扁蒴藤素通过活性氧调控PI3K/AKT通路增强顺铂诱导鼻咽癌细胞凋亡

Pristimerin enhances cisplatin-induced apoptosis in nasopharyngeal carcinoma cells via ROS-mediated deactivation of the PI3K/AKT signaling pathway

摘要

目的 观察扁蒴藤素和顺铂对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其作用机制。 方法 CCK-8法检测不同浓度扁蒴藤素、顺铂处理24 h后HNE-1和CNE-2Z细胞的存活率，集落形成实验观察细胞集落形成能力，流式细胞术检测细胞凋亡和活性氧（ROS）水平，Western blotting检测蛋白表达。N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理后，检测细胞增殖、凋亡及通路的影响。 结果 CCK-8结果显示，扁蒴藤素和顺铂均可抑制HNE-1和CNE-2Z细胞的存活率（P<0.05）。与单用扁蒴藤素或顺铂相比，联合使用明显抑制细胞存活率和细胞集落形成能力（P<0.05），升高细胞凋亡率（P<0.01）和细胞内ROS水平（P<0.01），上调Bax、Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的表达（P<0.05），下调Bcl-2、Mcl-1和PARP的表达（P<0.05），同时，下调细胞中p-PI3K和p-AKT的表达（P<0.05）。而NAC可部分逆转扁蒴藤素联合顺铂对HNE-1和CNE-2Z细胞的增殖抑制（P<0.01）和凋亡诱导作用（P<0.05），部分恢复p-PI3K和p-AKT的下调作用（P<0.05）。 结论 扁蒴藤素能增强鼻咽癌细胞对顺铂的增殖抑制和凋亡诱导作用，其机制可能与ROS介导的PI3K/AKT信号通路失活有关。

Abstract

Objective To explore the effect of pristimerin combined with cisplatin on proliferation and apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells. Methods CCK-8 assay was used to examine the survival rate of HNE-1 and CNE-2Z cells following treatment for 24 h with different concentrations of pristimerin, cisplatin or their combination. The changes in colony formation ability, apoptosis, and intracellular reactive oxygen species (ROS) levels of the treated cells were analyzed using colony formation assay and flow cytometry. Western blotting was performed to detect the changes in protein expressions in the cells. The effects of pre-treatment with NAC on proliferation, apoptosis, and PI3K/AKT signaling pathway were observed in pristimerin- and/or cisplatin-treated cells. Results Both pristimerin and cisplatin significantly lowered the survival rate of HNE-1 and CNE-2Z cells (P<0.05). Compared with pristimerin or cisplatin alone, their combination more strongly inhibited survival and colony formation ability of the cells, increased cell apoptosis rate and intracellular ROS levels, upregulated the protein expressions of Bax, cleaved caspase-3, and cleaved PARP, and downregulated the protein expressions of Bcl-2, Mcl-1, PARP and p-PI3K and p-AKT (P<0.05). NAC pretreatment significantly attenuated proliferation inhibition and apoptosis-promoting effects of pristimerin combined with cisplatin, and partially restored the downregulated protein expressions of p-PI3K and p-AKT in HNE-1 and CNE-2Z cells with the combined treatment (P<0.05). Conclusion Pristimerin can enhance cisplatin-induced proliferation inhibition and apoptosis in nasopharyngeal carcinoma cells, the mechanism of which may involve ROS-mediated deactivation of the PI3K/AKT signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

鼻咽癌 / 扁朔藤素 / 顺铂 / 活性氧 / PI3K/AKT信号通路

Key words

nasopharyngeal carcinoma / pristimerin / cisplatin / reactive oxygen species / PI3K/AKT signaling pathway

鼻咽癌是一种起源于鼻咽上皮的头颈部恶性肿瘤^［1］，其地理分布独特，在东南亚和中国南部高发^{［2， 3］}。由于鼻咽癌起病隐匿，早期症状不典型，超过70%的鼻咽癌患者在首次诊断时已处于晚期或出现转移^{［4， 5］}。对于局部晚期鼻咽癌患者主要采用以顺铂为主的化疗同步放疗方式^［6］，但仍有20%~30%的患者由于化疗耐药导致治疗失败^{［5， 7， 8］}。因此，迫切需要寻找低毒高效的药物以提高鼻咽癌的治疗效果。

近年来，天然药物因具有良好的抗肿瘤效果，又能减轻化疗药物的不良反应受到广泛关注。扁蒴藤素是一种醌甲基三萜化合物^［9］，具有抗炎、抗氧化、抗疟疾等多种药理活性^{［10， 11］}，对多种肿瘤有显著抑制作用，如肺癌、乳腺癌、结肠癌和胰腺癌等^［12-15］。研究表明，扁蒴藤素可增强多种化疗药物的敏感性^［15-17］，降低其不良反应，从而提高治疗效果。然而，关于扁蒴藤素逆转鼻咽癌化疗耐药的研究较少，扁蒴藤素是否增强顺铂对鼻咽癌的化疗敏感性尚无相关报道。

活性氧（ROS）是肿瘤发生发展的重要因素之一^［18］，其涉及多种信号途径的变化，如MAPK/ERK1/2、p38、JNK/以及PI3K/AKT等^［19］。PI3K/AKT信号通路与肿瘤细胞生长、凋亡、转移等密切相关，而ROS通过激活酪氨酸酶磷酸化引起AKT去磷酸化，导致PI3K/AKT信号通路的失活。有研究表明，莪术酮和多西他赛联合治疗通过升高细胞内ROS抑制PI3K/AKT信号通路诱导MDA-MB-231细胞凋亡^［20］。扁蒴藤素联合顺铂是如何调节ROS与PI3K/AKT信号通路在鼻咽癌中的作用需进行深入研究。

本研究旨在探究扁蒴藤素联合顺铂对鼻咽癌HNE-1和CNE-2Z细胞增殖、凋亡的影响及其潜在分子机制，以期为临床治疗鼻咽癌提供潜在的治疗方案和理论依据。

1 材料和方法

1.1 细胞株

人鼻咽癌细胞株HNE-1和CNE-2Z购于中南大学湘雅医学院生物细胞室，由蚌埠医科大学科研中心生化药理实验室冻存。

1.2 药品与试剂

扁蒴藤素、顺铂（MCE），RPMI 1640培养基（Gibco），磷酸盐缓冲液（PBS）、胰酶、1%青-链霉素（Servicebio），胎牛血清（Excell），CCK8（APExBio），RIPA裂解液、BCA定量试剂盒、ROS检测试剂盒（碧云天），Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒（贝博生物），PAGE凝胶快速制备试剂盒（雅酶），Bcl2、Bax和Mcl-1抗体（Proteintech），PARP抗体（Abmart），Cleaved caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT抗体（CST）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

将HNE-1和CNE-2Z细胞置于含10%胎牛血清和1%青-链霉素的RPMI 1640培养基内，培养于37 ℃、5% CO₂的培养箱中。

1.3.2 CCK8法检测细胞存活率

将对数生长期的鼻咽癌HNE-1和CNE-2Z细胞制成密度为7×10⁴/mL的单细胞悬液，接种于96孔培养板，100 µL/孔，培养24 h后吸弃原培养液，加入含不同浓度扁蒴藤素（0、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L）、不同浓度顺铂（0、1、2、4、8、16 μmol/L）、扁蒴藤素（1 μmol/L）或/和顺铂（6 μmol/L）的培养液，同时设阴性对照组和空白对照组，继续培养24 h后，每孔加入10 μL CCK8溶液，置于培养箱中孵育90 min，用酶标仪（波长450 nm）检测每孔吸光度A值，计算细胞存活率。细胞存活率=（A_实验组-A_空白组）/（A_对照组-A_空白组）×100%。使用Graghpad prism10.0计算药物的半数抑制浓度（IC₅₀）。

1.3.3 集落克隆形成实验

取对数生长期的鼻咽癌细胞，以5×10³/孔的密度接种于6孔板，使用扁蒴藤素（0.1 μmol/L）、顺铂（0.6 μmol/L）以及扁蒴藤素（0.1 μmol/L）联合顺铂（0.6 μmol/L）处理 HNE-1和CNE-2Z细胞，继续培养7 d左右，观察到明显的细胞集落形成后终止培养，加入1 mL/孔4%多聚甲醛固定20 min，加入1 mL 0.1%结晶紫染色20 min，双蒸水清洗，室温干燥后用相机拍照，并使用Image J软件对细胞集落进行计数。

1.3.4 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡

取对数生长期的HNE-1和CNE-2Z细胞，以3×10⁵/孔接种于6孔板，待细胞汇合达到80%时，按照实验设计分为对照组、扁蒴藤素（1 μmol/L）组、顺铂（6 μmol/L）组、扁蒴藤素（1 μmol/L）联合顺铂（6 μmol/L）组，继续培养24 h后用不含EDTA的胰酶消化、收集细胞，1000 r/min离心5 min，PBS洗涤细胞2次，弃上清。按照试剂盒说明书进行操作，每组使用400 μL冰浴的Binding Buffer悬浮细胞，再将3 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL PI分别加入细胞中孵育20 min，1 h内用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。

1.3.5 DCFH-DC探针检测ROS水平

取对数生长期的HNE-1和CNE-2Z细胞，以3×10⁵/孔接种于6孔板，细胞密度达到80%时，按照实验设计分为对照组、扁蒴藤素组、顺铂组、扁蒴藤素联合顺铂组，继续培养24 h，收集各组细胞于1.5 mL EP管内，用预冷PBS洗涤2次。根据说明书要求，使用PBS稀释DCFH-DA（1∶1000）溶液，混匀后避光孵育20 min。弃上清液，PBS清洗3次，洗净残余的DCFH-DA染液。使用流式细胞仪检测细胞内ROS水平。

1.3.6 Western blotting检测蛋白表达

取对数生长期的HNE-1和CNE-2Z细胞，以3×10⁵/孔接种于6孔板，实验分为对照组、扁蒴藤素组、顺铂组以及扁蒴藤素联合顺铂组，继续培养24 h后收集细胞，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，提取细胞总蛋白，BCA法测定各组蛋白浓度后加上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min。蛋白上样；10% SDS-PAGE 电泳（80 V，30 min；120 V，100 min）；转膜（300 mA，90 min）至PVDF膜；5%脱脂牛奶室温封闭2 h；一抗室温孵育4 h（或4 ℃过夜）；TBST洗涤3次；二抗室温孵育1 h；TBST洗涤3次；ECL发光试剂盒发光，凝胶成像系统获取图像。

1.4 统计学分析

应用Grapghpad prism 9.0软件对数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，组间数据比较采用LSD-t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 扁蒴藤素和顺铂对鼻咽癌细胞存活率的影响

CCK-8结果显示，扁蒴藤素作用24 h后，以浓度依赖性的方式抑制HNE-1和CNE-2Z细胞的存活率（P<0.05），IC₅₀分别为1.82 μmol/L、2.37 μmol/L（图1A）。顺铂能抑制HNE-1和CNE-2Z细胞的存活率（P<0.01），作用24 h的IC₅₀分别为9.29 μmol/L、14.03 μmol/L（图1B）。根据IC₅₀值，选择0.1 μmol/L扁蒴藤素和0.6 μmol/L顺铂进行集落克隆形成实验，1 μmol/L扁蒴藤素和6 μmol/L顺铂进行其他后续实验。与对照组相比，扁蒴藤素组、顺铂组、扁蒴藤素联合顺铂组均能抑制HNE-1和CNE-2Z细胞的存活率（P<0.05）；扁蒴藤素联合顺铂相较于单用扁蒴藤素或顺铂，更明显抑制细胞的存活率（P<0.01，图1C）。

2.2 扁蒴藤素联合顺铂对鼻咽癌细胞集落形成的影响

集落克隆形成实验结果显示，扁蒴藤素、顺铂、扁蒴藤素联合顺铂均能抑制HNE-1和CNE-2Z细胞的集落形成能力（P<0.05）；与单用扁蒴藤素或顺铂相比，扁蒴藤素联合顺铂对细胞集落形成能力的抑制作用更加明显（P<0.05，图2）。

2.3 扁蒴藤素联合顺铂对鼻咽癌细胞凋亡的影响

Annexin-V FITC/PI双染流式细胞术检测细胞的凋亡情况，结果显示，扁蒴藤素、顺铂、扁蒴藤素联合顺铂均增加HNE-1和CNE-2Z细胞的凋亡率（P<0.01）；与单用扁蒴藤素或顺铂相比，扁蒴藤素联合顺铂明显增加细胞的凋亡率（P<0.01，图3A）。Western blotting结果显示，扁蒴藤素、顺铂、扁蒴藤素联合顺铂均上调Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved PARP和下调Bcl-2、Mcl-1、PARP的蛋白表达（P<0.05）。扁蒴藤素联合顺铂相较于单用扁蒴藤素或顺铂，可显著上调Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved PARP，下调Bcl-2、Mcl-1和PARP的蛋白表达（P<0.05，图3B、C）。

2.4 扁蒴藤素联合顺铂对鼻咽癌细胞内ROS水平的影响

扁蒴藤素组、顺铂组、扁蒴藤素联合顺铂组相较于对照组，均能升高细胞内的ROS水平（P<0.01）；与单用扁蒴藤素或顺铂相比，扁蒴藤素联合顺铂可显著升高细胞内的ROS水平（P<0.01，图4）。

2.5 ROS参与扁蒴藤素联合顺铂对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响

ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）调控细胞内ROS水平结果显示， NAC可部分恢复扁蒴藤素联合顺铂对HNE-1和CNE-2Z细胞增殖的抑制作用（P<0.01，图5A）。NAC抑制扁蒴藤素联合顺铂对HNE-1和CNE-2Z细胞中Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved PARP的上调及Bcl-2、Mcl-1、PARP的下调作用（P<0.05，图5B、C）。

2.6 扁蒴藤素联合顺铂对PI3K/AKT信号通路的影响

与单用扁蒴藤素或顺铂相比，扁蒴藤素联合顺铂明显降低HNE-1和CNE-2Z细胞中的p-PI3K和p-AKT 蛋白表达水平（P<0.05），但PI3K和AKT的表达水平无明显变化（图6A、B）。ROS抑制剂NAC能部分恢复扁蒴藤素联合顺铂对HNE-1和CNE-2Z细胞中p-PI3K和p-AKT的下调（P<0.05，图6C、D）。

3 讨论

天然产物联合化疗药物已广泛应用于癌症、糖尿病、艾滋病等疑难疾病的治疗，在增强药物作用的同时，能够减弱其耐药性或降低不良反应，从而取得更好的疗效^［21］。研究表明，扁蒴藤素在增强肿瘤细胞对化疗药物敏感性方面具有巨大的潜力。扁蒴藤素联合吉西他滨通过Chk1/53BP1介导的DNA损伤增强胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性^［15］；扁蒴藤素联合索拉非尼抑制肝癌细胞的集落形成、侵袭和迁移能力及诱导细胞凋亡，从而增强肝癌细胞对索拉非尼的敏感性^［16］；扁蒴藤素联合顺铂可协同抑制肺癌细胞增殖、诱导细胞周期阻滞和促进细胞凋亡，进而增强肺癌细胞对顺铂的敏感性^［17］。目前，扁蒴藤素作为一种潜在的天然抗肿瘤药物，在鼻咽癌中对顺铂抗肿瘤作用的影响尚未见报道。本研究发现，扁蒴藤素联合顺铂可以显著抑制鼻咽癌细胞HNE-1和CNE-2Z的细胞活力、集落形成能力，促进鼻咽癌细胞凋亡。表明扁蒴藤素可以增强鼻咽癌细胞对顺铂的敏感性。

ROS水平的变化在细胞增殖和凋亡中发挥重要作用，ROS是细胞氧化还原的代谢产物，和正常细胞相比，肿瘤细胞中的ROS水平异常升高^［22］。适量的ROS促进细胞的增殖和存活，高水平的ROS会导致细胞内氧化应激，导致细胞内的DNA损伤、蛋白质和脂质过氧化，从而触发细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用^［23］。因此，维持ROS稳态对细胞的正常生长和存活非常重要。研究表明，染料木素升高ROS将膀胱癌细胞阻滞在G2/M期而抑制细胞增殖，降低ROS水平可部分逆转细胞增殖的抑制作用^［24］。芹菜素和5-氟尿嘧啶通过升高ROS水平诱导结直肠癌细胞的凋亡^［25］。葛根素联合顺铂通过刺激ROS的产生，增加caspase-9、caspase-3以及PARP的裂解，促进细胞色素C的释放诱导细胞凋亡，ROS抑制剂NAC降低ROS水平减弱了葛根素联合顺铂诱导的线粒体途径细胞凋亡^［26］。黄原素通过升高ROS水平抑制胰腺癌细胞增殖和诱导细胞凋亡，NAC可部分逆转这一作用^［27］。本研究中，扁蒴藤素联合顺铂能够显著增加HNE-1和CNE-2Z细胞内ROS产生。为探讨ROS在扁蒴藤素联合顺铂抑制鼻咽癌细胞增殖和诱导细胞凋亡中的作用，我们使用ROS抑制剂NAC处理后，发现NAC能减弱扁蒴藤素联合顺铂诱导的增殖抑制和凋亡作用，表明扁蒴藤素联合顺铂对鼻咽癌细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用依赖于ROS的产生。

PI3K/AKT信号通路在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，当细胞受到抗肿瘤药物、缺氧、氧化应激等刺激时，PI3K/AKT信号通路被激活，PI3K被磷酸化后促进下游效应因子AKT的激活，活化的AKT进一步磷酸化下游蛋白参与调控肿瘤细胞的生长、增殖和凋亡等多种生物学过程^{［28， 29］}。苦参碱联合顺铂通过下调p-PI3K和p-AKT表达水平诱导膀胱癌细胞凋亡^［30］。为探讨扁蒴藤素联合顺铂抑制HNE-1和CNE-2Z细胞增殖和诱导细胞凋亡的潜在分子机制，有研究检测了扁蒴藤素联合顺铂对PI3K和AKT蛋白表达的影响，发现扁蒴藤素联合顺铂能降低HNE-1和CNE-2Z细胞中的p-PI3K和p-AKT表达水平。PI3K/AKT信号通路在调节细胞增殖、凋亡等生物学功能的过程中受到ROS水平的调控^［30］。有研究报道，大黄酸和奥沙利铂的联合通过增加细胞内ROS的产生诱导胰腺癌细胞的凋亡，并且NAC可以恢复AKT的磷酸化水平，表明ROS是PI3K/AKT信号通路失活的上游调节因子^［31］。二甲双胍联合顺铂通过ROS下调结直肠癌细胞中p-PI3K和p-AKT水平诱导细胞凋亡，而NAC可恢复这一作用^［32］。莪术醇联合多西紫杉醇通过PI3K/AKT信号通路触发ROS介导的MDA-MB-468细胞凋亡^［20］。此外，本研究发现扁蒴藤素联合顺铂抑制的p-PI3K和p-AKT水平可被NAC部分恢复，提示扁蒴藤素联合顺铂通过ROS调控PI3K/AKT信号通路以发挥作用。

综上所述，扁蒴藤素能增强鼻咽癌细胞对顺铂的增殖抑制和凋亡诱导作用，其机制可能与ROS介导的PI3K/AKT信号通路失活有关。本研究为扁蒴藤素和顺铂联合在鼻咽癌临床治疗中的应用提供了新的依据。

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