大麻二酚经PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路减轻多重脑震荡大鼠的神经元内质网应激和凋亡

Cannabidiol inhibits neuronal endoplasmic reticulum stress and apoptosis in rats with multiple concussions by regulating the PERK-eIF2α-ATF4-CHOP pathway

摘要

目的 探究大麻二酚（CBD）对多重脑震荡后神经元内质网应激及其介导的神经元凋亡的作用。 方法 将SD大鼠分为假手术组（sham组）、多重脑震荡组（MCC组）、多重脑震荡溶剂组（MCC+TW组，1% tween20）、低剂量CBD-10组（10 mg/kg）和高剂量CBD-40组（40 mg/kg），用金属单摆打击装置制成大鼠MCC模型，给药各组于造模成功后连续腹腔给药2周。采用qRT-PCR、Western blotting和免疫荧光染色检测大鼠脑组织中PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3、p-AKT、Pro-caspase-3的表达变化。通过网络药理学筛选CBD治疗创伤性脑损伤的核心靶点，经Autodock可视化分析CBD与内质网应激和凋亡相关因子的分子对接情况。 结果 MCC后大脑皮质内质网应激因子PERK、eIF2α、CHOP mRNA表达水平升高（P<0.05）。MCC组大脑皮质中PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3、p-AKT、Pro-caspase-3蛋白表达水平较sham组升高（P<0.05）；CBD治疗后，p-AKT表达水平进一步升高（P<0.05），而其余因子表达水平均降低（P<0.05），且CBD-40组降低更显著。网络药理学分析显示，CBD治疗TBI的核心靶点与内质网应激和脑损伤因子存在蛋白互作关系；分子对接显示CBD，与多个内质网应激和凋亡因子具有较高的结合能。 结论 大鼠多重脑震荡诱发神经元内质网应激和细胞凋亡，CBD可通过抑制内质网应激和抗凋亡发挥神经保护作用，且高剂量CBD的保护作用更明显。

Abstract

Objective To explore the effects of cannabidiol on endoplasmic reticulum stress and neuronal apoptosis in rats with multiple concussions (MCC). Methods SD rats were randomized into sham group, MCC group, 1% tween20 (TW) treatment group, and low-dose (10 mg/kg) and high-dose (40 mg/kg) cannabidiol treatment groups. In all but the sham group, MCC models were established using a metal pendulum percussion device, after which the rats received daily intraperitoneal injections of the corresponding agents for 2 weeks. The expressions of PERK, eIF2α, ATF4, CHOP, TRIB3, p-Akt and pro-caspase-3 in the brain tissue of the rats were detected with qRT-PCR, Western blotting and immunofluorescence staining. The core targets of cannabidiol in treatment of traumatic brain injury (TBI) were identified by network pharmacology analysis, and molecular docking was carried out to simulate the interaction of cannabidiol with the factors related to endoplasmic reticulum stress and apoptosis. Results Compared with the sham-operated rats, the rat models of MCC showed significantly increased mRNA expressions of PERK, eIF2α and CHOP and protein expressions of PERK, eIF2α, ATF4, CHOP, TRIB3, p-AKT and pro-caspase-3 in the cerebral cortex. CBD treatment, especially at the high dose, obviously increased the expression of p-Akt and lowered the expression levels of the other factors tested in the rat models. Network pharmacology analysis indicated interactions of the core targets of CBD with the factors related to endoplasmic reticulum stress and TBI, and molecular docking study showed a high binding energy of CBD with multiple factors pertaining to endoplasmic reticulum stress and apoptosis. Conclusion MCC induce endoplasmic reticulum stress and apoptosis in rat brain tissues, for which CBD, especially at a high dose, provides neuroprotective effects by inhibiting endoplasmic reticulum stress and cell apoptosis.

Graphical abstract

关键词

多重脑震荡 / 大麻二酚 / 内质网应激 / 神经元凋亡 / PERK通路

Key words

multiple cerebral concussions / cannabidiol / endoplasmic reticulum stress / neuronal apoptosis / PERK signaling pathway

脑震荡（CC）是在外力作用下引起神经组织结构和功能紊乱的轻型创伤性脑损伤（mTBI）^［1］，主要发生在竞技类体育项目和意外事故中，可导致严重的神经损伤，产生认知障碍和抑郁、焦虑等精神疾病，给患者及家庭带来严重困扰^［2］。首次脑震荡恢复期内头部遭受多次冲击，可导致多重脑震荡（MCC），出现明显的学习记忆能力下降，注意力不集中等症状，死亡风险升高，其发病率在过去10年间持续增加^［3］。

内质网作为重要的细胞器，控制着蛋白质翻译及修饰，直接影响细胞和组织的功能^［4］。病理状态下，异常的理化因素可引起错误折叠的蛋白质在内质网中累积，引起内质网应激（ERS）^［5］。研究表明，ERS过程涉及多个信号分子和传导通路，如IRE1/sXBP1、PERK/eIF2α和ATF6等，它们共同参与维持内质网稳态^［6］。PERK-eIF2α-ATF4是ERS的关键信号途径之一，对细胞的生存至关重要^［7］，而PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号通路在促进细胞凋亡过程中扮演着重要角色^［8］。蛋白激酶B（AKT）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与调节细胞存活、生长和血管生成等生物过程，其激活后可使下游信号发生磷酸化，引起Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3等凋亡相关蛋白的变化^{［9， 10］}。课题组前期研究发现，MCC后大鼠皮质、海马等部位的大量神经元发生凋亡，细胞内有凋亡小体形成^{［11， 12］}。然而，MCC后是否经内质网应激通路诱发神经元凋亡尚未可知。

大麻二酚（CBD）是大麻提取物中一种含量丰富且无精神依赖性的大麻素，具有抗氧化、抗炎和减少帕金森病中神经细胞凋亡等作用^{［13， 14］}。课题组前期实验发现CBD能明显促进MCC大鼠受损神经元恢复，改善学习记忆和运动能力，但CBD是否对MCC后内质网应激及其介导的凋亡具有调控作用仍不清楚。本研究应用大鼠MCC模型，探究CBD对内质网应激过程中PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号的调控及抗凋亡作用，为CBD治疗脑损伤等疾病提供新的依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物

实验使用290~310 g成年健康雄性SD大鼠，由昆明医科大学实验动物部提供，实验前在标准环境（12 h 明暗交替，湿度55%~65%，温度20~25 ℃）中，按照昆明医科大学实验动物伦理要求饲养。所有动物实验均通过昆明医科大学动物伦理委员会批准（伦理批号：kmmu2020342）。

1.1.2 主要试剂和仪器

CBD（云南省天然药物药理重点实验室）；RIPA强效裂解液、蛋白酶抑制剂、30%丙烯酰胺溶液、1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）、1.0 M Tris-HCl（pH 6.8）（北京索莱宝科技有限公司）；PERK抗体、GAPDH抗体、NeuN抗体、羊抗兔和羊抗鼠荧光二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；eIF2α抗体、CHOP抗体（万类生物公司）；ATF4抗体、TRIB3抗体、Pro-caspase-3抗体（Invitrogen）；p-AKT抗体、β‑actin抗体（Cell Signaling Technology）；RNA提取试剂盒、qRT-PCR试剂盒（omega）；HRP标记山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG（博奥森生物公司）；含DAPI的荧光封片剂（Sigma）；Western blotting电泳设备、凝胶成像仪（Bio-Rad）；荧光显微镜（ZEISS）；PCR仪（Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 网络药理学研究

利用Genecards、OMIM和TTD数据库检索出TBI的相关基因；利用Drugbank、SwissTargetPrediction、Superpred以及TargetNet数据库检出CBD的潜在靶点。将二者导入Venny网站获得两者交集靶点，利用STRING数据库和Cytoscape3.10.0软件对交集靶点进行蛋白互作分析并对结果可视化，分别获取degree值和MMC算法排名前10的关键靶点，然后取交集得到最终的核心靶点。运用Metascape对交集靶点进行GO和KEGG富集分析，微生信在线平台作图。将核心靶点与PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3、AKT、Caspase-3共同输入STRING数据库得到蛋白互作网络图，并用AutoDock软件进行分子对接，最后将对接结果在Pymol软件进行可视化。

1.2.2 实验动物分组及给药

60只健康雄性SD大鼠随机分为5组：假手术组（sham）、多重脑震荡组（MCC）、多重脑震荡溶剂组（MCC+TW，1% tween20）、MCC低剂量CBD-10组（10 mg/kg）和MCC高剂量CBD-40组（40 mg/kg），12只/组。给药各组在建模后第2天开始连续腹腔给药2周，给药结束1 d后取脑组织。

1.2.3 大鼠脑震荡模型复制

利用改进的Bakay式闭合性脑损伤单摆打击装置制备CC模型^［15］。在实验开始前记录大鼠的基础呼吸频率，并注意观察其角膜反射、外耳道反射、翻正反射和疼痛反射的有无及大鼠的意识状态、瞳孔直径、是否存在肌张力异常、竖尾、大小便异常等情况。正常状态下的大鼠固定在金属单摆打击仪上，使其处于平静状态，头上仰45°，单摆长为31.75 cm，单摆质量为1450 g，单摆上举使角度为70°±10°，自由下落冲击大鼠额顶正中部，使其意识短暂丧失，松解后观测大鼠意识、角膜反射、翻正反射、外耳道反射、疼痛反射、自主呼吸恢复时间和运动能力等数据。每日打击1次，连续打击3次制成大鼠多重脑震荡（MCC）模型。

1.2.4 qRT-PCR检测CBD对MCC大鼠大脑皮质中ERS基因的调节作用

使用omega RNA提取试剂盒提取大脑皮质总RNA，取500 ng总RNA逆转录成cDNA。PCR反应条件为：预变性（95 ℃，30 s），变性（95 ℃，10 s），退火和延伸（60 ℃，30 s），循环40次。结果采用2^-△△Ct法进行分析，其中-△△Ct=（实验组目的基因CT值-实验组内参基因CT值）-（对照组目的基因CT值-对照组内参基因CT值）。由广州复能合成相应引物，引物序列如表1。

1.2.5 Western blotting检测CBD对MCC大鼠大脑皮质中ERS和凋亡相关因子表达的调节作用

使用RIPA裂解液提取大鼠大脑皮质蛋白，经BCA法测定蛋白浓度，接着使用SDS-PAGE分离蛋白质，并转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST漂洗后分别加入抗PERK（1∶1000）、p-AKT（1∶2000）、TRIB3（1∶500）、ATF4（1∶500）、CHOP（1∶1000）、eIF2α（1∶500）、Pro-caspase-3（1∶1000）抗体，于4℃孵育过夜。次日，TBST漂洗后加入对应的HRP标记山羊抗兔二抗（1∶20 000）和山羊抗鼠二抗（1∶20 000），室温孵育1 h，用ECL化学发光显影，Image J 1.4.3.67软件进行图像分析。

1.2.6 免疫荧光双标染色检测ERS和凋亡相关因子在皮质中的定位及表达变化

取出大鼠脑组织冰冻切片，经复温水化、PBS漂洗、内源性过氧化物酶阻断剂孵育、山羊血清封闭60 min后，分别添加抗PERK（1∶50）、p-AKT（1∶500）、TRIB3（1∶100）、ATF4（1∶500）、CHOP（1∶100）、eIF2α（1∶400）、Pro-caspase-3（1∶200）抗体，于4 ℃孵育过夜。次日PBS漂洗后添加相应荧光二抗，室温孵育60 min。用含DAPI的防荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察并记录。图像用ImageJ软件对阳性结果进行检测分析。

1.3 统计学分析

所得数据采用均数±标准差表示，应用GraphPad Prism8.2.0软件进行数据处理，采用单因素方差分析结合Tukey检验进行多重比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CBD对大鼠MCC后大脑皮质中ERS因子PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3的抑制作用

2.1.1 MCC后大鼠大脑皮质PERK、eIF2α、CHOP基因表达变化

与sham组相比，MCC组PERK、eIF2α、CHOP的mRNA表达水平升高（P<0.05，图1）。

2.1.2 CBD对大鼠MCC后ERS因子PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3的抑制作用

Western blotting结果显示，与sham组相比，MCC组PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3蛋白表达水平升高（P<0.01）；经CBD治疗，上述蛋白表达水平降低（P<0.05），且CBD-40组PERK表达水平低于CBD-10组（P<0.01，图2）。

免疫荧光染色结果显示，PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3与神经元的共定位；与sham组相比，MCC组PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3免疫阳性表达水平升高（P<0.01）；经CBD治疗，PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3的免疫阳性表达水平降低（P<0.05），且CBD-40组降低更明显（图3）。

2.2 CBD对大鼠MCC后促凋亡因子caspase-3的下调作用

Western blotting结果显示，与sham组相比，MCC组Pro-caspase-3蛋白表达水平升高（P<0.05）；经CBD治疗，Pro-caspase-3表达水平降低（P<0.05，图4A、B）。

免疫荧光染色结果显示，Pro-caspase-3与神经元共定位；与sham组相比，MCC组Pro-caspase-3免疫阳性表达水平升高（P<0.01）；经CBD治疗，Pro-caspase-3免疫阳性表达水平降低（P<0.01），且CBD-40组降低更明显（图4 C、D）。

2.3 CBD对大鼠MCC后抗凋亡因子p-AKT的上调作用

Western blotting结果显示，与sham组相比，MCC组p-AKT蛋白表达水平升高（P<0.01）；经CBD治疗，p-AKT表达水平进一步升高（P<0.05），且CBD-40组p-AKT表达水平高于CBD-10组（P<0.05，图5A、B）。

免疫荧光染色结果显示，p-AKT与神经元共定位；与sham组相比，MCC组p-AKT免疫阳性表达水平升高（P<0.01）；经CBD治疗，p-AKT免疫阳性表达水平进一步升高（P<0.01），且CBD-40组p-AKT免疫阳性表达水平高于CBD-10组（P<0.01，图5C、D）。

2.4 CBD治疗TBI的网络药理学研究

2.4.1 CBD治疗TBI的网络药理学分析结果

经网络药理分析筛选出TBI疾病靶点2390个，CBD潜在作用靶点194个，二者的交集靶点90个（图6A），并构建交集靶点的蛋白互作网络图（图6B）。获取degree值前10的靶点和MMC算法前10的靶点，取二者交集得到核心靶点CAT、PTGS2、CYP3A4、ABCB1。将核心靶点与ERS和凋亡相关因子PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3、AKT、caspase-3共同输入STRING数据库，获得互作网络结构图（图6C）。结构图共计11个节点，28条边，且平均节点的degree值为5.09。其中CAT为孤立靶点，其余蛋白间存在互作关系。

2.4.2 CBD调节TBI靶点的GO/KEGG富集分析

GO富集分析显示共涉及1016个条目，其中生物学过程810个，细胞组分78个，分子功能128个。根据Gene count筛选各前20个条目，生物学过程主要涉及细胞对氮化物的反应、对外界刺激的应激、膜电位调节等，细胞组分主要涉及树突、突触、胞体和胞质膜等变化，分子功能主要涉及氧化还原酶活性、离子跨膜转运蛋白活性、离子通道活性等（图7A）。KEGG共富集到与药物代谢、多种信号通路、细胞凋亡、神经退行性变、阿尔兹海默病等相关的102条信号通路（图7 B）。

2.4.3 CBD与内质网应激和凋亡相关因子PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3、AKT、caspase-3的结合潜能

CBD分子对接后的结果显示PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3、AKT、caspase-3与CBD都具有一定的结合能，且结合能均小于0 kcal/mol（表2），配体和受体间能自发结合，并用Pymol软件可视化对接结果（图8）。

3 讨论

脑震荡是最常见的创伤性脑损伤类型，所产生的剪切力和应力可造成脑组织撕裂或挤压，引发一系列神经代谢变化^［16］。有研究报道，遭受TBI的小鼠大脑神经元树突棘密度、树突长度减少，神经元丢失^［17］。课题组前期研究发现MCC后神经元出现明显的病理改变，包括形态不规则，核固缩，着色深，胞质、核仁不清晰等。以上研究说明脑震荡等创伤会累及皮质、海马及纹状体等部位的神经元，但尚未揭示诱发神经元死亡的具体机制。

近年来，内质网应激成为研究脑缺血、脑损伤等神经疾病机制的重要热点^［18］。创伤性脑损伤可引起一系级联反应，包括内质网应激、氧化应激和神经炎症等^［19］。本研究中GO和KEGG富集分析发现创伤性脑损伤与细胞质膜变化、应激反应和凋亡等过程相关。疾病状态中多种理化因素刺激可激活ERS传感器—蛋白激酶RNA样内质网激酶（PERK），引发ERS，未折叠蛋白反应（UPR）信号通路随之响应，启动促凋亡和炎症信号通路^［20］。在帕金森病患者中，黑质多巴胺神经元PERK磷酸化诱导UPR，激活翻译起始因子eIF2α介导神经元凋亡^［21］。同时，活化的翻译转录因子（ATF4）可通过调节血浆C/EBP同源蛋白（CHOP）促进内质网应激，诱发细胞凋亡^［22］。研究发现抑制PERK-ATF4-CHOP信号可减轻缺血再灌注所致的神经元损伤^［23］。这些研究表明，内质网应激通过PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路对细胞凋亡起着重要的调控作用。本实验观察到，大鼠MCC后神经元中PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路被激活，出现Tribbles假激酶3（TRIB3）的表达增加，MCC很可能通过激活ERS途径启动神经元凋亡，最终导致大脑的进行性损伤和神经功能障碍。

为进一步探明大鼠MCC后ERS对神经元的影响，本研究对介导细胞凋亡的主要因子进行了检测。Caspase-3是诱发凋亡的关键因子，其前体物质Pro-caspase-3受到细胞内外的病理刺激后会被激活，转化为有活性的caspase-3，通过裁剪或切割不同蛋白质使细胞发生凋亡^［24］。有研究报道，细胞发生ERS后，CHOP蛋白表达的增高可促进caspase-3的表达以触发程序性细胞死亡^［25］；在脊髓损伤的小鼠模型中，GRP78、CHOP等ERS因子表达升高后引起细胞凋亡因子caspase-3及Bax/Bcl-2水平升高，表明ERS与细胞凋亡密切相关^［26］。课题组前期发现MCC后大鼠脑内大量神经元发生凋亡，但具体机制尚不清楚。本实验中发现，MCC不仅可以激活神经元中ERS因子，还能诱发下游的凋亡蛋白Pro-caspase-3表达明显升高，表明MCC后的ERS很可能是诱发神经元凋亡的重要原因之一。

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT是多种信号通路的中心介质，参与调节细胞存活、增殖、凋亡和糖代谢等生物过程^［27］。有学者发现，缺血再灌注可激活ERS导致神经元凋亡；当ERS减轻后p-AKT表达增加、促凋亡蛋白Bax和Bim表达降低，同时抗凋亡蛋白Bcl-2水平升高，进而减少细胞凋亡^［28］。复发性热性惊厥通过ERS介导TRIB3表达增加，进而抑制AKT磷酸化，促进海马神经元凋亡^［29］。以上实验说明ERS与AKT之间存在着调节联系，并对细胞凋亡过程有着积极的作用。本实验发现，MCC大鼠皮质中TRIB3升高的同时p-AKT也升高，这提示TRIB3和AKT参与了ERS过程，可能通过促进p-AKT的表达以增强抗凋亡作用，从而启动神经组织自发的保护机制。神经疾病状态下，内质网应激可引起促凋亡通路和抗凋亡作用均被激活，但较强的促凋亡作用导致神经元凋亡增加，对ERS途径的有效干预很可能是抑制神经元凋亡的重要靶向。

CBD具有较丰富的药理作用，对慢性疼痛、抑郁、焦虑及神经退行性变均有疗效^［30］。CBD可与中枢神经系统中CB1受体结合，治疗癫痫、多发性硬化症、疼痛及帕金森病等中枢神经系统疾病。Patel等^［31］发现CBD可通过下调ERS介导的促凋亡因子Bim和caspase-12来减少纹状体的神经元死亡，说明CBD对内质网应激具有抑制作用。课题组前期发现，CBD可减轻脑震荡大鼠的神经炎症^［32］，改善神经功能，但CBD调控MCC诱发ERS的研究仍未见报道。本实验通过网络药理学研究显示，CBD治疗TBI的核心靶点与ERS和凋亡相关因子间存在密切的蛋白互作关系；分子对接结果表明CBD与ERS的核心因子PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3以及凋亡相关因子AKT、caspase-3具有较好的结合潜能，CBD可能通过多个靶点调节脑损伤后的ERS和凋亡过程。本实验应用大鼠MCC模型，进一步探明CBD对MCC后ERS和细胞凋亡的调控作用。结果表明，大鼠MCC后给予CBD可显著降低ERS主要因子PERK、eIF2α、ATF4、CHOP和TRIB3的表达，减轻内质网应激反应；同时，CBD还能降低促凋亡因子Pro-caspase-3的表达、促进抗凋亡蛋白p-AKT升高，减轻MCC对神经元的损伤。此外，高剂量CBD能更显著的降低ERS和凋亡因子的表达，其疗效呈现一定的量效关系。

综上，CBD可能通过抑制MCC后神经元PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路和细胞凋亡发挥神经保护作用，为CBD用于治疗创伤性脑损伤提供了新的依据。但CBD具体通过哪些靶点抑制内质网应激通路进而减少神经元凋亡，仍需要更深入的研究以阐明。

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