神经特异性跨膜蛋白240与过氧化物酶体共定位并激活Rho GDP解离抑制因子β

Neurospecific transmembrane protein 240 colocalizes with peroxisomes and activates Rho GDP dissociation inhibitor β

摘要

目的 探究跨膜蛋白240（TMEM240）的亚细胞定位及其生物学功能。 方法 用NCBI的BLAST工具对蛋白质序列分析，TMHMM生物信息学软件对TMEM240跨膜结构进行分析；体内实验：取18~20 d的雄性C57BL/6小鼠脑组织，设置TMEM240探针组和对照组（3只/组），采用原位杂交技术验证TMEM240在脑组织中的表达分布；采用qPCR、Western blotting检测小鼠不同组织、不同时间皮层神经元TMEM240的表达情况（3只/组）；体外实验：采用质粒转染完成Tmem240过表达体系的构建及稳定克隆的筛选，采用细胞成像技术对TMEM240的亚细胞定位进行研究，确定TMEM240在细胞内的形态和分布，采用qPCR，Western blotting，免疫荧光检测TMEM240在细胞内表达情况并验证其生物学功能； 结果 人源和鼠源TMEM240蛋白质序列相似性达97.69%，TMEM240为含有两个跨膜结构的跨膜蛋白；体内实验：TMEM240的mRNA和蛋白在脑组织及神经元中特异性高表达（P<0.001），原代神经元培养9 d时TMEM240表达水平最高（P<0.001）；体外实验：TMEM240在细胞内呈点状分布，属于细胞内膜性结构，并与过氧化物酶体具有80%共定位；过表达Tmem240的Neuro-2a细胞Rho GDP解离抑制因子β（ARHGDIB）的mRNA和蛋白表达均升高（P<0.05）。 结论 TMEM240是一种定位于细胞内的新型亚细胞结构，在神经元中特异性表达，在靶向细胞功能调控方面具有巨大的潜力。

Abstract

Objective To investigate the subcellular localization and biological functions of transmembrane protein 240 (TMEM240). Methods NCBI BLAST and TMHMM bioinformatics software were used for protein sequence analysis and prediction of transmembrane domain of TMEM240. Brain tissues from male C57BL/6 mice (18-20 days old) were examined for distribution of TMEM240 using in situ hybridization, and qPCR and Western blotting were used to detect TMEM240 expression in different mouse tissues and in cortical neurons at different time points (n=3). In the in vitro experiment, HepG2 and Neuro-2a cells were transfected with plasmids for overexpression of TMEM240, and subcellular localization of TMEM240 was analyzed using cell imaging. In primary cultures of cortical neurons isolated from C57BL/6 mice, TMEM240 expression and its biological functions were investigated using qPCR, Western blotting, and immunofluorescence staining. Results Human and mouse TMEM240 proteins share a 97.69% similarity in the protein sequences, and both are transmembrane proteins with two transmembrane domains. TMEM240 mRNA and protein were highly expressed in mouse brain tissues and cortical neurons. In isolated mouse cortical neurons, TMEM240 expression reached the peak level after primary culture for 9 days and distributed in scattered spots within the cells. In HepG2 cells, TMEM240 was characterized as intracellular membrane structures and showed 80% colocalization with peroxisomes. In Neuro-2a cells, TMEM240 overexpression caused significant enhancement of the expressions of Rho GDP dissociation inhibitor β (ARHGDIB) at both the mRNA and protein levels. Conclusion TMEM240 is a novel intracellular subcellular structure specifically expressed in neurons with significant potential for targeted cellular function regulation.

Graphical abstract

关键词

跨膜蛋白240 / 神经元 / 亚细胞定位 / 过氧化物酶体 / Rho GDP解离抑制因子β

Key words

TMEM240 / neurons / subcellular localization / peroxisomes / Rho GDP dissociation inhibitor β

尽管现在已经确定了人类基因组的整个序列，但是许多基因的功能仍然知之甚少，它们的作用机理尚不清楚。跨膜蛋白（TMEMs）是一类具有跨膜区域的蛋白^［1］，具有维持细胞稳态的重要功能^［2］，包括形成质膜离子通道^［3］和激活信号转导通路^［4］，并在细胞自噬^［5］、肌肉形成^［6］、细胞胆固醇代谢^［7］和胶原蛋白分泌^［8］中发挥关键作用。越来越多的证据表明，TMEM家族成员参与癌症的发生发展，可作为潜在的预后生物标志物，作为癌症的潜在治疗靶点^{［2， 9］}。并且证明，TMEM家族成员与神经系统退行性疾病具有相关性，例如，TMEM175、TMEM163、TMEM229B的突变与帕金森病（PD）相关^［10］，TMEM106B 突变是额颞叶痴呆及阿尔兹海默病（AD）的危险因素^［11］。TMEM166诱导的自噬和凋亡可能在MCAO损伤后的细胞死亡过程中发挥重要作用，其可能是通过Bcl-2介导，通过使用siRNA阻断 TMEM166的活性，能够改善MCAO损伤和预后^［12］。

跨膜蛋白240（TMEM240）是TMEMs家族成员之一^［13］，在美国国家医学杂志中被归类为一种新型的神经调节基因，生物技术信息中心（NCBI）的UniGene数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene）中包含未知功能的基因，并且预计在脑组织中特异性表达（http：//biogps.org/#goto=welcome）。TMEM240位于人类染色体1p36.33^［14］上，mRNA序列长度为1381 bp，包含4个外显子，它们编码173个氨基酸的蛋白质，相对分子质量为20 000^［14］。在小鼠中，Tmem240位于4号染色体上，全长1378 bp的mRNA序列也包含4个外显子，它们编码173个氨基酸的蛋白质，相对分子质量为20 000^［13］。基于NCBI BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）功能，人和鼠TMEM240蛋白序列显示97.69%的同一性。研究表明，TMEM240启动子的高甲基化在多数胃癌、乳腺癌和结直肠癌患者中普遍存在，提示其可能作为胃癌和结直肠癌的潜在DNA甲基化生物标志物，用于疾病的早期预测、预后评估或早期复发生物标志物^［15-17］。此外文献指出TMEM240的突变会引起伴随精神发育迟缓和严重认知功能障碍的脊髓小脑共济失调21型（SCA21）^［18-20］，TMEM240在神经发育的过程中起到了重要的作用，但具体机制并未阐明^［14］；2018年进行的一项研究表明，TMEM240基因的突变可抑制溶酶体蛋白降解并引起神经胶质细胞的早期活化，从而促进SCA21^［13］。然而，TMEM240在神经细胞中的详细聚集模式和功能状态尚不清楚。

本研究中对TMEM240亚细胞定位进行了研究，并且证实，TMEM240在脑组织及神经元中特异性表达。并且对TMEM240的生物学功能进行了初步研究，这些研究结果对于了解TMEM240引起SCA21发病机制具有重要意义，具有潜在的临床应用价值。

1 材料和方法

1.1 实验材料与主要试剂

小鼠神经母细胞瘤（Neuro-2a）、小鼠肝癌细胞系（HepG2）（广州欣源生物科技有限公司），Trizol试剂（Invitrogen），Plus All-in-one 1st SrandcDNA Synthesis SuperMix （gDNA Purge）、SYBR qPCR SuperMix Plus（苏州近岸蛋白质科技股份有限公司），Tris/甘氨酸/SDS电泳缓冲液、转膜缓冲液、脱脂奶粉、HRP标记二抗山羊抗小鼠IgG、HRP标记二抗山羊抗兔IgG（上海雅酶生物医药科技有限公司），脂质体3000、胎牛血清、兔多克隆抗体ARHGDIB（1∶500）、鼠单克隆抗体GFP（1∶1000）、Alexa Fluor555标记山羊抗兔IgG（H+L）（1∶400，Thermo Fisher）、兔多克隆抗体TMEM240（1∶1000，北京博奥森生物技术有限公司），鼠单克隆抗体GAPDH（1∶1000，上海碧云天生物技术股份有限公司），DMEM培养基、CF555标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（1∶400，Sigma-Aldrich）。

1.2 实验动物

C57BL/6小鼠购自辽宁长生生物科技有限公司，许可证号：NO. SCXK （Liao） 2020-0001。将6周龄，体质量为17~18 g 的C57BL/6雌性鼠2只与雄性鼠1只合笼，孕16~18 d后提取胎鼠原代皮层神经元。本研究获郑州市中心医院伦理学委员会的许可（伦理批号：ZXYY2024250）。

1.3 细胞培养和转染

原代皮层神经元的体外培养：取E16~18 d的C57 BL/6胎鼠，超净台内固定颈部，取出脑组织，去除小脑、嗅球及间脑、中脑等组织，剩余大脑皮层，移至另外一个平皿内，仔细剥离脑膜，全程冰上操作，移至玻璃瓶内，弯剪剪碎加入适量0.125%胰酶，37 ℃消化 10 min，等量10% F12/DMEM终止消化，40 μm滤膜进行过滤，离心，1500 r/min 5 min 4 ℃，弃除上清，用10% F12/DMEM重悬细胞，计数，将细胞按照一定比例接种到培养皿（多聚赖氨酸预处理）中，4~6 h更换含有B27的维持培养液继续培养，2.5 d/次天半量更换培养液。分别构建Tmem240-GFP、G3BP1-GFP、pLVX-mcherry-TMEM240、Peroxisome（PXMP2）、Endosome（RAb5b）质粒，使用脂质体3000将质粒转染到HepG2、Neuro-2a细胞中。转染72 h后，用0.25%的胰蛋白酶分离细胞，并扩散到玻璃底培养皿上进行荧光成像。

1.4 免疫荧光

取脑组织冰冻切片（6 μm）或培养的细胞，4%多聚甲醛固定，5% BSA封闭后，一抗GFP（1∶400），ARHGDIB（1∶400），Hoechst33342（1∶1000）4 ℃孵育12~16 h。PBS洗去第一抗体后，将样本和荧光二抗CF555标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（1∶400），Alexa Fluor555标记山羊抗兔IgG（H+L）（1∶400）在室温避光孵育1 h。然后用DAPI进行细胞核染色，封片，使用共聚焦显微镜获取图像，并且使用ZEN 2009软件进行分析。

1.5 qPCR测定

使用Trizol试剂提取组织及细胞RNA，进一步逆转录为cDNA，随后进行qPCR总体系10 μL，cDNA模板4 μL（将cDNA浓度稀释至10 ng/μL），上下游引物共1 μL（2 μmol/L），2×SYBR Green PCR Master Mix 5 μL。扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ ：10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，45 cycles；72 ℃ 5 min。利用2^-ΔΔCT法测定靶基因的表达量，RNA引物序列（深圳华大基因股份有限公司）见表1。

1.6 Western blotting

常规提取组织和细胞蛋白，使用BCA试剂盒检测浓度，电泳：浓缩胶90 V 15 min，分离胶120 V 60~80 min，根据蛋白分子量大小调整时间；转膜：由下层至上层为黑色泡沫，滤纸，胶块，PVDF膜，滤纸，黑色泡沫，300 mA，50~60 min，根据蛋白分子量的大小调整时间；封闭：5 %脱脂奶粉（1×TBST配置）封闭，室温1~2 h；一抗TMEM240（1∶1000），GFP（1∶1000），ARHGDIB（1∶1000）：4℃ 12~16 h；洗膜：1×TBST洗3次，10 min/次，摇床室温；二抗HRP标记二抗山羊抗小鼠IgG（1∶6000）、HRP标记二抗山羊抗兔IgG（1∶6000）：室温孵育60 min；洗膜：1×TBST洗3次，10 min/次，摇床室温；显色：ECL显色法显色，保存图片，分析整理数据。

1.7 原位杂交实验检测TMEM240在脑组织的表达分布

常规脱蜡并水洗。制备湿盒：混合5×SSC（pH 7.5，35 mL）和甲酰胺（35 mL）。使用30% H₂O₂与甲醇（1∶9）混合液室温处理切片10 min。DEPC水洗切片3次，1 min/次。将切片置于湿盒内，滴加0.25%盐酸于组织上，常温处理15 min，DEPC水洗2次，1 min/次。蛋白酶K处理组织，37 ℃下20 min，以提高探针结合效率。使用0.2%或0.1 mol/L甘氨酸溶液终止蛋白酶K活性，1 min。PBS洗切片2次，1 min/次。使用4% PFA固定组织10 min。PBS洗切片3次，1 min/次。使用acetic anhydride（pH 8.0）室温处理切片2次，5 min/次。PBS洗切片5次，1 min/次。使用5×SSC（pH 7.5）洗切片2次，1 min/次。预杂交液覆盖切片，65 ℃预杂交1 h。使用500 ng/mL地高辛标记探针，65 ℃杂交48 h。2×SSC（pH 7.5）洗切片1次，1 min。使用甲酰胺和4×SSC（pH 4.5，1∶1）混合液60 ℃或65 ℃洗切片3次，20 min/次。PBS洗切片5次，1 min/次。使用封闭液室温处理切片至少30 min。生物素化鼠抗地高辛抗体处理切片，37 ℃下60 min，PBS洗3次，5 min/次。SABC-POD处理切片，37 ℃下20 min，PBS洗3次，5 min/次。生物素化过氧化物酶处理切片，37 ℃下20 min，PBS洗3次，5 min/次。DAB显色，苏木素染核，酒精脱水，二甲苯透明化，封片。

1.8 流式细胞术检测Tmem240-pEGFP-N1阳性率

样本制备收集待测细胞，离心去除上清。用预冷的PBS洗涤细胞2次，调整细胞浓度至1×10⁶~1×10⁷/mL。加入Fc受体封闭剂，室温避光孵育10 min，减少非特异性结合。加入荧光标记的一抗GFP（1∶200），混匀后4 ℃避光孵育30 min。洗涤去除未结合抗体，加入2 mL PBS，离心（300 g，5min）去上清，重复2次。用200~500 μL PBS重悬细胞，过细胞筛（40 μm）去除团块，避免堵塞流式管。上机检测，开启流式细胞仪并校准，设置阈值和检测通道，采集散射光和荧光信号，保存数据。使用FlowJo进行数据处理，分析荧光信号强度和阳性率。

1.9 统计学方法

统计分析和图表制作用GraphPad Prism 9.0软件。做正态性检验和方差齐性分析，数值用均值±标准差表示，两组之间比较用t检验，多组之间的比较用单因素方差分析（AVONA）及事后分析（post-hoc test）。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TMEM240在脑组织及神经元中特异性表达

qPCR及Western blotting结果显示TMEM240在脑组织中高表达，在心脏、胰腺组织低表达，在脾脏、骨骼肌、肾脏不表达（P<0.001，图1A、B），TMEM240在神经元中特异性表达（P<0.001，图C）；qPCR检测Tmem240的表达水平，发现随着培养时间的延长，Tmem240的表达时间依赖性降低，1~9 d表达水平逐渐升高，9 d时表达水平最高（P<0.001，图1D），14 d时表达水平降低（图1D）。

2.2 内源性TMEM240在脑组织丰富表达

小鼠脑组织原位杂交显示棕色为TMEM240，紫色为细胞核（图2A），与未加探针组（图2B）相比，其在脑组织丰富表达。

2.3 TMEM240跨膜结构的分析

通过NCBI的BLAST比对工具比对发现人源和鼠源TMEM240蛋白质序列具有高度一致性，相似性达97.69%（图3A）。利用TMHMM软件对TMEM240蛋白进行了氨基酸序列分析，结果显示其编码的2个跨膜蛋白具有疏水性（图3B）。第1个跨膜区域位于第9~31个氨基酸，第2个跨膜区域位于第93~115个氨基酸，其中1~8个氨基酸位于胞内区，31~92位于胞外区，116~172位于胞内区，根据预测结果我们构建了TMEM240跨膜结构示意图（图3C），TMEM240是含两个跨膜结构的跨膜蛋白。

2.4 Tmem240过表达体系的构建及稳定克隆的筛选

成功构建Tmem240-GFP真核表达质粒（图4A），并转染至Neuro-2a细胞，激光共聚焦检测外源性TMEM240结果表明，TMEM240在细胞中呈点状分布（图4B）。运用qPCR、Western blotting、流式细胞术证明Tmem240过表达体系构建成功（P<0.001，图4C~E）。此外，Western blotting结果显示在过表达Tmem240的Neuro-2a细胞的膜蛋白、浆蛋白及总蛋白中，发现TMEM240在膜蛋白和总蛋白表达水平较高（图4F）。结果表明，成功构建Tmem240过表达体系，验证TMEM240属于细胞内膜性结构。

2.5 TMEM240在细胞内的亚细胞定位

活细胞成像结果显示TMEM240与应激颗粒标志物（G3BP1-GFP）完全不重合（图5A），表明TMEM240不属于细胞内的非特异性蛋白聚集。发现TMEM240与过氧化物酶体（Peroxisome，PXMP2）其在细胞内的分布形态相似，呈囊泡样分布于细胞内，与PXMP2大部分能够重合（图5B），与内体（Endosome，RAb5b）部分重合（图5C）。对荧光重合率进行Pearson；s correlation coefficient评分，发现TMEM240与过氧化物酶体相关性最高（图5D）。

2.6 TMEM240的生物学功能验证

qPCR结果表明，与对照组相比，过表达Tmem240的Neuro2a细胞Bex4、Arhgdib、Spp1表达升高（P<0.01，图6A）；我们对Arhgdib家族的另外两个成员Arhgdia、Arhgdig进行验证发现其较对照组差异无统计学意义（图6B）。Western blotting及免疫荧光证实，过表达Tmem240的Neuro2a细胞，ARHGDIB蛋白表达水平较对照组明显升高（图P<0.05，图6C、D）。

3 讨论

Tmem240作为一个新发现的基因，通过NCBI的BLAST比对工具比对发现TMEM240的人源和鼠源的蛋白质序列高达97.69%同源性，提示Tmem240是一种小且高度保守的基因。应用TMHMM生物信息学软件对TMEM240蛋白质氨基酸序列进行分析，发现TMEM240是具有一定疏水性且含有2个跨膜结构的膜蛋白。通过对这些数据的分析，可以得到更多关于TMEM240的功能和结构方面的信息，为进一步对TMEM240的研究提供线索。

神经系统具有特殊而复杂的结构，正常功能的行使需要精密的调控，而参与调控的蛋白质可能是各种酶类、补体、酶或受体的调控因子、或其他蛋白质因子^{［21， 22］}。有些蛋白质在神经系统高度表达，并且具有神经系统特异性功能，而在其他组织低表达或不表达，这些蛋白质统称为神经特异性蛋白质。这些蛋白质是神经系统所特有的，具有重要的功能^［23］。近年来，随着分子生物学技术在神经科学领域的广泛应用，对于新的神经特异性蛋白或基因的探索已成为神经科学领域的热点^［24］。目前对TMEM240的研究尚不深入，研究表明，TMEM240是一个在小脑和大脑中高度表达的跨膜蛋白，其功能尚不清楚，但在小鼠大脑突触膜中被检测到，所涉及的氨基酸在进化过程中高度保守，表明这些突变可能对蛋白质功能产生重要影响，但具体机制并未阐明^［14］。本研究中，TMEM240作为跨膜蛋白的一员，在脑组织中鉴定出来，我们通过实验验证其在脑组织中mRNA水平及蛋白水平均高表达，而有些组织少有表达或不表达，如心脏、脾脏、肝脏，表明Tmem240具有组织表达特异性。因此，我们推测TMEM240在神经系统中可能具有重要的作用。本研究选择鼠源TMEM240作为研究对象，研究其对中枢神经系统方面的影响及其作用机制，为临床疾病的诊断与治疗提供充分的理论依据。

蛋白质的功能与其在细胞内的定位密切相关，而在细胞内的定位与其结构密切相关。大多数跨膜蛋白表现出清晰的细胞器定位。例如，TMEM192位于溶酶体^［25］中，TMEM126A位于细胞线粒体中^［26］，TMEM30B位于内质网中^［27］。TMEM240在HeLa细胞中定位于大型细胞质囊泡周围，且SCA21突变不影响其定位，SCA21突变型TMEM240显著阻止了浦肯野细胞的树突发育^［13］。TMEM240在浦肯野细胞、星形胶质细胞和篮状细胞中均有表达，且在浦肯野细胞的膜、胞体、轴突和树突中均有检测到，通过与突触蛋白的共染色，证实了TMEM240定位于突触后侧，提示其可能在突触传递和神经网络功能中具有重要作用^［28］。本研究中，我们通过基因克隆实验技术构建Tmem240质粒，运用人工脂质体转染方法转染至Neuro 2a细胞，荧光显微镜观察，发现TMEM240在细胞内呈点状分布，属于细胞内膜性结构，运用Western blotting进一步验证其属于膜蛋白。G3BP1（Ras GTPase激活蛋白SH3结构域结合蛋白1）在应激情况下的非特异性蛋白聚集（即应激颗粒的形成）中扮演着关键角色，在应激条件下，G3BP1通过与RNA结合诱导应激颗粒的形成^［29］。作为一个呈点状分布的蛋白，我们对TMEM240与G3BP1进行共定位，结果发现TMEM240并没有与G3BP1共定位，这证实了TMEM240点状结构并不是非特异性蛋白聚集^［30］。为进一步明确TMEM240在细胞内的定位，运用基因克隆方法构建标记不同膜性细胞器的质粒，如过氧化物酶体（Peroxisome，PXMP2），内体（Endosome，RAb5b）等，转染至HepG2细胞内，荧光显微镜观察发现，在细胞内TMEM240与Peroxisome的定位高度重合，达80%。得出结论，TMEM240胞内定位与过氧化物酶体密切相关，后期需要构建定位线粒体、高尔基体、内质网等细胞器的质粒进行共定位，并且，运用Western blotting进一步验证。另外，这种结构此前尚无文献报道过。

目前许多TMEM蛋白的功能尚不清楚，但研究表明它们在肿瘤组织中的表达与正常组织相比可能上调或下调，例如，TMEM25在结直肠癌和乳腺癌中表达下调，TMEM7在肝癌中表达下调，TMEM48在非小细胞肺癌中表达上调，TMEM蛋白在多种癌症中表现出不同的表达模式，可能作为预后生物标志物、肿瘤抑制因子或癌基因^{［31， 32］}。然而，TMEM240的生物学功能尚不完全清楚。因此，为了阐明TMEM240的功能，我们构建过表达Tmem240的Neuro -2a细胞系，运用基因组学测序筛选过表达TMEM240组与对照组差异基因表达情况，运用qPCR对差异基因进行验证。结果显示，过表达Tmem240的Neuro-2a细胞Arhgdib、Spp1表达升高，我们对Arhgdib家族的另外两个成员Arhgdia、Arhgdig进行验证，发现仅有Arhgdib表达水平较对照组明显升高。进一步运用Western blot及免疫荧光证实过表达Tmem240的Neuro-2a细胞，与对照组相比，ARHGDIB蛋白表达水平较对照组明显升高。ARHGDIB，也称为RhoGDI2，是一种鸟苷二磷酸 （GDP） 解离抑制剂（GDI），据报道可作为人类膀胱癌（BCa） 中的功能性转移抑制因子和预后标志物^［33］。并且已有文献证实，TMEM240 高甲基化是乳腺癌治疗反应和疾病进展监测的潜在生物标志物^［16］。高甲基化和 TMEM240 表达降低是消化系统肿瘤如胃癌、结直肠癌检测、预后不良和早期复发预测的潜在早发性生物标志物^［15］。以上结果提示，TMEM240与肿瘤的发生、发展具有一定作用。后续实验我们将会运用Pull down技术探索与TMEM240相互作用的蛋白质，进一步深入研究TMEM240的生物学功能及其作用机制，对研究神经元的发育具有重要的作用，为临床疾病的诊断与治疗提供充分的理论依据。

综上所述，我们的研究表明TMEM240是一种神经特异性跨膜蛋白，TMEM240亚细胞定位与过氧化物酶体密切相关，为进一步探索TMEM240在细胞内的功能提供了新的见解。成功构建外源性Tmem240的过表达载体，并在Neuro2a细胞验证其对Arhgdib基因家族的影响，为阐明TMEM240的潜在作用和机制具有重要意义。TMEM240是一种功能未知的新型亚细胞结构，这种新的结构在靶向细胞功能调控方面具有巨大的潜力，并可能为肿瘤治疗提供潜在的药物靶点。

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