LncRNA FEZF1-AS1通过miR-130a-5p/CCND1轴促进非小细胞肺癌发展的分子机制研究

Overexpression of lncRNA FEZF1-AS1 promotes progression of non-small cell lung cancer via the miR-130a-5p/CCND1 axis

摘要

目的 探讨FEZF1-AS1通过miR-130a-5p/CCND1轴促进非小细胞肺癌（NSCLC）发展的分子机制。 方法 利用TCGA数据库分析FEZF1-AS1在NSCLC中的表达，qRT-PCR检测其在NSCLC癌组织与癌旁组织以及NSCLC细胞系中的表达，并分析其与临床特征的关系。利用数据库预测FEZF1-AS1与hsa-miR-130a-5p的结合位点以及hsa-miR-130a-5p与CCND1的结合位点；应用CCK8、克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验检测FEZF1-AS1、hsa-miR-130a-5p对肺癌细胞系增殖、侵袭、迁移能力的影响；双荧光素酶报告实验验证FEZF1-AS1与hsa-miR-130a-5p以及hsa-miR-130a-5p与CCND1存在结合；将H1299、H358分别分为si-NC组、si-FEZF1-AS1组、si-FEZF1-AS1+NC inhibitor组、si-FEZF1-AS1+hsa-miR-130a-5p inhibitor组，应用Western blot检测CCND1的蛋白表达水平，明确FEZF1-AS1/hsa-miR-130a-5p是否通过ceRNA机制调控了CCND1的表达。 结果 FEZF1-AS1在NSCLC中呈高表达，且在NSCLC癌组织中的表达量明显增高（P<0.05），高表达与NSCLC的淋巴结转移有关，在H1299、H358细胞系中的表达量也显著增高（P<0.05）；敲减FEZF1-AS1降低了NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭能力（P<0.05）；hsa-miR-130a-5p与FEZF1-AS1、CCND1之间存在结合（P<0.05）；hsa-miR-130a-5p影响NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭能力（P<0.05）；si-FEZF1-AS1降低了CCND1蛋白表达，hsa-miR-130a-5p inhibitor逆转了si-FEZF1-AS对CCND1的敲减作用（P<0.05）。 结论 FEZF1-AS1在NSCLC组织中高表达，且与淋巴结转移有关，促进了NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭，并通过miR-130a-5p/CCND1轴促进了非小细胞肺癌的发展。

Abstract

Objective To explore the molecular mechanism by which FEZF1-AS1 overexpression promotes progression of non-small cell lung cancer (NSCLC) via the miR-130a-5p/CCND1 axis. Methods TCGA database was used to analyze FEZF1-AS1 expression levels in NSCLC. FEZF1-AS1 expression was detected by qRT-PCR in clinical specimens of NSCLC tissues and NSCLC cell lines, and its correlation with clinical features of the patients were analyzed. The binding sites of FEZF1-AS1 with hsa-miR-130a-5p and those of hsa-miR-130a-5p with CCND1 were predicted. CCK8 assay, clone formation assay, scratch assay, and Transwell assay were employed to examine the effects of FEZF1-AS1 knockdown and hsa-miR-130a-5p inhibitor on proliferation, invasion, and migration abilities of lung cancer cell lines. Dual luciferase assay was used to verify the binding of FEZF1-AS1 with hsa-miR-130a-5p and the binding of hsa-miR-130a-5p with CCND1. Western blotting was performed to detect the changes in CCND1 protein expression level in H1299 and H358 cells following FEZF1-AS1 knockdown and treatment with hsa-miR-130a-5p inhibitor. Results FEZF1-AS1 was highly expressed in NSCLC tissues in close correlation with lymph node metastasis and also in H1299 and H358 cell lines (all P<0.05). FEZF1-AS1 knockdown obviously reduced proliferation, migration, and invasion abilities of NSCLC cells (P<0.05). Dual luciferase assay confirmed the binding of hsa-miR-130a-5p with FEZF1-AS1 and CCND1 (P<0.05), and hsa-miR-130a-5p inhibitor significantly inhibited proliferation, migration, and invasion of NSCLC cells (P<0.05). FEZF1-AS1 knockdown significantly reduced CCND1 protein expression in NSCLC cells, and this effect was strongly inhibited by treatment with hsa-miR-130a-5p inhibitor (P<0.05). Conclusion FEZF1-AS1 is highly expressed in NSCLC tissue in close correlation with lymph node metastasis to promote cancer progression through the miR-130a-5p/CCND1 axis.

Graphical abstract

关键词

非小细胞肺癌 / 长链非编码RNA / FEZF1-AS1 / miR-130a-5p / CCND1

Key words

non-small cell lung cancer / lncRNA / FEZF1-AS1 / miR-130a-5p / CCND1

肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，根据国际癌症研究机构2020年发布的全球癌症统计数据显示，中国当年新增肺癌患者约82万人，死亡约71.5万人。只有20%的患者经治疗后能存活过5年，不到7%的患者存活超过10年^［1，2］。较差的预后可能是由于对肺癌的发生发展和耐药机制仍不十分清楚。

近年来研究认为非编码RNA（ncRNA）在肿瘤发生发展中起着重要作用并参与耐药^［3］。ncRNA不编码蛋白质序列，其中长度超过200nt的ncRNA被称为长链非编码RNA（LncRNA）。LncRNA具有许多功能，如染色质重塑、竞争性内源性RNA（ceRNA）和自然反义转录物等^［4］，在肿瘤发生的遗传调控、细胞周期、细胞分化、凋亡调控以及生长转移等也发挥重要作用^［5］。相关研究还表明LncRNA在对肿瘤病人诊断、靶向治疗耐药及预后判断也极为重要^［6-8］。在非小细胞肺癌（NSCLC）中也有研究报道LncRNA可以通过海绵化、PI3K/AKT通路等在其发展中发挥重要作用，并参与表皮细胞生长因子受体酪氨酸激酶酶抑制剂（EGFR-TKIs）的耐药^［9，10］。

FEZ家族锌指1反义RNA1（FEZF1-AS1）是一种新的lncRNA，位于7号染色体上，最早由日本科学家通过对21243个全长cDNA测序中发现。FEZF1-AS1在许多癌症中被报道，如结直肠癌^［11］、宫颈癌^［12］等。周丽亚^［13］研究发现FEZF1-AS1在EGFR突变型中晚期肺腺癌表达的阳性率为55.56%（30/54），且表达阳性的患者EGFR-TKI的耐药的发生率高，预后较差。和其他LncRNA一样，FEZF1-AS1也可以通过信号通路和生物过程影响NSCLC细胞的生长、转移和耐药。但目前关于FEZF1-AS1对NSCLC发生的调控机制尚不明确。

为进一步探究FEZF1-AS1在NSCLC中的表达情况，是否通过ceRNA机制调控非小细胞肺癌的增殖、侵袭、迁移等功能促进NSCLC发展，本研究旨在利用生物信息学技术及相关细胞功能学实验，研究FEZF1-AS1在肺癌组织、细胞中的表达水平及影响肺癌细胞生物学功能的具体通路，为FEZF1-AS1将来是否能作为肺癌筛查、诊断及治疗中新的靶点提供依据，也为NSCLC的发生机制和耐药的解决提供新的见解。

1 材料和方法

1.1 病理组织标本

收集蚌埠医学院第一附属医院胸外科2020年9月~2022年4月的33例首次确诊的NSCLC患者的手术标本（包括癌组织及癌旁组织），留取的组织标本液氮储存备用。所有肺癌的诊断均经两名病理科医师确诊，收集标本及临床资料均经患者及家属知情同意，且取得蚌埠医学院第一附属医院伦理会审批同意（审批号：BYYFY-2018KY25）。

1.2 细胞系

非小细胞肺癌细胞系（NCI-H1299、NCI-H358），肺腺癌细胞系（A549、PC-9、NCI-H1975），人支气管上皮细胞系（BEAS-2B）（广州赛库生物技术公司）。所有实验均在蚌埠医科大学第一医院呼吸与危重症学科实验室、呼吸系病临床基础安徽省重点实验室完成。

1.3 引物设计

FEZF1-AS1、GAPDH引物由上海生工合成，FEZF1-AS1引物序列：F：5'-TTAGGAGGCTTGTTCTGTGT-3'，R：5'-GCGCAGGTACTTAAGAAAGA-3'；GAPDH引物序列：F：5'-ACAGTCAGCCGCATCTTCT-3'，R：5'-GACA AGCTTCCCGTTCTCAG-3'。小干扰RNA及其阴性对照由上海吉玛基因提供，hsa-miR-130a-5p、其余miRNA以及相关阴性对照引物由上海新贝提供，hsa-miR-130a-5p mimics、hsa-miR-130a-5p inhibitor及其阴性对照引物由上海汉恒提供。

1.4 实验方法

1.4.1 qRT-PCR检测FEZF1-AS1与hsa-miR-130a-5p表达

Trizol（life technologies）法提取NSCLC癌组织及癌旁组织和细胞系中总RNA，逆转录使用逆转录试剂盒（ABclonal），按说明书进行，加入引物，后按qPCR MIX试剂盒（ABclonal）说明书步骤进行扩增，PCR参数按说明书进行设置。扩增后FEZF1-AS1与hsa-miR-130a-5p表达量应用2^-ΔΔCt法进行分析。

1.4.2 细胞培养与传代

于37 ℃ 5%CO₂培养箱环境中，应用1640细胞培养基、DMEM细胞培养基（Gibco），进行细胞培养，密度70%~80%后，应用胰酶（Gibco）收取培养细胞进行实验。

1.4.3 肺癌细胞系进行FEZF1-AS1与hsa-miR-130a-5p转染

将肺癌细胞系在10 cm培养皿中培养至密度70%以上，于6孔板进行铺板，按照siRNA（上海吉玛基因）、hsa-miR-130a-5p inhibitor、hsa-miR-130a-5p mimics（上海汉恒生物）说明书，取2.5 µL Lipofecta mine 2000（Thermo Fisher Scientific）、2.5 µL siRNA、hsa-miR-130a-5p mimics或hsa-miR-130a-5p inhibitor或hsa-miR-130a-5p mimics与Lipofecta mine 2000以及 125 µLOpti-MEM无血清培养基（Gibco）进行转染。

1.4.4 CCK-8细胞增殖实验

将转染后的细胞重悬为20 000 mL的细胞悬液种于96孔板内，放入培养箱，在指定时间将孔板内培养基吸出，将CCK-8试剂（Biosharp）与培养基按比例在加样槽中混合后将孔板放入培养箱孵育，后取出使用酶标仪测量在450 nm处吸光度A，记录结果进行分析（此处取的指定时间为：24、48、72、96 h）。

1.4.5 细胞克隆形成实验

将转染后的细胞重悬为1000 mL的细胞悬液，取6孔板，在每孔内加入2 mL细胞悬液，放入培养箱培养14 d左右取出，清洗、多聚甲醛进行固定、结晶紫（Solarbio）染色，清洗干净后拍照分析。

1.4.6 细胞划痕实验

将转染后的细胞，放入培养箱培养，待转染细胞密度达80%以上即可。在6孔板内按三等分划出3条较笔直竖线，吸除板内培养基；倒扣在台面，用记号笔在板底按三等分划出3条较笔直横线，用PBS缓冲液清洗划痕过后的孔2次，每孔加入2 mL 1640基础培养基，采集0 h时划痕图像，并记录采集点，放入培养箱培养24 h或48 h后，采集24 h或48 h时划痕图像，保存并进行结果分析。

1.4.7 Transwell实验

将分装的基质胶放于4 ℃冰箱融化，取出小室，将基质胶（Corning）与1640培养基按1∶8或1∶9进行稀释，每个小室内加入100 µL，放入37 ℃ CO₂培养箱孵育1~2 h，待基质胶凝固后，向24孔板内加入含有15%胎牛血清（LONSA SCIENCE SRL）1640培养基800 µL，将转染好的细胞从培养箱中取出，用1 mL 1640完全培养基重悬为200 000/mL的细胞悬液，取200 µL细胞种于小室内；放入37 ℃ CO₂培养箱培养24 h后，取出孔板，将24孔板内培养基吸除，在每孔内800 µL 4%多聚甲醛，将小室放于其中，进行细胞固定15 min，清洗小室2次，每孔加入800 µL 1%结晶紫染色15 min；清洗小室1次，将小室倒扣于桌面晾干，拍照记录，分析数据。

1.4.8 细胞蛋白提取

将培养好的细胞从培养箱中取出，根据细胞量加入相应RIPA强效蛋白裂解液（碧云天），置于冰上裂解30 min；12 000 g 20 min 4 ℃离心，吸取上层清亮液体至EP管内，弃去底部沉淀，向EP管内加入5×蛋白Loading buffer（碧云天），使用恒温金属加热器加热100 ℃ 10 min；制备好的蛋白可立即使用，也可放-80 ℃冰箱储存。

1.4.9 蛋白浓度测定

在96孔板中分别加入0、1、2、4、8、12、16、20 µL稀释至0.5 mg/ mL的蛋白标准溶液，用标准品稀释液补足到20 µL，制成浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的标准品。加入20 µL待测定蛋白样品在96孔板中，其余空孔加入200 µL BCA工作液，37 ℃ 5% CO₂培养箱孵育30 min，将96孔板放入酶标仪，在540 nm处测量出A值，收集数据，根据公式绘制曲线。

1.4.10 Western blotting实验

配制不同浓度上层胶和下层胶，将凝胶（碧云天）放入垂直电泳槽，倒入电泳液，加入样品和预染蛋白Marker（麦客生物），电泳30 min左右，将配制好的快速转膜液放冰箱预冷，剪取适合大小PVDF膜（Merck Millipore），用甲醇激活后，覆盖于胶块表面，转膜20~30 min，将转好的膜放于水平摇床，将快速封闭液倒入清洗盒，于水平摇床上，室温轻晃20~30 min，稀释液配制适量浓度一抗（成都正能生物），放入预冷的抗体盒中，将清洗好的PVDF膜转移至盒中，放4 ℃冰箱过夜，将PVDF膜夹出，放清洗盒内，于水平摇床，用1×PBST清洗，配制适当浓度二抗（成都正能生物），将二抗倒入清洗盒内，于水平摇床室温轻晃1~2 h，用1×PBST清洗5 min，配制ECL发光液（Abbkine），将PVDF膜浸泡在配制好的ECL发光液中30 s，在显影仪内显影，收集结果进行分析。

1.4.11 荧光素酶报告实验

将转染后的细胞取出，去除培养基，清洗2次，加入适量的1×Lysis Buffer（上海汉恒），反复吹打孔内细胞，于水平摇床上，室温、轻晃孵育15 min，充分裂解，将孔内液体转移至1.5 mL EP管中，4 ℃ 12 000 r/min离心1 min，取上清备用。取20 µL液体，加入100 µL Luciferase Reaction Reagent（上海汉恒），混匀后于酶标仪中检测fLuc信号，然后加入100 µL Luciferase Reaction Reagent II（上海汉恒），混匀后于酶标仪中检测rLuc信号，收集数据进行分析。

1.5 生物信息学分析

运用Sangerbox数据分析平台（http：//past20.sangerbox.com/Index）分析FEZF1-AS1在泛癌中的表达；运用仙桃学术（https：//www.xiantao.love/）分析TCGA数据库中FEZF1-AS1在配对与非配对的癌与正常肺组织中表达情况。利用相关数据库预测FEZF1-AS1与hsa-miR-130a-5p的结合位点以及hsa-miR-130a-5p与CCND1的结合位点。

1.6 统计学分析

采用SPSS 26.0和Graphpad 8.0软件进行统计分析与作图，计数资料以n（%）表示，组间比较采用χ²检验；计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验与单因素方差分析；P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FEZF1-AS1在NSCLC中的表达及与临床特征的关系

利用TCGA数据库发现FEZF1-AS1在泛癌中的表达增高（图1A），在NSCLC中也呈现高表达；在非配对与配对的NSCLC癌组织中的表达量显著高于正常肺组织（P<0.001，图1B）。检测33例NSCLC患者的肺癌组织、癌旁组织及5种肺癌细胞系中FEZF1-AS1的表达情况，结果显示在癌组织的表达量显著高于癌旁组织（P<0.0001，图1C）。根据FEZF1-AS1的表达情况，按照癌/癌旁表达量的中间值3.9作为临界值，将其分为高表达组与低表达组，>3.9为高表达组（16例），≤3.9为低表达组（17例），对其临床特征进行分析。结果显示，在高表达组中，FEZF1-AS1的表达与NSCLC患者的年龄、肿瘤大小、肿瘤TNM分期均无相关性（P>0.05），而与性别、吸烟史及淋巴结转移有关（P<0.05，表1）。在肺癌细胞系中FEZF1-AS1的表达均增高，其中在H1299、H358、PC9细胞的表达显著高于BEAS-2B（P<0.0001，图1D）。因此后续实验选用H1299、H358细胞进行。

2.2 FEZF1-AS1对非小细胞肺癌的增殖、迁移、侵袭的影响

构建FEZF1-AS1的荧光小干扰RNA（si-FEZF1-AS1），对H1299、H358细胞进行转染（图2A），转染si-FEZF1-AS1后H1299、H358中FEZF1-AS1表达显著降低（P<0.0001，图2B）；将H1299、H358分为si-FEZF1-AS1组与si-NC组，两组吸光度在72、96 h有统计学意义差异（P<0.0001，图2C）；克隆形成实验结果显示，克隆斑形成数量si-FEZF1-AS1组显著低于si-NC组（P<0.05，图2D）。

划痕实验结果显示，si-FEZF1-AS1组的划痕愈合率显著低于si-NC组（P<0.05，图2E）；si-FEZF1-AS1组的迁移细胞数量显著低于si-NC组（P<0.05，图2F）。Transwell实验结果显示，si-FEZF1-AS1组的侵袭细胞数量显著低于si-NC组（P<0.01，图2G）。

2.3 FEZF1-AS1与hsa-miR-130a-5p存在结合

利用miRbase、targetscan数据库预测发现，FEZF1-AS1与hsa-miR-130a-5p存在3个潜在结合位点（图3A），荧光素酶报告实验结果显示，FEZF1-AS1野生型质粒共转染hsa-miR-130a-5p mimics组的荧光素酶活性显著低于NC mimics组（P<0.001，图3B），而FEZF1-AS1突变型质粒共转染hsa-miR-130a-5p mimics与NC mimics后未出现差异。

2.4 hsa-miR-130a-5p对非小细胞肺癌的增殖、迁移、侵袭的影响

H1299与H358中si-FEZF1-AS1+hsa-miR-130a-5p inhibitor组的hsa-miR-130a-5p的表达量显著低于si-FEZF1-AS1+NC inhibitor（P<0.0001，图4A）。CKK-8实验结果显示，H1299与H358中si-FEZF1-AS1+hsa-miR-130a-5p inhibitor组的吸光度显著高于si-FEZF1-AS1+NC inhibitor（P<0.001，图4B）。Transwell实验结果显示，si-FEZF1-AS1+hsa-miR-130a-5p inhibitor组的迁移细胞数显著高于si-FEZF1-AS1+NC inhibitor（P<0.05，图4C）；si-FEZF1-AS1+hsa-miR-130a-5p inhibitor组的侵袭细胞数显著高于si-FEZF1-AS1+NC inhibitor（P<0.05，图4D）。

2.5 hsa-miR-130a-5p与CCND1存在结合

两组细胞转录组测序结果显示，FEZF1-AS1敲减下降的mRNA有4165个（图5A），利用miRDB和ENCORI数据库预测了与hsa-miR-130a-5p结合的靶基因，分别得到940个与1875个靶基因，选取转录组测序中差异度最大的50个mRNA，与之取交集得到了2个mRNA（图5B），通过qRT-PCR发现发现si-FEZF1-AS1组较si-NC组CCND1的表达量显著降低（P<0.0001，图5C、D）。利用miRbase、targetscan数据库对hsa-miR-130a-5p和CCND1的结合位点进行了预测，最终发现了7个结合位点，此处展示3个（图5E），荧光素酶报告实验发现CCND1-3UTR野生型质粒共转染hsa-miR-130a-5p mimics组的荧光素酶活性显著低于NC mimics组（P<0.001，图5F），而CCND1-3UTR突变型质粒共转染hsa-miR-130a-5p mimics与NC mimics后未出现差异。

2.6 FEZF1-AS1/hsa-miR-130a-5p通过ceRNA机制调控CCND1的表达

Western blot结果显示，si-FEZF1-AS1组较si-NC组CCND1的蛋白表达水平显著降低（P<0.0001，图6A、B），而si-FEZF1-AS1+ hsa-miR-130a-5p inhibitor组相较于si-FEZF1-AS1+NC inhibitor组CCND1的蛋白表达水平显著增高（P<0.05，图6C、D）。

3 讨论

以前对RNA的研究主要集中于编码RNA，但最近ncRNA亦被证明在肿瘤的发生发展中起到了重要的作用，包括LncRNA、CircRNA、miRNA、假基因等，其中LncRNA具备更多的功能，如结合转录因子调节下游基因的表达、产生内源siRNA、与特定蛋白质结合以调节其活性、充当miRNA海绵防止mRNA降解等^［14］。已有研究表明，LncRNA对肿瘤增殖、迁移、侵袭、EMT、血管生成、耐药及免疫微环境等均有影响，在肿瘤的发生发展中具有重要作用^［15-17］。

FEZF1-AS1作为一种新的LncRNA，在多种肿瘤中均出现差异化表达，如结直肠癌^［11］、宫颈癌^［12］等，在NSCLC中仅有少量研究。利用生物信息学技术筛查肿瘤潜在的诊疗靶点、结合位点，已成为当代医学重要的分支。本研究利用TCGA数据库分析发现FEZF1-AS1在NSCLC组织中高表达。为了验证数据库的预测，课题组应用qRT-PCR检测33例NSCLC患者的肺癌组织、癌旁组织中FEZF1-AS1的表达情况，结果显示：在癌组织中表达量增高，并且发现FEZF1-AS1的高表达与淋巴结转移有关。这与周丽亚^［13］的研究结果不完全相同，但她的研究还显示在表达阳性EGFR突变型中晚期肺腺癌患者耐药的发生率高，预后较差。这与国内其他学者的研究结果相似^{［12， 18］}。究其原因可能是FEZF1-AS1通过促进上皮-间充质转换通路（EMT）、抑制p57抑癌基因、提高磷酸化AKT（pAKT）表达水平等途径促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及耐药过程，如EGFR-TKIs耐药^［10］。因此明确FEZF1-AS1在NSCLC中的发生机制，对临床预测NSCLC的预后及EGFR-TKIs耐药具有重要价值。

应用qRT-PCR筛选出高表达FEZF1-AS1的NSCLC细胞系H1299、H358，构建si-FEZF1-AS1，通过CCK-8、克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验发现：敲低FEZF1-AS1后降低了NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭功能。因此认为FEZF1-AS1促进了非小细胞肺癌的增殖、迁移、侵袭能力。Hui等^［19］研究也发现敲低FEZF1-AS1可以下调HMGA2的表达，抑制胃癌细胞的体内致瘤能力，并且调节胃癌细胞的生长。

利用Starbase数据库预测并挑选出与FEZF1-AS1结合的miRNA，发现敲减FEZF1-AS1后hsa-miR-130a-5p的表达量显著增高。细胞功能学实验也证实hsa-miR-130a-5p影响NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭功能。通过荧光素酶报告实验显示：FEZF1-AS1野生型质粒共转染hsa-miR-130a-5p mimics组的荧光素酶活性显著降低，而FEZF1-AS1突变型质粒共转染hsa-miR-130a-5p mimics与NC mimics后未出现差异，这表明FEZF1-AS1与hsa-miR-130a-5p存在结合位点。接着通过CCK-8、Transwell实验发现hsa-miR-130a-5p inhibitor能够逆转si-FEZF1-AS1对肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭功能的影响，以上结果表明FEZF1-AS1与hsa-miR-130a-5p存在相互关系。因此认为FEZF1-AS1可以通过hsa-miR-130a-5p调控其在肺癌发生中的作用。

CCND1也被称为细胞周期蛋白D1^［20］，在正常情况下，CCND1与CDK4或CDK6形成复合物，这对于G1/S细胞周期转换至关重要。它被归类为癌基因，并已被证明可以促进血管生成，肿瘤细胞增殖和对放化疗的耐药性。此外，在没有CDK的情况下，CCND1可以直接与核受体结合，调节细胞增殖、生长和分化等功能^［21］。Sun等^［22］研究发现USP10可以与CCND1结合并阻止其经历K48连接的多泛素化，从而增加CCND1的稳定性并促进胶质母细胞瘤的增殖和存活。Chen等^［23］提出MicroRNA-584通过靶向CCND1抑制胰腺癌中的细胞增殖和侵袭。Hao等^［24］认为MicroRNA-195可以通过下调CDC42/CCND1途径从而抑制上皮性卵巢癌中的细胞增殖、迁移和侵袭功能。Liu等^［25］证明LY2874455和阿贝西利逆转FGF3/4/19/CCND1扩增介导的NSCLC吉非替尼耐药，以上报道显示CCND1在多种肿瘤中发挥了重要作用。

因此课题组利用miRDB和ENCORI数据库预测了与hsa-miR-130a-5p结合的靶基因，利用miRbase、targetscan数据库预测hsa-miR-130a-5p和CCND1的结合位点，进行荧光素酶报告实验，结果显示：CCND1-3UTR野生型质粒共转染hsa-miR-130a-5p mimics组的荧光素酶活性显著降低，而CCND1-3UTR突变型质粒共转染hsa-miR-130a-5p mimics与NC mimics后未出现差异，这表明CCND1与hsa-miR-130a-5p存在结合，且敲低FEZF1-AS1会使CCND1的表达降低，hsa-miR-130a-5p inhibitor能够逆转FEZF1-AS1对CCND1蛋白水平的敲减作用。因此认为CCND1可以通过ceRNA机制进行调控，且FEZF1-AS1通过miR-130a-5p/CCND1轴促进了NSCLC的发展，此项研究发现尚属首次。Chen等^［26］研究发现FEZF1-AS1通过靶向的miR-4497/GBX2轴促进了喉鳞状细胞癌细胞的迁移、侵袭功能。Xie等^［27］研究发现FEZF1-AS1通过miR-632/FAM83A轴可以调节体内、外直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭。因此认为FEZF1-AS1通过ceRNA调控肿瘤的发生机制及其复杂。

本研究证实了FEZF1–AS1在NSCLC组织中高表达，与NSCLC淋巴结转移有关，促进了NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭，并通过miR-130a-5p/CCND1轴促进了非小细胞肺癌的发展。但本研究仍有不足之处：（1）临床样本较少，且多为早期病例；（2）在NSCLC发生中，FEZF1-AS1及miR-130a-5p/CCND1的上下游是否存在其他的调控机制尚需进一步研究；（3）未来是否能找到有效的作用靶点、克服靶向耐药、能否真正在肺癌的诊断及治疗中产生作用，这还需要我们进一步的探索。

参考文献

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