红景天苷靶向miR-1343-3p-OGDHL/PDHB糖代谢轴抑制胃癌细胞的体内外增殖

Salidroside inhibits proliferation of gastric cancer cells by regulating the miR-1343-3p-OGDHL/PDHB glucose metabolic axis

摘要

目的 探讨红景天苷抗胃肿瘤（GC）机制，强调糖代谢重编程途径。 方法 高通量测序结合生物信息学分析预测红景天苷作用后显著差异表达的miRNA-靶mRNA，mRNA-mRNA相互作用关系，RNA结合蛋白免疫共沉淀实验验证miRNA-mRNA互作，蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）实验验证下游靶mRNA-mRNA互作。通过体外及体内实验探究红景天苷与miR-1343-3p对GC的作用机制。体外实验通过CCK-8法确定红景天苷的IC₅₀值并分低、中、高剂量处理细胞，结合克隆实验、RT-qPCR、Western blotting、ELISA及ATP检测评估药物对增殖、基因/蛋白/下游分子表达（miRNA、mRNA、丙酮酸、乙酰CoA）及能量代谢的影响；进一步以脂质体法转染miR-1343-3p模拟物（miR-1343-3p mimic）、抑制剂（miR-1343-3p inhibitor）、靶向OGDHL的siRNA（si-OGDHL）及其阴性对照（NC mimic/NC inhibitor/si-NC）至GC细胞，联合红景天苷处理，通过相同方法验证其协同作用。体内实验通过构建荷瘤裸鼠模型，给予红景天苷和miR-1343-3p激动剂（miR-1343-3p agomir）干预，分析瘤块体积/质量变化及靶基因、蛋白表达与代谢状态。实验分组包括空白对照、单药组及联合组，系统解析红景天苷与miRNA的调控网络。 结果 生物信息学证实，miR-1343-3p与三羧酸（TCA）循环关键酶α-酮戊二酸脱氢酶复合体亚基（OGDHL）呈负相关（P<0.01），且直接相互作用。OGDHL与丙酮酸脱氢酶E1亚基-β（PDHB）在胃癌组织中同步高表达，且二者存在相互作用。体外与体内实验证实，红景天苷以剂量/时间依赖性抑制GC细胞增殖，红景天苷作用GC细胞后，重要抑癌因子miR-1343-3p升高，受其调控的OGDHL的基因表达明显下调，导致与之互作的糖酵解酶蛋白PDHB稳态失衡，丙酮酸氧化脱羧减少，产物乙酰CoA和ATP生成明显减少（P<0.05）。 结论 红景天苷可能通过调控miR-1343-3p-OGDHL/PDHB酶复合体-丙酮酸糖代谢通路抑制GC细胞的增殖，为红景天苷抗肿瘤机制提供了新的见解，为开发基于代谢酶复合体协同调控癌症的精准疗法提供理论依据。

Abstract

Objective To investigate the mechanism through which salidroside inhibits proliferation of gastric cancer (GC) cells focusing on glucose metabolic reprogramming pathways. Methods High-throughput sequencing combined with bioinformatics analysis was employed to identify the potential targets of salidroside in human GC MGC-803 cells. Liposome-mediated transfection experiments were carried out to validate the functional and mechanistic roles of these targets. CCK-8 and colony formation assays were used to assess the effects of salidroside on GC cell viability and clonogenic ability. qRT-PCR, Western blotting, and biochemical assay kits were used to analyze the regulatory effects of salidroside on the miR-1343-3p-OGDHL/PDHB enzyme complex-pyruvate metabolic pathway in GC cells. Results Bioinformatics analysis suggested that the tumor-suppressive factor miR-1343-3p negatively regulated the key glycolytic enzyme gene oxoglutarate dehydrogenase-like (OGDHL) in GC cells, and OGDHL and pyruvate dehydrogenase E1 subunit beta (PDHB) were both significantly upregulated in GC tissues, which was close by correlated with reduced survival rates of GC patients. In MGC-803 cells, salidroside treatment significantly enhanced the expression level of miR-1343-3p and downregulated OGDHL expression, resulting in disruption of the stability of PDHB, reduced pyruvate oxidative decarboxylation, and consequently decreased production of acetyl-CoA and ATP. Conclusion Salidroside inhibits GC cell proliferation possibly by regulating the miR-1343-3p-OGDHL/PDHB enzyme complex-pyruvate metabolic pathway, which provides new insights into its anti-tumor mechanisms and suggests new strategies for targeted therapy for GC.

Graphical abstract

关键词

胃癌 / 糖代谢重编程 / 红景天苷 / miR-1343-3p / OGDHL / PDHB

Key words

gastric cancer / glucose metabolic reprogramming / salidroside / miR-1343-3p / oxoglutarate dehydrogenase-like / pyruvate dehydrogenase E1 subunit beta

胃癌（GC）是全球第五大常见癌症和第四大癌症相关死亡原因^{［1， 2］}，肿瘤侵袭所导致的复发转移是患者生存率较低的主要原因^［3］，随着分子生物学和代谢组学的发展，发现癌症的发生、进展和转移与药物作用的靶基因及能量代谢密切相关^［4］。红景天苷^［5］是藏药红景天的主要有效成分^［6］，是肿瘤综合治疗中很有价值和应用前景的生物调节剂^［7］。糖代谢异常是维持肿瘤细胞恶性表型的重要基础，已发现有氧糖酵解途径（Warburg效应）^［8］在多种癌细胞中异常活跃，近年的研究发现三羧酸循环（TCA循环）可以协同促进有氧糖酵解，产生更多糖代谢需要的关键分子，如丙酮酸和乳酸，这些分子被肿瘤细胞再利用进入TCA循环，促进肿瘤细胞中ATP的生成满足肿瘤生长的需要^［9］。

MicroRNAs（miRNAs）是一种含有21~23个核苷酸的内源性的单链小非编码RNA，通过碱基配对抑制下游靶mRNA翻译，可形成竞争性内源RNA（ceRNA）^［10］。鉴于miRNA在ceRNA网络调控中的核心效应^［11］，课题组之前的研究中通过高通量测序确定了红景天苷作用前后抑癌因子miR-1343-3p在GC中的差异表达最为明显^［12］。然而，miR-1343-3p通过红景天苷调控参与GC的能量代谢机制尚未明确。α-酮戊二酸脱氢酶复合体亚基^［13］（OGDHL）主要位于线粒体基质中参与TCA循环^［14］，其能催化α-酮戊二酸氧化脱羧转化为琥珀酰CoA，以维持细胞TCA循环的稳态和能量代谢^［15-17］。丙酮酸脱氢酶E1亚基-β^［18］（PDHB）是连接有氧糖酵解和TCA循环的关键酶^［19］，通过催化丙酮酸氧化脱羧，生成乙酰CoA进入线粒体氧化产能^［20］。OGDHL、PDHB酶蛋白分子通过参与不同的糖代谢途径—TCA循环、有氧糖酵解提供能量协同促进癌细胞的生长^［21］。本研究从糖代谢重编程的角度探究红景天苷靶向调控miR-1343-3p-OGDHL/PDHB酶复合体-丙酮酸糖代谢通路抑制GC细胞增殖的重要分子机制，对于深入理解GC细胞糖代谢重编程和癌细胞的进展具有重要的研究意义和潜在应用价值。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

红景天（自北京索莱宝科技有限公司）。5% BSA封闭液（Solarbio）；AG RNAex Pro RNA 提取试剂，RNA提取辅助试剂（Accurate Biology）；胎牛血清（EVERY GREEN）；1%青霉素/链霉素（Hyclone）；RPMI 1640培养基（Gibco）；4%多聚甲醛（biosharp）； 结晶紫染液（Solarbio）；Opti-MEM^TM I培养基（Gibco）；CCK-8试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、增强型RIPA裂解液、广谱蛋白酶抑制剂混合物（不含EDTA，100×）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（BOSTER）；山羊抗兔IgG H&L（HRP，稀释比例1∶10 000）；Anti-GAPDH抗体-Loading Control（Abcam，稀释比例1∶1250）； OGDHL Polyclonal antibody （稀释比例1∶4000）、PDHB Polyclonal antibody（Proteintech，稀释比例1∶3500）；兔IgG（Beyotime）；ECL超敏basic发光液（Kermey）；免疫沉淀试剂盒（Protein A+G磁珠法）、 BeyoRIP™ RIP Assay Kit（Protein A/G琼脂糖）、 BeyoMag™磁分离架（4孔，1.5 mL/2 mL，蓝）、ATP检测试剂盒（Beyotime）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore）；SYBR Green qPCR试剂盒（SparkJade）； Lipofectamine^TM 2000转染试剂（Invitrogen）； miR-1343-3p mimic、miR-1343-3p inhibitor、miR-1343-3p NC、si-OGDHL、si-NC（Biomics）； 人丙酮酸酶联免疫分析试剂盒、人乙酰CoA酶联免疫分析试剂盒（MEIMIAN）；qPCR引物（Sangon）。

1.2 细胞培养

将南京拜瑞科技有限公司的人胃癌MGC-803细胞（RRID：CVCL_5334）培养于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基（Gibco）中，并放置于37 ℃、5% CO₂的恒温细胞培养箱（Thermo Fisher）中培养。

1.3 红景天苷溶液配制

红景天苷易溶于水溶液中，使用时新鲜配置溶解于RPMI 1640培养基中，稀释至0、2、4、6、8和10 μmol/mL的终浓度，用于后续实验。

1.4 方法

1.4.1 CCK-8法检测细胞活力

将细胞以2.5×10³/孔的数量接种于96孔板中，细胞完全贴壁后分别加入0、2、4、6、8和10 μmol/mL终浓度的红景天苷。每组制备至少3个重复孔。37 ℃、5% CO₂饱和浓度条件下分别培养24和48 h，取上清后加入10 μL CCK-8试剂，使细胞在暗处分别孵育2 h，酶标仪（Thermo Fisher）测各孔光密度A_{450 nm}值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（A_实验组-A_空白组/A_对照组-A_空白组）×100%。

1.4.2 细胞克隆实验

按300 /孔细胞数接种于12孔培养板中，2 d/次更换培养液，细胞生长1~3周，出现肉眼可见的细胞集合体，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染液染色，用数码相机观察和捕捉染色肿瘤细胞集落的图像。采用ImageJ（版本1.52a对数据结果进行量化分析。

1.4.3 RNA分离和实时荧光定量PCR

使用AG RNAex Pro RNA提取试剂从分组处理好的GC细胞中分离总RNA，根据制造商的说明使用逆转录试剂盒将总RNA反转录合成cDNA，使用SYBR Green qPCR试剂盒按照说明书进行实时荧光定量PCR检测。PCR扩增程序如下：94 ℃初始化3 min，94 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s。数据分析采用2^-△△Ct法。使用的引物序列（5'→3'）如表1。

1.4.4 Western blotting

蛋白样品通过SDS-PAGE电泳分离后，转移到PVDF膜（0.45 μm孔径，Millipore）上，200 mA转膜90 min。接着使用5% BSA封闭液（Solarbio）摇床封闭孵育2 h。4 ℃，一抗过夜孵育18 h。常温，二抗（辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔抗体）摇床孵育2 h。化学发光凝胶成像系统（BIO-RAD）检测蛋白条带。ImageJ软件测量蛋白波段强度，灰度值量化分析比较。

1.4.5 细胞转染

收集对数生长期的细胞，将细胞悬液均匀的接种于24孔板（1×10⁵/孔）中培养12 h贴壁，当GC细胞生长汇合度达到60%~70%时进行转染。按照制造商说明书，分别转染miR-1343-3p模拟物（miR-1343-3p mimic）、miR-1343-3p抑制剂（miR-1343-3p inhibitor）、miR-1343-3p模拟物阴性对照（NC mimic）、miR-1343-3p抑制剂阴性对照（NC inhibitor）、靶向OGDHL的小干扰RNA（si-OGDHL）、对照siRNA（si-NC）至总体积为500 μL的RPMI 1640基础培养基中。37 ℃，5% CO₂恒温培养箱中孵育4 h，弃上清加入RPMI 1640完全培养基（无双抗、含10%胎牛血清）继续培养1~2 d后方可用于后续实验。

1.4.6 RNA结合蛋白免疫共沉淀法（RIP）

取对数生长期的GC细胞收集细胞悬液计数，按照说明书，使用lysis Buffer（含终浓度为1 mmol/L的DTT、100 U/mL的RNase Inhibitor和0.2 mmol/L的PMSF）裂解细胞，提取MGC-803细胞的细胞蛋白。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，计算相对结合的一抗的量。利用protein A+G磁珠（Beyotime）与一抗充分偶联后，弃上清加入提取的细胞蛋白，常温4 h摇床孵育，分离出感兴趣的蛋白及与其结合的RNA。用同样的方法检测使用兔IgG抗体从等量蛋白中提纯的RNA，作为阴性对照。使用AG RNAex Pro RNA 提取试剂盒提取共沉淀的RNA，采用qRT-PCR检测RNA中miR-1343-3p的含量。

1.4.7 免疫共沉淀实验（Co-IP）

实验分为Input组、阴性对照IgG组、IP：OGDHL组、IP：PDHB组，取相同对数生长期的细胞，按照说明书，加入Lysis Buffer（含1%蛋白酶抑制剂）充分裂解后提取MGC-803细胞的细胞蛋白，取上清用于后续的实验。BCA蛋白试剂盒检测上清中蛋白浓度后计算各自一抗所需量，TBS稀释抗体浓度后，将抗体与洗好的蛋白磁珠A+G室温翻转孵育1 h确保其充分偶联，免疫共沉淀细胞蛋白。用同样的方法提取兔IgG抗体共沉淀蛋白复合物，作为阴性对照。采用Western blotting检测共沉淀的蛋白复合物中粘连的目标蛋白。

1.4.8 在活体内的致瘤模型

选取4周龄的雌性BALB/c裸鼠，随机分为对照组、治疗组、miR-1343-3p agomir组各5只。所有小鼠按2×10⁶ （150 μL细胞悬液）/只的量皮下注射到腋窝下。根据前期初步结果，采用治疗组每隔1 d腹腔注射红景天苷（100 mg/kg），连续4周，对照组同样腹腔注射PBS。 miR-1343-3p agomir组miR-1343-3p agomir（3mg/kg）采用局部多点注射肿瘤方式转染异种移植肿瘤， 2次/周，连续4周，每周观察肿瘤的生长情况，于治疗后第7、14、21、28天用尺子测量肿瘤大小，计算公式V=（长×宽²）/2。第28天，无痛处死裸鼠，分离肿瘤组织并测量称重。本研究经西藏民族大学伦理委员会审核批准（伦理批号：2024-014）。本研究使用的动物为SPF级裸鼠，雌性，4周龄，购自江苏华创信诺制药科技有限公司，生产许可证编号为SCXK（Su）2020-0009，动物合格证书编号为320928240100203557。

1.4.9 生化试剂盒检测

细胞丙酮酸、乙酰CoA、ATP的相对含量使用相对应的试剂盒进行检测。

1.4.10 miRNA-mRNA数据库的构建及RNA测序分析

详见课题组前期的研究报道^［12］。

1.4.11 蛋白互作网络分析

分别通过TarBase v9.0数据库（https：//dianalab.e-ce.uth.gr/tarbasev9）、TargetScanHuman v8.0数据库（https：//www.targetscan.org/vert_80/）、miRwalk v2.0数据库（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）、GeneCards Version5.23数据库（https：//www.genecards.org/）预测分析胃癌中与miR-1343-3p相互作用的靶mRNA，采用STRING version12.0数据库（https：//cn.string-db.org/）预测分析蛋白质间的相互作用，Cytoscape v3.10.3（https：//cytoscape.org/）对结果进行可视化处理。通过GeneMANIA v3.6.0数据库（https：//genemania.org/）预测靶基因蛋白间的相关性。

1.5 统计学分析

统计分析和可视化均在Graph Pad Prism 9软件与R v4.2.1中进行，本研究中实验均独立重复至少3次，计量资料以均数±标准差表示。两组之间的差异比较采用Student's t-test。多组之间的统计比较采用单因素方差分析检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红景天苷可能通过miR-1343-3p-OGDHL/PDHB轴介导糖代谢重编程抑制胃癌细胞增殖的机制研究

结合生物信息学方法与miRNA-mRNA靶向基因比对，筛选获得了与miR-1343-3p调控密切关联并下调的TCA循环关键酶—OGDHL，通过高通量测序检测红景天苷对人胃癌细胞作用前后miR-1343-3p和OGDHL的表达发现二者呈现明显的负相关（P<0.01，图1A），同时构建了miRNA与OGDHL之间的网络互作图发现miR-1343-3p与OGDHL具有相关性（图1B）。进一步通过Pearson相关性和基因位点分析，显示GC细胞中OGDHL与miR-1343-3p具有负相关性且两者之间具有明确的结合位点（图1C）。RIP证实了miR-1343-3p与OGDHL相互作用（P<0.01，图1D）。

进一步结合miRwalk，TargetScan，Tarbase等数据库分析靶mRNA之间的作用关系，韦恩分析取交集后筛选得到GC细胞中与miR-1343-3p有关的靶mRNA有398个（图2A），由此基于STRING数据库分析靶蛋白之间的相互作用关系筛选到与OGDHL密切关联的糖酵解酶蛋白—PDHB（图2 A）。另外，GeneMANIA数据库也验证OGDHL与PDHB之间存在必然的关联（图2A）。Co-IP实验进一步证实了OGDHL与PDHB相互作用（P<0.01，图2 B）。结合TCGA数据库进一步确定GC组织与正常胃组织之间OGDHL，PDHB差异基因表达变化，结果显示OGDHL和PDHB在GC组织中同步呈现高表达（P<0.01，图2C）。此外，基于GEPIA数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析，利用Kaplan-Meier Plotter评估OGDHL、PDHB的表达水平与GC患者临床结局的相关性发现OGDHL、PDHB高表达患者的总生存时间明显缩短（图2D）。

2.2 红景天苷调控miR-1343-3p-OGDHL/PDHB酶复合物糖代谢通路抑制胃癌细胞的增殖

选取红景天苷处理48 h后，根据IC₅₀（7.72 μmol/mL）选取4、6、8 μmol/mL作为低、中、高药物浓度用于后续实验组（图3 A）。细胞克隆实验证明，随着红景天苷浓度升高，GC细胞的克隆形成能力逐渐减弱（P<0.05，图3B）。采用qRT-PCR、Western blotting与ELISA实验检测红景天苷对人GC细胞中miR-1343-3p、OGDHL、PDHB及丙酮酸、下游产物乙酰CoA和ATP水平的影响，结果发现红景天苷作用后的GC组织中miR-1343-3p上调，伴随OGDHL基因和蛋白的表达明显下调，而PDHB基因表达无明显变化，但PDHB蛋白表达明显下降，底物丙酮酸氧化脱羧减少，堆积致浓度升高，下游产物乙酰CoA和ATP生成明显减少。红景天苷通过上调miR-1343-3p，下调OGDHL基因表达，使PDHB酶蛋白稳态失衡，蛋白表达水平下降，底物丙酮酸堆积，产物乙酰CoA及ATP生成减少，从而干扰GC细胞的糖代谢和能量生成，抑制癌细胞增殖（P<0.05，图3C，图4）。

2.3 miR-1343-3p干预调控胃癌细胞的增殖

设计miR-1343-3p模拟物（miR-1343-3p mimic）、miR-1343-3p抑制剂（miR-1343-3p inhibitor）、NC mimic、NC inhibitor脂质体法转染GC细胞株，采用qRT-PCR测定了miR-1343-3p mimic 、miR-1343-3p inhibitor的转染效率（P<0.01，图5 A）。Western blotting结果发现GC细胞转染miR-1343-3p mimic后，随着miR-1343-3p表达水平的升高，OGDHL mRNA和蛋白的表达明显下调，而PDHB mRNA表达无明显变化，但PDHB蛋白表达量减少；底物丙酮酸堆积，浓度升高，下游产物乙酰CoA和ATP生成减少（P<0.05，图6 ）。

相反，转染miR-1343-3p inhibitor后，随着miR-1343-3p敲低，OGDHL mRNA和蛋白的表达明显上调，尽管PDHB mRNA表达无明显变化，但PDHB蛋白表达量增加；丙酮酸氧化脱羧增加，浓度降低，产物乙酰CoA和ATP生成增多（P<0.01，图7）。功能分析发现，CCK-8和细胞克隆实验证明miR-1343-3p过表达抑制了GC细胞的增殖（P<0.05，图5B、C），敲低后则促进GC细胞增殖（P<0.01，图5D、E）。

2.4 靶向敲低OGDHL抑制胃癌细胞的增殖

转染si-OGDHL后，同样测定了si-OGDHL的转染效率以此来证明转染成功（P<0.05，图8）。功能分析发现，敲低OGDHL基因表达后同样抑制了GC细胞的增殖和形成能力（P<0.05，图9）。miR-1343-3p基因无变化，OGDHL基因和蛋白的表达明显下调，PDHB蛋白表达量随之减少，PDHB基因表达差异无统计学意义；底物丙酮酸堆积，浓度升高，下游产物乙酰CoA和ATP生成减少；红景天苷联合si-OGDHL处理GC细胞，随着miR-1343-3p基因升高，OGDHL基因和蛋白的表达大幅下调，PDHB基因表达无明显变化，但PDHB蛋白表达量显著减少，丙酮酸大量堆积，下游产物乙酰CoA和ATP生成大幅减少（P<0.05，图10）。

2.5 体内验证红景天苷调控miR-1343-3p-OGDHL/PDHB糖代谢通路抑制胃癌细胞生长

与体外实验结果一致，在活体内，与对照组相比，随着肿瘤周期的延长，瘤块不同程度被红景天苷和miR-1343-3p agomir抑制，瘤块质量明显减轻（P<0.01，图11）。与对照组相比，我们发现药物组与miR-1343-3p agomir组不同程度上调miR-1343-3p，OGDHL基因和蛋白的表达降低，PDHB基因则无明显变化，但其蛋白的表达降低，致使底物丙酮酸积聚导致乙酰CoA和ATP的生成减少（P<0.05，图12）。

3 讨论

红景天苷作为红景天的主要成分，所涉及到的药用价值尤为广泛，是一种具有多种用途的天然植物产品，抗肿瘤一直是目前红景天苷的热点研究领域^［22］。肿瘤细胞的持续生长得益于代谢重编程过程^［23］，其中代谢酶及其相关通路的异常激活或功能失调被视为驱动肿瘤恶性发展的关键因素^［24］。糖代谢在肿瘤发生发展中一直被认为发挥着不可替代的作用。癌细胞相对于正常细胞需要更多的碳作为燃料来维持较高的生长速度^［25］。传统的观点认为，肿瘤中的糖代谢多数表现为有氧糖酵解，1956年，Warburg^［8］发现癌细胞获得能量的主要来源是有氧的条件下的糖酵解水平，虽然这种产能相对于线粒体氧化来说并不是很多，但是迅速提供能量供给成为了肿瘤生长优先考虑的目的。研究发现，lncRNA HAGLR通过海绵吸收miR-338-3p下调LDHA糖酵解轴逆转GC细胞对5-Fu的耐药性^［26］。miR-613通过靶向下调PFKFB2抑制GC细胞有氧糖酵解而发挥肿瘤抑制作用^［27］。若只考虑Warburg效应，那么癌细胞与基质细胞之间或癌细胞与癌细胞之间的相互作用可能会被忽略掉。研究发现，常氧癌细胞可以利用肿瘤微环境应激癌症相关成纤维基质细胞产生乳酸，这种现象被称为“反向Warburg效应”，简单的说，有氧糖酵解与线粒体氧化呼吸共同协同为肿瘤的生长提供能量，而不仅仅是普遍意义上的有氧糖酵解发生时造成不可避免的线粒体损伤，阻碍线粒体氧化的进程^［28］。同时为了维持能量稳态，癌细胞必须消耗大量的葡萄糖，仅仅依赖有氧糖酵解产生的能量是远远不够的。众所周知有氧糖酵解消耗每个葡萄糖的净产量仅为2 mol ATP，而完全氧化一个葡萄糖分子的总产量则为32-33个ATP^［29］。尽管葡萄糖被普遍认为是主要的循环碳源，但是乳酸的循环周转通量超过葡萄糖的周转通量达2.5倍^［30］，因此相较于葡萄糖而言，乳酸是大多数肿瘤中主要的TCA循环底物^［31］。能量代谢产物对细胞、组织之间的循环周转通量具有很大的贡献，通过交换这些代谢产物（如乳酸、丙酮酸等）使糖酵解和TCA循环协同作用在细胞中分解代谢。

以往的研究发现，OGDHL与PDHB等重要的代谢关键酶蛋白分子在卵巢癌（OC）中表达上调，二者之间是否存在直接相互作用关系并未得到充分证实，本研究首次发现了参与TCA循环的关键代谢酶——OGDHL与连接糖酵解和TCA循环的关键代谢酶——PDHB蛋白之间相互作用证实二者通过动态调控TCA循环与Warburg效应的代谢平衡，维持GC细胞代谢重编程的核心机制^［21］。在本研究中，敲低OGDHL表达，观察到PDHB蛋白表达显著降低，然而PDHB的基因表达无任何明显变化，基于先前的研究证明代谢酶蛋白之间能够通过激活泛素-蛋白酶体系统影响细胞的泛素化水平^{［32，33］}，泛素化是影响蛋白质稳定的最常见的生物学机制^{［34，35］}。课题组推断OGDHL的表达下调可能激活泛素-蛋白酶系统，刺激GC细胞泛素化水平升高降解PDHB蛋白的表达，导致底物丙酮酸堆积，产物乙酰CoA减少，氧化磷酸化减弱，ATP生成减少，从而干扰GC细胞的糖代谢和能量生成而抑制癌细胞增殖。

红景天苷能够抑制GC细胞的增殖，但其通过调控糖代谢作用于GC细胞增殖的抑制机制并未有明确报道。本研究基于miR-1343-3p-OGDHL/PDHB-丙酮酸糖代谢轴对肿瘤能量供给提供了进一步认知，即肿瘤细胞能量生成呈现有氧糖酵解-TCA循环-氧化磷酸化动态协同模式，而非Warburg效应单极主导的传统认知。本研究首次发现红景天苷通过miR-1343-3p调控OGDHL/PDHB轴诱导糖代谢失衡，证明了miR-1343-3p能够与OGDHL靶向结合，miR-1343-3p对OGDHL有抑制作用，同时OGDHL与PDHB之间存在相互作用关系。上调miR-1343-3p可靶向抑制OGDHL表达，破坏OGDHL/PDHB酶复合体功能，导致丙酮酸-乙酰CoA代谢稳态失衡，阻断Warburg效应与TCA循环协同，显著降低ATP生成，抑制胃癌细胞增殖与迁移。本研究通过体外实验和体内荷瘤裸鼠模型，依托于miR-1343-3p干预与敲低OGDHL对GC细胞的糖代谢调控机制进行多角度验证，miR-1343-3p mimic/agomir组能够模拟红景天苷作用，抑制OGDHL表达并重现代谢紊乱（丙酮酸堆积、乙酰CoA减少）；miR-1343-3p inhibitor组可逆转红景天苷对OGDHL/PDHB的抑制作用，恢复丙酮酸代谢与ATP生成；si-OGDHL组可模拟红景天苷效应，且联合用药进一步加剧代谢阻断，增强抗癌效果。

综上所述，本研究发现红景天苷基于糖代谢重编程诱导miR-1343-3p-OGDHL/PDHB酶复合体-丙酮酸糖代谢通路稳态失衡，干扰GC细胞能量生成，进而抑制GC细胞增殖的重要作用机制。对于深入挖掘miRNA调控下的糖代谢重编程关键酶及其代谢通路的关键节点，进一步阐释胃癌细胞的糖异常代谢及其进展具有重要的研究意义和潜在的应用价值。

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