副干酪乳杆菌TK1501后生元的制备及对幽门螺旋杆菌的抑制作用

Preparation of Lactobacillus paracei TK1501 postbiotic and its inhibitory effect against Helicobacter pylori infection in mice

摘要

目的 对副干酪乳杆菌（L. paracasei TK1501）发酵大豆产物中的后生元进行分离提取和体内外抑菌活性进行研究，评估该后生元在治疗幽门螺旋杆菌（Hp）感染的作用。 方法 L. paracasei TK1501在无氧密闭的环境内以37 ℃、固态发酵参数中料水比1∶1.5，接种量5×10⁷ CFU/mL，培养发酵32 h后，通过大孔树脂XAD-16N吸附法、阳离子交换色谱法、高效液相色谱法分离纯化，对L. paracasei TK1501后生元进行稳定性及抗菌效果分析。将50只C57雄性小鼠随机分为空白组、模型组、阴性对照组、低剂量组（0.02 mL/只）和高剂量组（0.1 mL/只），10只/组，连续灌胃4周。取血清观察胃部炎症因子TNF-α、IL-1β表达水平变化，取小鼠胃组织进行HE染色。 结果 L. paracasei TK1501后生元易被蛋白酶降解，热稳定性好，对酸碱、有机溶剂等不利因素有较好的耐受性（P<0.05）；在体外试验中，对金黄色葡萄球菌、Hp等均有较好的杀灭作用；在动物实验中，与模型组相比，L. paracasei TK1501后生元高剂量组明显改善Hp感染（P<0.05），胃部炎症因子TNF-α、IL-1β表达水平变化明显下降（P<0.05）。 结论 L. paracasei TK1501后生元对Hp、金黄色葡萄球菌等具有较好的抑制和杀灭效果，而在相同条件下对肠道中的正常菌群则无明显影响。

Abstract

Objective To prepare a postbiotic using soybean fermentation product of Lactobacillus paracasei TK1501 and evaluate its inhibitory effect against Helicobacter pylori (Hp) infection in mice. Methods L. paracasei TK1501 was cultured for 32 h at 37 ℃ in an anaerobic condition for solid substrate fermentation with a solid to water ratio of 1:1.5 in the substrate and an inoculation density of 5×10⁷ CFU/mL. The postbiotic was isolated and purified using macroporous resin XAD-16N adsorption, cation exchange chromatography and HPLC, and its stability and antibacterial activity were assessed. The inhibitory effect of this postbiotic against Hp infection was evaluated in a mouse model with gastric mucosal Hp infection, which were treated with the postbiotic via gavage for 4 weeks at the dose of 0.02 or 0.1 mL. Serum levels of TNF-α and IL-1β of the mice were analyzed after the treatments, and gastric tissues of the mice were collected for HE staining. Results L. paracasei TK1501 postbiotic could be easily degraded by protease and had good thermal stability and tolerance to exposures to acid, base, and organic solvents. In the in vitro experiment, the postbiotic showed strong inhibitory effects in bacterial cultures of Staphylococcus aureus, Hp and other common pathogenic bacteria without obviously affecting the resident bacteria in the digestive tract. In the mouse models, treatment with the postbiotic at the dose of 0.1 mL significantly alleviated Hp infection and lowered the serum levels of TNF-α and IL-1β of the mice. Conclusion L. paracasei TK1501 postbiotic has strong inhibitory effects on Hp and Staphylococcus aureus but not on normal intestinal flora in mice.

Graphical abstract

关键词

副干酪乳杆菌TK1501 / 分离 / 抗幽门螺旋杆菌

Key words

L. paracasei TK1501 / isolation / Helicobacter pylori infection

幽门螺旋杆菌（Hp）为革兰氏阴性菌，常常定居在胃部和十二指肠黏膜上，Hp感染被认为是胃病的主要原因之一^{［1， 2］}。被Hp感染后，通过中和胃酸和其他机制使自身能够存活，附着于胃黏膜上，导致慢性胃炎，长期感染可能会导致胃酸分泌异常，胃黏膜受损，进而引发消化性溃疡 ^［3-6］。虽然大多数Hp感染者不会发展为胃癌，但持续的感染可增加发展为胃癌的风险^［7，8］。据报道，全球Hp的感染率约为48.5%，我国平均感染率为55.8%^［9］。目前Hp的治疗方法主要有四联抗生素疗法和三联抗生素疗法^［10-12］，但抗生素的大量使用会导致Hp整体耐药性上升，愈后再感染率升高^［13］。大量服用抗生素会导致人体正常菌落失衡，腹泻、恶心和腹胀等副作用 ^{［14，15］}，甚至引起其它肠胃疾病的发生^［16］。因此，需寻找一种新型治疗Hp感染的方法，而益生菌及其产品以其温和、安全、高效等特性已成为目前替代抗生素疗法的一种有效途径。

大豆含有多种人体必需的营养物，如脂肪、钙、磷、铁和维生素等，在发酵过程中能够通过微生物转化为生物活性化合物，这些物质具有抗炎效果^{［17， 18］}。L. paracasei作为一种益生菌，具有促进机体微生物菌群的平衡、促进肠道蠕动、增强体质等功效^［19］。已有研究证明，服用L. paracasei发酵的灭活产品有改善肠道微生物紊乱、抗炎症、促进肠道有益菌生长等功效，并证实L. paracasei在发酵过程中产生的某种活性成份对缓解胃肠道疾病有一定的效果^{［20， 21］}。但目前，针对利用L. paracasei发酵大豆产物中抗菌肽开发尚无报道。本研究将L. paracasei TK1501的大豆发酵产物经高温灭活后，对发酵产物中的后生元进行分离提取，并测试后生元对不同菌株的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与动物

L. paracasei TK1501、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、乳杆菌、大肠杆菌、拟气杆菌、梭菌、变形杆菌、葡萄球菌、链球菌以及对照菌藤黄微球菌（Micrococcus luteus） （天津科技大学）；Hp、空肠弯曲杆菌、产气荚膜杆菌、肠炎沙门氏菌（英格尔检测认证集团）。选用SPF级C57雄性小鼠50只，8~10周，体质量40~48 g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供［动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010］。所有小鼠在动物实验中心饲养，鼠房温度22±2 ℃，湿度40%~60%，明暗循环12 h，自由饮水饮食，定期清洗鼠笼，适应5 d后开始实验。本研究动物实验经易生源基因科技（天津）有限公司动物伦理委员会批准（审批号：YSY-DWLL-2022247）。

1.1.2 试剂耗材

甲醇、乙腈、无水乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂均为色谱纯（北京化工厂）；大孔吸附树脂XAD-16N、阳离子交换填料SKI-20（粒径50~75 µm）、C18反相硅胶色谱填料SKR-20（粒径50~75 µm）（山东博隆生物科技有限公司）；BHI培养基（青岛海博）；胎牛血清（四季青生物科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 L. paracasei TK1501的培养和发酵

1.2.1.1　菌株培养

将菌株按1%的接种量接种于活化培养基中，37 ℃密闭静置培养24 h，得到一级种子液，将一级种子按1%的接种量接种于活化培养基中，37 ℃静置密闭培养24 h，得到二级种子液。

1.2.1.2　发酵及干燥

将活化好的种子液，接种到固态发酵培养基大豆粉中，固态发酵中料水比为1∶1.5，接种量5×10⁷ CFU/mL，发酵24 h，将L. paracasei TK1501的发酵大豆产物进行烘干，烘干温度为55±2 ℃，获得L. paracasei TK1501后生元粉，用于后续研究。

1.2.2 测活平板的制备

1.2.2.1　菌悬液的制备

分别取枯草芽孢杆菌、M. luteus、大肠杆菌的新鲜培养物0.1 mL，并接种于50/500 mL三角瓶的LB液体培养基内，在37 ℃培养箱中培养12 h，离心，弃上清，加入足量无菌的生理盐水使沉淀物重悬浮， 离心， 重复洗涤3次， 弃去洗液，最后重新悬浮于25 mL的灭菌生理盐水中，4 ℃保存备用。

1.2.2.2　双层鉴定板的制备

在无菌平皿中倒入10 mL加热融化的素琼脂（2%），待其冷却凝固后，取鉴定培养基加热融化，冷却至45~50 ℃，加入适量的菌悬液，摇匀。每个双碟加入10 mL含菌培养基， 均匀摊布， 放置于水平操作台上冷却， 待培养基凝固后，4 ℃保存备用。

1.2.3 L. paracasei TK1501后生元的提取分离和活性分析

称取0.5 g经低温粉碎后的TK1501后生元粉8份，分别加入甲醇、乙醇、乙腈、水、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、三氯甲烷各1 mL，对L. paracasei TK1501 后生元进行浸提，混匀后，超声5 min，5000 r/min离心5 min。取上清20 µL并将其加入到直径5 mm的圆形滤纸片上，于通风橱内吹干后，将这些滤纸片分别贴到含有3种指示菌（枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、M. luteus）的测活平板上，并于培养箱内37 ℃培养12 h，观察不同浸提物对3种指示菌的抑制活性。

大孔吸附层析：称取适量XAD-16N大孔吸附树脂进行预处理，在无水乙醇中浸泡24 h，使其充分溶胀，去除杂质，用超纯水冲洗至无明显乙醇味。采用湿法装柱^［22］至柱体积的2/3，用超纯水以5 mL/min流速平衡柱子，将经低温粉碎后的TK1501发酵产物与纯净水按1∶3混匀，离心取上清液，将上清液以4 mL/min的流速流过XAD-16N大孔吸附树脂柱，用1倍柱体积的超纯水洗脱未吸附杂质，再依次用2倍柱体积的10%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇以2 mL/min 的流速洗脱大孔树脂上吸附的活性物质，并收集各梯度的洗脱液。采用滤纸片法进行活性测定，每个滤纸片点样20 μL各梯度的洗脱液，等风干后用镊子夹至双层鉴定板，以M. luteus作为指示菌，各平行3组进行测活。

阳离子交换法：从XAD-16N大孔吸附树脂中粗分离获得的活性部分进行阳离子交换，将阳离子交换填料SKI-20（粒径50~75 µm）预处理后进行湿法装柱，用超纯水将层析柱内的保存液冲洗干净，用缓冲液（20 mmol/L乙酸钠，pH4.0）继续冲3~5个柱体积来平衡层析柱。待平衡后上样品，用缓冲液冲洗掉柱子上未结合杂蛋白，然后用不同梯度的洗脱液进行洗脱：20 mmol/L乙酸钠+0.2 mol/L氯化钠、20 mmol/L乙酸钠+0.5 mol/L氯化钠、20 mmol/L乙酸钠+1.0 mol/L氯化钠，收集各梯度的洗脱液，检测方法如上所述。

1.2.4 L. paracasei TK1501后生元HPLC检测及稳定性分析

1.2.4.1　HPLC检测条件

将大孔吸附层析20%乙醇洗脱液和阳离子交换层析20 mmol/L乙酸钠+0.2 mol/L氯化钠洗脱液经预处理后置于4 ℃待用，用流动相A（100%乙腈+0.05%TFA）平衡C₁₈反相色谱柱1 h，直至基线走平。设置方法，进样后，将流动相A和流动相B（100%超纯水+0.05%TFA）如表1进行设置，设定进样30 μL预处理后的样品，紫外检测波长为280 nm，进行梯度洗脱。

1.2.4.2　 L. paracasei TK1501后生元的稳定性分析

将浸提、冻干后的L. paracasei TK1501后生元粉与水1∶2进行溶解，离心取上清液进行试验。首先探究L. paracasei TK1501后生元对酶的敏感性，用1 mg/mL的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、和α-糜蛋白酶处理后生元，采用牛津杯-双层平板鉴定法，以M. luteus作为指示菌，在无菌环境下，将牛津杯轻放于双层鉴定板，每个牛津杯点样100 μL待测样品，各平行3组进行测活；探究L. paracasei TK1501后生元的热稳定性，在试验中，在50 ℃水浴预处理后，再用60、70、80、90、100 ℃分别水浴处理10 min，等冷却至室温，检测方法同上；探究L. paracasei TK1501后生元对酸碱耐受性，在试验中，pH值4.0~9.0，上清液与各梯度pH液混合，静置10 min，再将pH调节至5.0，检测方法同上。

1.2.5 L. paracasei TK1501后生元的抗菌试验

取金黄色葡萄球菌、Hp、肠炎沙门氏菌、空肠弯曲杆菌、产气荚膜杆菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、乳杆菌、大肠杆菌、拟气杆菌、梭菌、变形杆菌、葡萄球菌、链球菌24 h斜面培养物用PBS（0.03 mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2~7.4）洗下，稀释至约5.0×10⁵ CFU/mL~4.5×10⁶ CFU/mL菌悬液备用。取无菌试管，先加入5.0 mL L. paracasei TK1501后生元，置20 ℃左右水浴中5 min后，再加入0.1 mL上述试验菌悬液，迅速混匀并计时10 min。待试验菌与L. paracasei TK1501后生元相互作用后，分别吸取1.0 mL试验菌与后生元混合液接种2个平皿，倾注培养基。同时用PBS代替L. paracasei TK1501后生元，进行平行试验，作为阳性对照。阳性对照回收菌落数在1.0×10⁴ CFU/mL~9.0×10⁴ CFU/mL。取同批次PBS、培养基作阴性对照，所有试验样本和对照样本均在37±1 ℃培养，细菌繁殖体培养48 h，观察最终结果；试验重复3次，计算抑菌率。

\mathrm{抑菌}\mathrm{率}=\frac{\mathrm{阳性}\mathrm{对照}\mathrm{组回}\mathrm{收菌}\mathrm{量}-\mathrm{试验}\mathrm{组回}\mathrm{收菌}\mathrm{量}}{\mathrm{阳性}\mathrm{对照}\mathrm{组回}\mathrm{收菌}\mathrm{量}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

1.2.6 动物模型的建立与分组

将50只雄性小鼠随机分为空白组、模型组及3个实验组，10只/组。空白组小鼠灌胃0.3 mL生理盐水（1次/d ），模型组和实验组小鼠用抗生素混合液灌胃，0.3 mL/只，1次/ d，共3 d，清除所有细菌。第4天起，小鼠每次灌胃Hp前禁食24 h，灌胃无菌3% NaHCO₃ 0.3 mL/只，中和胃酸，20 min后灌胃制备的Hp菌液，0.5 mL/只，隔日1次，共3次；于末次灌胃2周后随机选取3只小鼠，取胃组织分别进行细菌培养及组织学检查，观察小鼠感染情况。

小鼠分组建模成功后将其随机分为模型组和3个实验组，模型组灌胃生理盐水，灌胃剂量0.3 mL/只，1次/d，连续灌胃4周；实验1组为阴性对照组，灌胃20%的酒精，灌胃剂量为0.1 mL/只，1次/d，连续灌胃4周；实验2组为低剂量组，灌胃L. paracasei TK1501后生元，灌胃剂量0.02 mL/只，1次/d，连续灌胃4周；实验3组为高剂量组，灌胃L. paracasei TK1501后生元，灌胃剂量为0.1 mL/只，1次/d，连续灌胃4周。

小鼠标本的收集与处理脱臼处死后，取胃部血液，3500 r/min离心10 min分离制备上层血清。摘除小鼠胃组织，用生理盐水进行漂洗去除表面血液，并做胃组织切片HE染色。一般形态观察在实验期间，观察小鼠的体质量、皮毛状态、粪便等情况。

1.2.7 小鼠胃部炎症因子及胃黏膜Hp的检测

取小鼠胃部血液，室温静置1 h，3200 r/min离心30 min后收集上清液，参照试剂盒说明书操作检测胃部血清炎症因子IL-1β和TNF-α的含量。

通过胃黏膜Hp定量培养检测胃黏膜中Hp的存在，在无菌环境中取得不同组别小鼠胃黏膜，制成匀浆，接种到血琼脂平板培养基，置于37 ℃恒温箱内培养72 h，形成菌落后进行形态观察并做快速脲酶试验。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，计量数据以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组比较采用单因素ANOVA检验。P<0.05为差异具有统计学意义。所有实验均独立重复3次。

2 结果

2.1 L. paracasei TK1501后生元的预处理及初步活性分析

对L. paracasei TK1501后生元浸提结果显示：只有水浸提液中存在抗菌活性物质，并且该物质仅对M. luteus具有抑制作用，对枯草芽孢杆菌以及大肠杆菌则未表现出抑制或杀灭作用，因此在后续分离提取过程中，主要以M. luteus作为指示菌。根据L. paracasei TK1501后生元的特性，推测可能为多肽类或氨基糖苷类代谢物，分别采用不同种类的蛋白酶对TK1501后生元验证（表2）。

L.paracasei TK1501后生元在不同的蛋白酶处理后有适度的下降（图1），但受胃蛋白酶影响较小，易被蛋白酶K以及消化道中的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和α-糜蛋白酶所降解。

2.2 L. paracasei TK1501后生元的分离提取和HPLC分析

2.2.1 XAD-16N大孔树脂洗脱液的抗菌活性

A1、A2、A3为上清液过大孔吸附层析柱后的流出液，无明显抑菌圈，上清液中的活性物质已被大孔吸附树脂吸附，A4为10%乙醇洗脱液，A5为20%乙醇洗脱液有明显的抑菌圈，抑菌圈直径为17.74±0.03 mm，抑菌活性物质被洗脱下来，对M. luteus有较好的抑菌效果， A6为40%乙醇洗脱液有部分抑菌活性，A7、A8、A9即60%、80%、100%的乙醇洗脱液均未检测到抑菌活性（图2）。

2.2.2 离子交换分离纯化

将大孔吸附层析中收集到有抑菌活性洗脱液进行阳离子交换柱分离，B1为20 mmol/L 乙酸钠+0.2 mol/L氯化钠的洗脱液，抑菌圈直径为15.96±0.05 mm，其次是B2为20 mmol/L乙酸钠+0.5 mol/L氯化钠的洗脱液，抑菌圈直径为13.06±0.08 mm （P<0.05，图3）。

2.2.3 HPLC分析结果

大孔吸附树脂20%乙醇洗脱液色谱图显示（图4A），HPLC色谱图上出现3个洗脱峰，经阳离子交换树脂进一步纯化得到单一峰（图4B），洗脱条件为20 mmol/L乙酸钠+0.2 mol/L氯化钠，峰保留时间为4.418 min。

2.3 L. paracasei TK1501后生元的稳定性分析

热稳定性试验结果显示，C1为空白对照组，抑菌圈直径为16.59±0.03 mm，在60 ℃、70 ℃、80 ℃即C2、C3、C4处理10 min后后生元的抑菌效力与未经加热的无明显变化，后生元经90 ℃处理10 min即C5抑菌圈直径为14.72±0.01 mm，保留了88.7%的活性；经100 ℃高温煮沸10 min即C6抑菌圈直径为12.76±0.04 mm，仍保留了76.9%的活性（图5）。

对酸碱的耐受性试验结果显示，D1~D7分别为pH3~9处理后生元，最初的pH约为5，D3为空白对照组，抑菌圈直径为16.98±0.06 mm，随着pH的变化，抑菌圈无明显变化（图6）。

2.4 L. paracasei TK1501后生元的抗菌谱分析

当后生元处理浓度达到25 µg/mL时，对金黄色葡萄球菌的杀菌率可达99.98%，对Hp、肠炎沙门氏菌、产气荚膜菌的杀灭率也可达到60%以上。而该菌株对肠道中的正常菌群如：大肠杆菌、双歧杆菌、乳杆菌、枯草芽孢杆菌、梭菌、链球菌等则无明显杀灭作用（P>0.05，表3）。

2.5 L. paracasei TK1501后生元对小鼠形态体质量的影响

空白组、模型组、实验组的小鼠活动正常，小鼠食用L. paracasei TK1501后生元后，精神状态较好。实验期间小鼠的死亡率为0，各组小鼠在实验期间体质量均有所增加，且增加趋势一致，相同时间的空白组、模型组和实验组小鼠体质量接近（表4）。

2.6 小鼠胃部炎症因子TNF-α、IL-1β表达水平变化

与模型组相比，经L. paracasei TK1501后生元低剂量、高剂量灌胃后，小鼠胃部炎症因子TNF-α、IL-1β表达水平下降，几乎恢复至正常水平（P<0.01，图7）。

2.7 小鼠胃组织切片HE染色

HE染色结果显示，空白组小鼠胃黏膜未见炎症细胞浸润；胃黏膜细胞层厚度正常，排列整齐。Hp感染模型组胃黏膜内可见炎性细胞弥散性浸润，L. paracasei TK1501后生元对照组小鼠胃黏膜有部分炎症细胞；L. paracasei TK1501后生元低剂量组胃黏膜炎症细胞消失，有部分白细胞浸润，L. paracasei TK1501后生元高剂量组小鼠胃黏膜组织内结构较紧密，未见明显炎症细胞浸润，胃部炎症明显降低（图8）。

2.8 小鼠胃黏膜Hp的检测

检测结果显示，模型组与空白组相比，小鼠胃黏膜中Hp菌落数约为空白组的80倍，尿素酶试剂检测为阳性，表明模型建立成功；实验对照组与模型组相比，Hp菌落数相差不多，尿素酶试剂检测也为阳性；L. paracasei TK1501后生元低剂量组与实验对照组相比，Hp菌落数明显减少（P<0.01），尿素酶试剂检测为弱阴性，L. paracasei TK1501后生元高剂量组Hp菌落数接近空白组，尿素酶试剂检测为阴性（表5）。

3 讨论

本研究选取具有高感染性的Hp作为研究对象，探究L. paracasei TK1501后生元对Hp感染的抑制作用。后生元分离纯化结果显示，L. paracasei TK1501后生元可以抑制Hp的生长，其抑制作用与后生元的浓度呈正相关。Hp是最常见的慢性细菌感染，如果治疗不及时，可能发展为胃炎，根除Hp可降低发病率^{［23，24］}。益生菌是预防或缓解胃肠道炎症的天然替代品，乳酸菌作为益生菌被广泛用于预防和控制胃肠道疾病 ^{［25，26］}。其中，抗菌肽因其独特的抑菌作用机制，与它的热稳定性、pH稳定性和对蛋白水解酶的敏感性密不可分。本研究显示，L. paracasei TK1501后生元在60~80 ℃仍有较好的稳定性，相对活性均保持在90%以上，80 ℃以后抑菌活性开始出下降，100 ℃时抑菌活性仍保持79%，具有较好的热稳定性。有学者研究的细菌素pH稳定性在2.5~5.5^［27］，在酸性环境效果最佳，pH8.0~10.0稳定性逐渐降低。有研究从L. paracasei FX-6中提取分离出新的细菌素，显示在中性和碱性条件下有抑制作用，在酸性环境中无活性^［28］。而本研究的L. paracasei TK1501后生元pH3~9时，相对活性都保持在 90%以上，对酸碱均有较高的耐受性。有学者研究乳酸菌产生的细菌素，在治疗过程中被蛋白水解酶处理后，细菌素的活性完全丧失^［29］。而本研究的L. paracasei TK1501后生元在胃蛋白酶的影响下活性略有损失，易被蛋白酶K以及消化道中的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和α-糜蛋白酶所降解，说明该物质可通过胃部消化液，到达肠道中发挥作用后被降解。

研究表明产细菌素的乳酸菌可通过抑制病原微生物生长和竞争排斥等方式促进自身及其他益生菌在肠道内的定植^［30］，从而调节肠道菌群平衡，稳定肠内微生态系统。本研究发现L. paracasei TK1501后生元在一定使用剂量下对金黄色葡萄球菌、Hp等有害菌均有较好的杀灭作用，当L. paracasei TK1501后生元处理浓度达到25 µg/mL时，对金黄色葡萄球菌的杀菌率可达99.98%，而对肠道中的正常菌群或益生菌（如：双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、链球菌、乳杆菌等）则无明显影响，对菌群紊乱具有良好的改善效果。有研究报道了肠道益生菌嗜酸乳杆菌发酵代谢产物细菌素的生物学特性^［31］，通过试验证实其临床治愈率高于抗生素，愈后复发率低于抗生素。有研究通过比较乳酸杆菌产细菌素对金黄色葡萄球菌临床株的体外抑菌效果^［32］，发现细菌素对金黄色葡萄球菌的生长及生物膜都表现出较强的抑制作用，可以体现乳酸杆菌产细菌素在临床上的重要价值。有研究从泰国传统发酵米粉中分离到15株乳酸菌对临床分离的Hp有抑菌活性^［33］，发现耐胆汁酸的发酵乳杆菌对Hp MS83和BK364有广泛的抗菌活性。这些研究为临床治疗顽固性的Hp感染治疗可能性提供了依据，但细菌素有自身的局限性，如分离提纯困难、产量低等。本研究根据带正电荷细菌素的性质，疏水性和相对分子质量较小，经XAD-16大孔树脂吸附、阳离子交换法、高效液相色谱法三步提纯，评价细菌素的纯化效果后，最终的纯化回收率为63%。研究发现的细菌素经三步纯化回收后，收益率为12%，本研究的纯化回收效率提高了5.25倍^［34］。

IL-1β具有较强的促炎活性，可诱导多种促炎介质；TNF-α是一种多效性促炎细胞因子，在调节多种发育和免疫过程中发挥着不同的作用，包括炎症、分化、脂质代谢和凋亡，与多种疾病有关^{［35，36］}。已有研究报道，Hp感染胃炎患者的胃黏膜炎性细胞浸润增加，且TNF-α、IL-1β的表达显著上调^［37-39］。本研究发现，灌胃L. paracasei TK1501后生元高剂量组的Hp感染诱导小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-1β的表达显著下降；胃黏膜Hp定量培养L. paracasei TK1501后生元高剂量组，小鼠胃黏膜组织内结构较紧密，侵入性炎症细胞的数量显著减少。以上结果表明L. paracasei TK1501后生元可降低 Hp感染小鼠胃黏膜的炎症反应。本研究通过胃黏膜Hp定量培养，进一步验证了L. paracasei TK1501后生元可以抑制Hp的生长。

综上所述，L. paracasei TK1501后生元能对菌群紊乱具有良好的改善效果，可抑制Hp生长，发挥抗炎作用。L. paracasei TK1501后生元对蛋白酶敏感，与目前常用抗生素相比，该活性产物的选择性更强、副作用更小，在治疗Hp、肠炎沙门氏菌等感染肠胃疾病以及金黄色葡萄球菌感染方面具有良好作用。L. paracasei TK1501后生元热稳定性好，对酸碱、有机溶剂等不利因素具有较好的耐受性，因此利于产品的储存运输。但目前对L. paracasei TK1501后生元的具体结构仍然未知，后期将对L. paracasei TK1501后生元进一步分离纯化，解析抑菌活性物质的具体结构。

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