高（P<0.001），小鼠海马PI3K蛋白以及mRNA表达均降低（P<0.01），海马与皮质AKT蛋白表达（P<0.05）、AKT mRNA表达（P<0.001）、InR蛋白表达（P<0.05），GLUT1、GLUT3、GLUT4蛋白表达（P<0.05）及mRNA表达（P<0.001）均降低，GSK3β蛋白表达（P<0.01）及GSK3β mRNA表达（P<0.001）显著升高。与模型组比较，交泰丸各组和多奈哌齐组小鼠记忆能力明显改善，尤其是交泰丸中剂量组，小鼠海马神经元细胞数量增多，小鼠海马、皮质Aβ淀粉样斑块沉积减少（P<0.01），Aβ₄₂蛋白表达下调（P<0.001），胰岛素抵抗指数降低（P<0.001），小鼠海马、皮质PI3K、AKT、InR、GLUT1、GLUT3、GLUT4蛋白（P<0.05）及mRNA（P<0.01）表达不同程度升高，GSK3β蛋白及mRNA表达降低。 结论 交泰丸可通过激活APP/PS1双转基因小鼠大脑胰岛素PI3K/AKT通路，调控其下游GLUTs表达水平，提高大脑葡萄糖代谢能力，改善小鼠学习记忆能力，延缓阿尔茨海默病发展进程。

Abstract

Objective To investigate the effect of Jiaotaiwan on brain insulin-PI3K/AKT pathway in a mouse model of Alzheimer's disease (AD). Methods Fifty 3-month-old male APP/PS1 double transgenic mice were randomized into AD model group, low-, medium- and high-dose Jiaotaiwan treatment groups, and donepezil treatment group. Cognitive functions of the mice were assessed using water maze and open field tests, and neuronal pathologies were observed with HE staining and Nissl staining; immunohistochemistry was used to detect amyloid Aβ deposition in the brain. Fasting serum insulin levels of the mice were measured, and the expressions of Aβ₄₂, insulin-PI3K/AKT pathway components and downstream glucose transporters in the brain tissue were detected with RT-qPCR and Western blotting. Results The AD mouse models exhibited obvious impairment of learning and memory abilities, significantly reduced hippocampal neurons, and obvious Aβ amyloid plaques in the brain tissue with increased Aβ₄₂ protein expression (P<0.05) and insulin resistance index, decreased hippocampal PI3K expressions, lowered expressions of AKT and InR, reduced expressions of GLUT1, GLUT3, and GLUT4, and increased expression of GSK3β in both the hippocampus and cortex. Treatment with Jiaotaiwan and donepezil both effectively improved memory ability of the mouse models, increased the number of hippocampal neurons, reduced Aβ amyloid plaques and increased the expressions of PI3K, AKT, InR, GLUT1, GLUT3 and GLUT4 in the hippocampus and cortex. Conclusion Jiaotaiwan improves learning and memory abilities of APP/PS1 double transgenic mice and delay the development of AD by activating the PI3K/AKT pathway and regulating the expression levels of its downstream GLUTs in the brain.

Graphical abstract

关键词

阿尔茨海默病 / 交泰丸 / 葡萄糖代谢 / 胰岛素PI3K/AKT通路 / 葡萄糖转运蛋白

Key words

Alzheimer's disease / Jiaotaiwan / glucose metabolism / insulin PI3K/AKT pathway / glucose transporter proteins

阿尔茨海默病（AD）是最常见的中枢神经系统退行性疾病，其确切病因尚未明确定义，且缺乏特效药物和方法有效治疗。目前，治疗药物主要以西医药为主，通过调节乙酰胆碱水平（如多奈哌齐）或拮抗兴奋性氨基酸受体（如美金刚）等影响神经递质来延缓或预防AD，但长期服用此类药物可能存在潜在危害和副作用，因此亟需寻找新的治疗药物和方法。当前研究表明，AD可能是一种与大脑葡萄糖代谢异常相关的能量代谢障碍性疾病，在AD患者临床症状显现之前就已经表现出大脑葡萄糖代谢效率降低，以及空腹血浆胰岛素水平升高和胰岛素抵抗（IR）为特征的外周血糖的改变^［1-3］。这些发现表明，改善大脑内葡萄糖代谢障碍可能是延缓AD发病的有效策略之一。

目前多奈哌齐在临床广泛应用于对AD患者认知能力的改善，研究表明AD患者接受多奈哌齐治疗后大脑葡萄糖代谢选择性增加^［2］，并且多奈哌齐可不同程度改善APP/PS1双转基因小鼠胰岛素信号通路相关蛋白和葡萄糖转运蛋白表达水平^［3］。这提示AD与大脑葡萄糖代谢之间具有紧密联系。交泰丸具有交通心肾，调节体内水液代谢，改善消渴病症状的作用。现代药理学和临床研究证实，交泰丸能够调节外周血糖，对治疗2型糖尿病（T2DM）及相关并发症具有益处^［4］，而以IR和胰岛素信号传导障碍为特征的T2DM又是AD常见的合并症和危险因素^{［5， 6］}。在大脑内，PI3K/AKT信号通路是胰岛素介导葡萄糖代谢的关键途径之一^{［7， 8］}，胰岛素穿过血脑屏障（BBB）与胰岛素受体（InR）结合，引起其底物磷酸化从而激活PI3K，进一步磷酸化并激活胰岛素信号级联反应中重要靶点AKT，随后激活下游GSK3β磷酸化。PI3K/AKT通路激活进一步调控下游大脑内葡萄糖转运蛋白（GLUTs），从而加快BBB葡萄糖转运速度。研究表明，交泰丸中的有效成分小檗碱主要通过调控胰岛素信号通路，增加胰岛素敏感性，改善IR状态^［9］。因此我们推测，交泰丸对血糖的调控作用可以用于防治以大脑葡萄糖代谢障碍为发病机制的AD疾病。交泰丸可以通过激活大脑PI3K/AKT信号通路，调控BBB葡萄糖转运效率，从而改善大脑葡萄糖代谢水平，减轻AD患者临床症状以及特征性病理改变。

因此，本文拟从PI3K/AKT信号通路的角度研究交泰丸对APP/PS1双转基因小鼠大脑葡萄糖代谢的影响，探讨交泰丸防治AD可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

3月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠、野生型C57BL/6J小鼠（杭州子源公司）常规饲养于SPF级动物房，温度维持在22 ℃，湿度为50%~70%，12 h光照和12 h黑暗环境。本研究动物实验由皖南医学院实验动物福利与伦理委员会批准进行（审批号：LLSC-2021-185）。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要药材及试剂

黄连、肉桂（弋矶山医院中药房）；多奈哌齐片（卫材药业有限公司）；羧甲基纤维素钠（北京精求化工）；小鼠胰岛素（INS）试剂盒（上海江莱生物）；BCA蛋白浓度试剂盒、蛋白酶抑制剂（碧云天）、TRNzol Universal总RNA提取试剂（天根生化）；逆转录试剂盒（ThermoFisher Scientific）；Luna® Universal qPCR荧光染料（New england biolabs）；兔抗GLUT1、3、4抗体（ABclonal Technology）；鼠抗Aβ₄₂抗体（Bioss）；兔抗PI3K、Akt、InR抗体（Abcam）；兔抗GSK3β（Cell Signaling Technology）；HRP偶联二抗（Proteintech）。

1.2.2 主要仪器

核酸蛋白定量仪（Eppendorf）；血糖仪（江苏鱼跃）；PCR仪（Applied Biosystems）；Morris水迷宫系统、旷场实验系统（深圳瑞沃德）；石蜡切片机（莱卡）；切片组织摊片机（武汉俊杰）；高速离心机（Hettich）；全自动化学发光凝胶成像仪（GE Amersham Imager 600）；正置荧光显微镜（奥林巴斯）；全波长酶标仪（Biochrom）

1.3 药物及制备

按比例10∶1称量肉桂和黄连两种药材，在肉桂中加入8倍体积的蒸馏水，浸泡1 h后使用挥发油提取装置，水蒸气蒸馏持续5 h收集肉桂挥发油；在提取完肉桂挥发油后，将剩余药渣与黄连一起浸泡于恒温器中2 h，然后进行两次煎煮，2 h/次，提取药材中有效成分；将所得药液冷却、过滤，使用旋转蒸发仪浓缩后与挥发油混合，制成交泰丸高浓度药液作为交泰丸高剂量组给药，另外交泰丸低、中剂量组按比例稀释给药，药液需分装低温保存。蒸馏水配置0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）用于溶解多奈哌齐片。

1.4 实验动物分组及给药方法

50只3月龄雄性APP/PS1双转基因雄性小鼠通过随机数字表法平均分为5组：模型组、交泰丸低剂量组、交泰丸中剂量组、交泰丸高剂量组、多奈哌齐组（10只/组），另有10只3月龄雄性C57BL/6J小鼠为正常组。高剂量组由临床成人日用最大生粉量，按照人鼠用药剂量换算公式得出为8.4 g/kg，低、中剂量组分别按照人体等效剂量的四分之一和二分之一由交泰丸高浓度药液稀释制成，即交泰丸低、中、高剂量组给药量分别为2.1、4.2、8.4 g/kg。多奈哌齐组3 mg/（kg·d），正常组、模型组灌胃等体积0.5%CMC进行治疗。每天08：30灌胃给药，4周后进行小鼠行为学测试，实验结束后，实验小鼠禁食但不禁水12 h，采用腹腔注射戊巴比妥钠法（150 mg/kg）进行麻醉处理，眼球摘除采取血液样本并分离血清。6只小鼠迅速在冰盘上分离出海马、皮质组织冻存于-80 ℃冰箱备用，剩余小鼠大脑使用4%多聚甲醛溶液固定24 h备用。

1.5 实验方法

1.5.1 Morris水迷宫、旷场实验

水迷宫实验共计6 d，前5 d为定位航行期，于水面下约1 cm处设实验平台，每组小鼠每天分别从4个象限边缘中间处，头朝下背靠桶壁分别入水，同时摄像机记录小鼠找到平台所需时间，若60 s内未找到平台，则引导其找到平台并站立10 s；第6天为空间探索期，将水下平台撤去，小鼠于距离平台直线距离最远象限处入水，记录60 s内各组小鼠的运动轨迹和活动参数。

旷场试验由敞口正方形纸盒及摄像系统组成，箱体长50 cm、宽50 cm、高40 cm，内部为白色背景，试验开始时，操作者将各组小鼠从同一角落放入纸箱，自动摄像系统可识别并记录5 min内各组小鼠的运动轨迹和活动参数。

1.5.2 HE染色、尼氏染色

小鼠处死后，脑组织取出后进行多聚甲醛固定处理，处理时间为24 h，常规进行透明、脱水、浸蜡、包埋并制备石蜡切片，每个切片厚度为6~8 μm；玻片依次在二甲苯Ⅰ、II、III中各浸泡5 min，然后在无水乙醇、95%酒精、75%酒精中各浸泡1 min，随后在自来水中冲洗数秒；玻片置于苏木素染色液中3 min，随后在自来水中冲洗数秒，放入分化液中，数秒后再次用自来水冲洗，最后放入伊红染色液中30 s；玻片依次在75%酒精、95%酒精、无水乙醇中脱水30 s；最终，将玻片依次放入二甲苯Ⅰ、II、III中各透明化5 min，用树脂胶进行固封，在显微镜下观察HE染色的结果。

对小鼠处死取脑组织后用多聚甲醛固定24 h，用0.1%考马斯亮蓝染色液对组织进行染色，染色完成后，蒸馏水冲洗，中性树脂固封，显微镜下观察尼氏染色结果。

1.5.3 免疫组化法检测

对处死小鼠的脑组织进行多聚甲醛固定处理，处理时间约为24 h，再进行组织脱水、浸蜡和包埋，制备切片；酶消化法进行抗原修复以暴露抗原；切片置于非特异性抗体封闭液中1 h进行封闭处理；Aβ抗体（1 ∶500）室温孵育2 h；DAB显色剂室温孵育30 min进行免疫反应，显微镜20倍物镜下拍摄脑组织海马和皮层区域。图像分析每组选取4张脑片，使用 Image J软件对染色区域进行标记操作，测量各组小鼠Aβ淀粉样斑块阳性信号面积占比。

1.5.4 ELISA检测小鼠血清胰岛素含量

全血标本于离心机内1000×g离心15 min，取上清待测。依据ELISA试剂盒说明书检测胰岛素含量。计算小鼠胰岛素抵抗指数：胰岛素抵抗指数=空腹血糖（mmol/L）×空腹胰岛素（mU/L）/22.5。

1.5.5 Western blot 检测

取冷冻小鼠海马、皮质组织，加入裂解液，常规方法进行总蛋白提取，BCA法检测蛋白浓度，沸水中煮10 min后上样，电泳分离后湿转法转膜至PVDF膜，室温脱脂牛奶封闭1.5 h，加入β-actin 、Aβ₄₂、PI3K、AKT、GSK3β、InR、GLUT1、GLUT3、GLUT4蛋白一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗脱后加入对应的HRP偶联二抗，室温孵育1 h，TBST洗脱，加入ECL显影液，暗室发光反应成像拍照，使用Image J图像分析软件测量各组不同目的蛋白和内参蛋白（β-actin）灰度值，对各组不同指标的相对表达量（目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值）归一化处理，统计分析并作图。

1.5.6 RT-qPCR检测

称取各组小鼠海马、皮层组织100 mg 加入 1 mL Trizol 匀浆后加入200 μL氯仿，震荡30 s后静置10 min，使RNA进入水相，离心使沉淀分离，将上清转移到新EP管中，加入等体积异丙醇，离心后弃去上清，无水乙醇洗涤RNA沉淀；按照逆转录试剂盒说明书操作反转录cDAN作为模板，再依次加入正反向引物、荧光染料等进行梯度PCR操作，以β-Actin为内参，2^-△△ct法计算相关 mRNA 相对表达水平。

1.6 统计学方法

采用PASS 2021软件计算样本量，根据预实验结果，各组小鼠进入旷场实验中央区域活动时间正常组为21.96±2.53 s，模型组为16.14±1.95 s，交泰丸低剂量组为18.92±2.36 s，交泰丸中剂量组为20.15±3.15 s，交泰丸高剂量组为18.7±2.44 s，多奈哌齐组为19.46±3.12 s，拟定α=0.05，1-β=0.8，所得样本量为8只/组，预计样本脱落率20%，最终纳入10只/组小鼠。

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，定量数据采用均数±标准差表示，经正态性和方差齐性检验，组间差异比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 交泰丸对APP /PS1双转基因小鼠学习记忆行为的影响

在Morris水迷宫定位航行实验中，随着实验时间的延长，各组小鼠首次找到平台所需的时间（逃避潜伏期）逐渐缩短。与正常组相比，模型组小鼠定位航行实验逃避潜伏期均增加（P<0.001）；与模型组相比，多奈哌齐组小鼠实验第2天和第5天逃避潜伏期较模型组小鼠下降（P<0.001），交泰丸中剂量组小鼠，实验第2~5天逃避潜伏期均降低（P<0.001），同时交泰丸低、高剂量组小鼠逃避潜伏期也出现不同程度的降低（图1A、B）。

与正常组比较，模型组小鼠在Morris水迷宫空间探索实验中首次跨越平台时间延长（P<0.001），而穿越平台次数以及在平台所在象限停留时间则减少（P<0.001），在旷场实验中进入中央区次数以及中央区域活动时间均降低（P<0.001）；与模型组比较，多奈哌齐组小鼠穿越平台次数以及进入中央区次数以及中央区域活动时间不同程度增加，并且首次跨越平台时间缩短（P<0.05），交泰丸低剂量组小鼠穿越平台次数和进入中央区次数增加（P<0.001），首次跨越平台时间缩短（P<0.01），交泰丸中剂量组小鼠穿越平台次数、平台所在象限停留时间以及进入中央区次数以及中央区域活动时间均增加（P<0.001），同时首次跨越平台时间缩短（P<0.001），交泰丸高剂量组小鼠穿越平台次数以及进入中央区次数以及中央区域活动时间不同程度增加，且首次跨越平台时间缩短（P<0.05，表1，图1C）。

2.2 交泰丸对APP /PS1双转基因小鼠海马神经元的影响

HE染色结果显示，正常组小鼠海马CA3和DG区神经元呈现出结构形态完整、清晰，并且排列规则且致密；模型组小鼠的海马CA3区和DG区神经元出现细胞结构破坏，排列层次紊乱，数量减少，细胞稀疏，间隙增大，细胞核出现萎缩；与模型组比较，交泰丸低、中、高剂量组和多奈哌齐组小鼠海马CA3和DG区神经元细胞不同程度有所增加，形态结构得到一定改善，其中交泰丸中剂量组小鼠海马CA3和DG区神经元细胞数量明显增加，结构形态完整（图2A）。

尼氏染色结果显示，正常组小鼠海马CA3和DG区神经元细胞数量致密，排列整齐均匀；模型组小鼠的海马神经元呈现出细胞形态结构的破坏，且排列较为稀疏，层次紊乱，尼氏小体脱失严重；而交泰丸低、中、高剂量组以及多奈哌齐组小鼠神经元细胞形态不同程度改善，结构较为完整，尼氏小体较模型组丰富，其中交泰丸中剂量组改善最为明显（图2B）。

2.3 交泰丸对APP /PS1双转基因小鼠脑组织Aβ斑块和Aβ₄₂蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠脑组织海马、皮质区域中Aβ淀粉样斑块面积增加（P<0.01），Aβ₄₂蛋白表达水平呈升高趋势，其中海马区Aβ₄₂蛋白表达水平变化最为显著（P<0.001）；与模型组比较，交泰丸中、高剂量组和多奈哌齐组小鼠组脑组织海马、皮质Aβ淀粉样斑块面积均减少（P<0.001），交泰丸低剂量组也不同程度减少（P<0.01，P<0.001），交泰丸各剂量治疗组和多奈哌齐组组小鼠海马区域中Aβ₄₂蛋白表达水平均降低（P<0.001），皮质区域结果虽有降低趋势，但差异无统计学意义（图3）。

2.4 交泰丸对APP/PS1双转基因小鼠大脑胰岛素PI3K/AKT通路的影响

2.4.1 交泰丸对APP/PS1双转基因小鼠胰岛素抵抗的影响

与正常组比较，模型组小鼠表现出空腹血糖、胰岛素水平以及胰岛素抵抗指数显著升高（P<0.001）；与模型组比较，多奈哌齐组小鼠空腹血糖、胰岛素水平和胰岛素抵抗指数均出现不同程度降低（P<0.01、P<0.001），交泰丸低剂量组小鼠胰岛素抵抗指数呈现明显下降趋势（P<0.001），交泰丸中剂量组小鼠空腹血糖、胰岛素水平和胰岛素抵抗指数下降最为明显（P<0.01、P<0.001），交泰丸高剂量组小鼠也不同程度下降（P<0.05、P<0.001，表2）。

2.4.2 交泰丸对APP/PS1双转基因小鼠大脑胰岛素PI3K/AKT通路的影响

与正常组比较，模型组小鼠海马、皮质区域InR蛋白表达均有所降低（P<0.05、P<0.001），皮质区域中InR mRNA表达水平也显著降低（P<0.001）；与模型组比较，交泰丸低剂量组小鼠皮质域中InR mRNA表达水平上升（P<0.001），交泰丸中、高剂量组小鼠海马、皮质区域InR蛋白均有所上调（P<0.05、P<0.001）。

与正常组比较，模型组小鼠海马区域PI3K蛋白和mRNA表达水平均明显降低（P<0.01），其皮质区域PI3K mRNA表达水平下降（P<0.001），同时模型组小鼠海马、皮质区域AKT蛋白和mRNA表达水平也均出现不同程度降低（P<0.05、P<0.001），而GSK3β 蛋白和mRNA表达水平升高（P<0.001）；与模型组比较，交泰丸中剂量组小鼠海马区域PI3K蛋白表达水平升高（P<0.05），同时交泰丸各剂量组和多奈哌齐组小鼠皮质区域PI3K mRNA表达水平均升高（P<0.001），交泰丸中、高剂量组小鼠海马区域PI3K mRNA表达也上升（P<0.05），交泰丸中剂量组和多奈哌齐组小鼠海马区域AKT蛋白表达水平明显升高（P<0.01），交泰丸各剂量组和多奈哌齐组小鼠AKT mRNA表达均上升（P<0.001），交泰丸低、中剂量组小鼠海马、皮质区域GSK3β蛋白表达水平均不同程度降低，交泰丸各剂量组和多奈哌齐组小鼠GSK3β mRNA表达水平降低（P<0.001，图4）。

2.4.3 交泰丸对APP/PS1双转基因小鼠大脑葡萄糖转运的影响

与正常组比较，模型组小鼠海马、皮质区域中GLUT1、GLUT3、GLUT4蛋白表达水平均下调（P<0.05、P<0.01），其mRNA表达显著下降（P<0.001），与模型组比较，交泰丸中剂量组和多奈哌齐组小鼠海马、皮质区域GLUT1、GLUT3、GLUT4蛋白表达水平均上调（P<0.05、P<0.01），而交泰丸各剂量组和多奈哌齐组小鼠海马、皮质区域GLUT1、GLUT3、GLUT4 mRNA表达水平则均显著上升（P<0.001，图5）。

3 讨论

AD是一种中枢神经系统中逐渐发展的退行性疾病，其病理特征包括老年斑沉积和神经纤维缠结，这些病理表现主要由β淀粉样蛋白（Aβ）的聚集以及tau蛋白的过度磷酸化引起，然而，由于AD的病因十分复杂，其作用机制至今尚未完全阐明。近年研究发现，AD疾病的发生与进程和大脑内葡萄糖代谢具有紧密联系。研究显示AD临床常用药物多奈哌齐对具有大脑IR和AD样改变的T2DM大鼠模型具有神经保护作用，可以减少大脑内Aβ斑块聚集^［10］，并且多奈哌齐还可以通过选择性增加受影响的皮质下体积的葡萄糖代谢率来恢复AD小鼠模型正常大脑葡萄糖代谢^［11］，其结果与AD患者接受多奈哌齐治疗后¹⁸F-FDG脑摄取增加结果相一致^［12］，提示改善大脑葡萄糖代谢有利于AD的防治。交泰丸由黄连、肉桂按照10∶1配伍组成。现代药理学和临床研究已经证实，黄连具有改善机体葡萄糖代谢、保护胰岛β细胞、提高胰岛素敏感性并改善IR等作用。单独使用黄连素对糖尿病模型小鼠进行治疗后，小鼠出现体质量减轻、糖耐性升高的现象^［13］。研究显示，黄连多糖分离纯化后具备较为明显的降糖效果^［14］。此外，肉桂中提取的肉桂醛^{［［15， 16］}、肉桂多酚^［17］等成分也被证实具有治疗糖尿病的作用。黄连中的小檗碱与肉桂中的cinnamtannin D-1联合使用时，能够显著改善2型糖尿病小鼠的症状^［18］。

AD同时具备１型糖尿病和２型糖尿病共同的病理特点，部分研究将其命名为３型脑型糖尿病^［19］，认为其在本质上是一种代谢性的疾病^{［20， 21］}。AD患者大脑往往存在IR ^［22］，脑内IR使脑细胞无法对胰岛素做出正确及时的反应，导致突触、代谢和免疫反应等功能受损。大脑中的胰岛素对保护记忆和认知功能具有较好的促进作用，而胰岛素不敏感则可能诱发大脑葡萄糖代谢效率降低，从而造成大脑记忆及认知能力的损伤。研究发现，与健康者相比较，AD患者脑脊液中胰岛素介导的葡萄糖代谢水平出现降低^［23］，还有研究表明中枢神经系统中的胰岛素作用异常可能是引起散发型AD疾病产生以及其特征性病理改变的重要因素之一^［24］。本实验中，APP/PS1双转基因小鼠胰岛素抵抗指数显著升高，出现明显的大脑IR，而交泰丸可以较好改善APP/PS1双转基因小鼠大脑IR症状。

胰岛素PI3K/AKT信号通路在大脑中枢神经系统中广泛存在，是胰岛素调节大脑葡萄糖代谢的重要途径之一，受InR和胰岛素受体底物调控。当胰岛素与其受体结合后作用于下游大脑胰岛素PI3K/AKT信号通路，从而调控关键靶点PI3K和AKT，这些靶点进一步会磷酸化下游底物GSK3β^［25］。GSK3β在糖原合成过程中扮演者关键角色^［26］，它的活性受到胰岛素PI3K/AKT通路抑制时，糖原合成酶活性增加，促进体内糖原合成^{［27， 28］}。此外，胰岛素PI3K/AKT通路还对其他与葡萄糖代谢相关的途径进行调节，如糖酵解，通过促进糖原合成，改善葡萄糖代谢。胰岛素PI3K/AKT信号通路在大脑中通过调控GSK3β的活性及其他代谢途径，对葡萄糖代谢进行调节^［29］。有研究证实，胰岛素PI3K/AKT通路异常可以导致Ａβ沉积以及Tau蛋白磷酸化水平升高，进一步加快大脑内淀粉样斑块以及神经纤维缠结等病理改变产生，导致大脑内突触以及神经元的损伤，进而影响认知功能，最终导致AD发生^{［30， 31］}。研究发现，交泰丸治疗糖尿病模型小鼠后，小鼠p-Akt和p-GSK-3β磷酸化水平升高，表明胰岛素PI3K/AKT转导通路激活，导致tau蛋白磷酸化水平降低，神经元损伤程度缓解，此外，治疗后IR明显减轻^［32］。以上表明胰岛素PI3K/AKT信号通路激活对于改善AD特征性病理改变具有促进作用。本实验中，APP/PS1双转基因小鼠大脑内InR、PI3K、AKT蛋白及mRNA表达水平较正常组小鼠降低，而GSK3β蛋白及mRNA表达水平显著升高，脑组织中淀粉样斑块面积明显增多，Aβ₄₂蛋白表达升高，表明APP/PS1双转基因小鼠胰岛素PI3K/AKT通路受到抑制；经交泰丸治疗后，小鼠PI3K、AKT、InR蛋白表达以及mRNA表达水平均升高，同时GSK3β蛋白及mRNA表达降低，脑组织淀粉样斑块面积均减少，Aβ₄₂蛋白表达降低，提示交泰丸可以通过激活胰岛素PI3K/AKT通路，改善APP/PS1双转基因小鼠脑组织淀粉样斑块聚集的病理状况。

此外，胰岛素相关通路对GLUTs具有调控作用。当大脑内胰岛素PI3K/AKT通路激活调控下游GLUTs，加快了BBB葡萄糖转运速度，从而促进葡萄糖代谢^［33］。其中GLUT4为胰岛素反应性蛋白，定位于认知功能相关脑区，有研究表明糖尿病模型大鼠下丘脑腹内侧核注射胰岛素可激活PI3K/AKT通路，促进GLUT4表达升高，可恢复受损的葡萄糖代谢^［34］。本实验中，APP/PS1双转基因小鼠脑组织GLUT1、GLUT3、GLUT4蛋白及mRNA表达较正常组小鼠均显著降低，说明APP/PS1双转基因小鼠大脑葡萄糖转运出现异常，导致大脑葡萄糖代谢降低；交泰丸治疗组尤其是交泰丸中剂量组小鼠海马和皮质区域中GLUT1、GLUT3、GLUT4蛋白表达及mRNA表达水平较模型组小鼠均显著升高，表明交泰丸可以通过改善APP/PS1双转基因小鼠脑组织葡萄糖转运，提高大脑葡萄糖代谢能力。

综上所述，APP/PS1双转基因小鼠学习记忆功能异常、脑组织海马和皮质出现淀粉样蛋白沉积、神经元细胞受损，可能与小鼠大脑胰岛素PI3K/AKT通路以及其下游GLUTs相关指标表达降低从而引发小鼠大脑内葡萄糖代谢异常相关。交泰丸能够激活APP/PS1双转基因小鼠大脑胰岛素PI3K/AKT通路，调控下游小鼠脑组织中GLUTs表达，从而提高大脑内葡萄糖代谢能力以及大脑内能量供给，维持大脑正常活动和功能，改善脑部神经元病理损伤，恢复其大脑学习记忆能力，延缓AD的发展进程。但由于中医方剂药物有效成分较为复杂，作用靶点多，加之与AD相关的胰岛素PI3K/AKT信号通路下游靶点作用机制未完全明确，后期还需从细胞层面对于下游靶点作用的具体机制进行研究。

参考文献

[1] Kellar D, Craft S. Brain insulin resistance in Alzheimer's disease and related disorders: mechanisms and therapeutic approaches[J]. Lancet Neurol, 2020, 19(9): 758-66. DOI: 10.1016/s1474-4422(20)30231-3

[2] Ou ZH, Deng LL, Lu Z, et al. Protective effects of Akkermansia muciniphila on cognitive deficits and amyloid pathology in a mouse model of Alzheimer’s disease[J]. Nutr Diabetes, 2020, 10(1): 12. DOI: 10.1038/s41387-020-0115-8

[3] Macklin L, Griffith CM, Cai Y, et al. Glucose tolerance and insulin sensitivity are impaired in APP/PS1 transgenic mice prior to amyloid plaque pathogenesis and cognitive decline[J]. Exp Gerontol, 2017, 88: 9-18. DOI: 10.1016/j.exger.2016.12.019

[4] Teipel SJ, Drzezga A, Bartenstein P, et al. Effects of donepezil on cortical metabolic response to activation during (18)FDG-PET in Alzheimer's disease: a double-blind cross-over trial[J]. Psychopharmacology, 2006, 187(1): 86-94. DOI: 10.1007/s00213-006-0408-1

[5] Chen F, He YK, Wang PW, et al. Banxia Xiexin Decoction ameliorated cognition via the regulation of insulin pathways and glucose transporters in the hippocampus of APPswe/PS1dE9 mice[J]. Int J Immunopathol Pharmacol, 2018, 32: 2058738418780066. DOI: 10.1177/2058738418780066

[6] 袁 琳, 李慧姣, 胡 娜, 等. 交泰丸不同配比组方降糖作用及相关机制探讨[J]. 中国实验方剂学杂志, 2017, 23(8): 130-7.

[7] Boccardi V, Murasecco I, Mecocci P. Diabetes drugs in the fight against Alzheimer's disease[J]. Ageing Res Rev, 2019, 54: 100936. DOI: 10.1016/j.arr.2019.100936

[8] Blázquez E, Hurtado-Carneiro V, LeBaut-Ayuso Y, et al. Significance of brain glucose hypometabolism, altered insulin signal transduction, and insulin resistance in several neurological diseases[J]. Front Endocrinol, 2022, 13: 873301. DOI: 10.3389/fendo.2022.873301

[9] Yan F, Liu J, Chen MX, et al. Icariin ameliorates memory deficits through regulating brain insulin signaling and glucose transporters in 3 × Tg-AD mice[J]. Neural Regen Res, 2023, 18(1): 183-8. DOI: 10.4103/1673-5374.344840

[10] Davidy T, Yore I, Cukierman-Yaffe T, et al. A feasibility study of the combination of intranasal insulin with dulaglutide for cognition in older adults with metabolic syndrome at high dementia risk‑Study rationale and design[J]. Mech Ageing Dev, 2023, 213: 111825. DOI: 10.1016/j.mad.2024.111937

[11] 张韶君, 高江琴, 邱贵娟, 等. 黄连素通过调节磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸/苏氨酸激酶/葡萄糖转运蛋白4信号途径改善胰岛素抵抗的机制研究[J]. 中国药物与临床, 2017, 17(11): 1569-71.

[12] Gomaa AA, Makboul RM, El-Mokhtar MA, et al. Evaluation of the neuroprotective effect of donepezil in type 2 diabetic rats[J]. Fundam Clin Pharmacol, 2021, 35(1): 97-112. DOI: 10.1111/fcp.12585

[13] Hugon G, Goutal S, Sarazin M, et al. Impact of donepezil on brain glucose metabolism assessed using[¹⁸F]₂-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography imaging in a mouse model of Alzheimer’s disease induced by intracerebroventricular injection of amyloid-beta peptide[J]. Front Neurosci, 2022, 16: 835577. DOI: 10.3389/fnins.2022.835577

[14] Shimada A, Hashimoto H, Kawabe J, et al. Evaluation of therapeutic response to donepezil by positron emission tomography[J]. Osaka City Med J, 2011, 57(1): 11-9.

[15] 邓晓威, 谢 宁. 黄连素治疗2型糖尿病研究进展[J]. 中国中药杂志, 2014, 39(8): 1374-8.

[16] Huang WY, Dong H. Coptidis rhizoma-contained traditional formulae for insomnia: a potential to prevent diabetes?[J]. Chin J Integr Med, 2018, 24(10): 785-8. DOI: 10.1007/s11655-018-3012-4

[17] 宋宗辉, 张艺雯, 王玲洁, 等. 肉桂醛的药理活性及其研究进展[J]. 解放军药学学报, 2018, 34(6): 550-4.

[18] 卫克昭, 姚平安, 刘晓宁, 等. 肉桂对糖尿病性心肌病大鼠的心脏保护作用[J]. 上海中医药杂志, 2018, 52(7): 69-74.

[19] 廖作庄, 徐灵源, 王金妮, 等. 肉桂多酚对链脲佐菌素致糖尿病小鼠的保护作用[J]. 西安交通大学学报: 医学版, 2019, 40(1): 162-6.

[20] 王雪萍, 张皓月, 王 婷, 等. 交泰丸中小檗碱联合cinnamtannin D1的降血糖作用[J]. 中成药, 2018, 40(12): 2613-8.

[21] Nguyen TT, Ta QTH, Nguyen TKO, et al. Type 3 diabetes and its role implications in Alzheimer's disease[J]. Int J Mol Sci, 2020, 21(9): 3165. DOI: 10.3390/ijms21093165

[22] Suresh J, Khor IW, Kaur P, et al. Shared signaling pathways in Alzheimer's and metabolic disease may point to new treatment approaches[J]. FEBS J, 2021, 288(12): 3855-73. DOI: 10.1111/febs.15540

[23] Sun YN, Ma C, Sun H, et al. Metabolism: a novel shared link between diabetes mellitus and Alzheimer's disease[J]. J Diabetes Res, 2020, 2020: 4981814. DOI: 10.1155/2020/4981814

[24] Alves SS, Servilha-Menezes G, Rossi L, et al. Evidence of disturbed insulin signaling in animal models of Alzheimer's disease[J]. Neurosci Biobehav Rev, 2023, 152: 105326. DOI: 10.1016/j.neubiorev.2023.105326

[25] Kim B, Elzinga SE, Henn RE, et al. The effects of insulin and insulin-like growth factor I on amyloid precursor protein phosphorylation in in vitro and in vivo models of Alzheimer's disease[J]. Neurobiol Dis, 2019, 132: 104541. DOI: 10.1016/j.nbd.2019.104541

[26] Zhang N, Liu XY, Zhuang LL, et al. Berberine decreases insulin resistance in a PCOS rats by improving GLUT4: dual regulation of the PI3K/AKT and MAPK pathways[J]. Regul Toxicol Pharmacol, 2020, 110: 104544. DOI: 10.1016/j.yrtph.2019.104544

[27] Akhtar A, Sah SP. Insulin signaling pathway and related molecules: role in neurodegeneration and Alzheimer's disease[J]. Neurochem Int, 2020, 135: 104707. DOI: 10.1016/j.neuint.2020.104707

[28] Wang L, Li JJ, Di LJ. Glycogen synthesis and beyond, a comprehensive review of GSK3 as a key regulator of metabolic pathways and a therapeutic target for treating metabolic diseases[J]. Med Res Rev, 2022, 42(2): 946-82. DOI: 10.1002/med.21867

[29] Zhang F, Zhang ZL, Kong DS, et al. Tetramethylpyrazine reduces glucose and insulin-induced activation of hepatic stellate cells by inhibiting insulin receptor-mediated PI3K/AKT and ERK pathways[J]. Mol Cell Endocrinol, 2014, 382(1): 197-204. DOI: 10.1016/j.mce.2013.09.020

[30] Wadhwa P, Jain P, Jadhav HR. Glycogen synthase kinase 3 (GSK3): its role and inhibitors[J]. Curr Top Med Chem, 2020, 20(17): 1522-34. DOI: 10.2174/1568026620666200516153136

[31] Xu AP, Zeng QT, Tang YS, et al. Electroacupuncture protects cognition by regulating tau phosphorylation and glucose metabolism via the AKT/GSK3β signaling pathway in Alzheimer's disease model mice[J]. Front Neurosci, 2020, 14: 585476. DOI: 10.3389/fnins.2020.585476

[32] Yang W, Liu Y, Xu QQ, et al. Sulforaphene ameliorates neuroinflammation and hyperphosphorylated tau protein via regulating the PI3K/akt/GSK-3β pathway in experimental models of Alzheimer's disease[J]. Oxid Med Cell Longev, 2020, 2020: 4754195. DOI: 10.1155/2020/4754195

[33] Biasibetti R, Almeida Dos Santos JP, Rodrigues L, et al. Hippocampal changes in STZ-model of Alzheimer's disease are dependent on sex[J]. Behav Brain Res, 2017, 316: 205-14. DOI: 10.1016/j.bbr.2016.08.057

[34] 李娟娥, 姜小帆. 交泰丸对糖尿病小鼠认知功能障碍的影响及机制[J]. 中国实验方剂学杂志, 2019, 25(17): 23-7.

[35] 王 帅, 金 磊, 海春旭, 等. PI3K/Akt信号通路在胰岛素抵抗中作用的研究进展[J]. 毒理学杂志, 2015, 29(4): 313-6.

[36] Agrawal R, Vieira-de-Abreu A, Durupt G, et al. Insulin regulates GLUT4 in the ventromedial hypothalamus to restore the sympathoadrenal response to hypoglycemia in diabetic rats[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2018, 315(6): E1286-95. DOI: 10.1152/ajpendo.00324.2018

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