牛蒡子治疗小鼠病毒性肺炎后肺纤维化的机制：基于代谢组学、网络药理学和实验验证方法

Therapeutic mechanism of Arctium lappa extract for post-viral pneumonia pulmonary fibrosis: a metabolomics, network pharmacology analysis and experimental verification

摘要

目的 应用代谢组学、网络药理学及实验验证探究牛蒡子治疗病毒性肺炎后肺纤维化（PPF）的作用机制。 方法 采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术鉴定牛蒡子提取物化学成分，SPF级小鼠随机分为4组，8只/组，分别为空白组（Ctrl）、模型组（BLM）、AL低剂量组（ALL）、AL高剂量组（ALH）。采用博来霉素气管给药模式建立小鼠肺纤维化模型，给予牛蒡子治疗后，记录体质量变化、观察HE及MASSON染色的肺组织病理变化。通过代谢组学分析筛选差异代谢物及相关代谢通路。基于OMIM、TTD、Gene Cards等数据库获取病毒性肺炎与肺纤维化的共同靶点，通过PPI、GO、KEGG富集分析及分子对接筛选核心靶点和有效成分，并构建“基因-代谢物”调控网络；Western blotting技术检测相关基因信号蛋白表达水平。 结果 鉴定出牛蒡子化学成分53个，牛蒡子可显著改善肺纤维化小鼠的体质量下降、肺组织炎症浸润（P<0.05）以及纤维化（P<0.05）。差异代谢物主要富集在柠檬酸代谢、磷酸戊糖途径、糖酵解途径、色氨酸代谢、谷氨酸代谢、谷胱甘肽途径等能量代谢途径，调控了能量代谢途径中间产物的产量。筛选出23个关键活性成分（以木脂素、酚酸等为主）和82个核心靶点，涉及PI3K/AKT、HIF-1、MAPK、Foxo等非经典Smad信号通路，“基因-代谢物”调控网络显示非经典Smad信号途径中的基因参与到了能量代谢的调节。并且牛蒡子调控Fibronectin、Vimentim、Snail、E-cadherin、N-cadherin等上皮-间质转化（EMT）进程的标志蛋白（P<0.05），抑制MAPK信号通路激活。 结论 牛蒡子通过调控能量代谢抑制EMT治疗纤维化，并且涉及调控MAPK等非经典Smad信号通路，为牛蒡子治疗PPF的临床应用及后续研究提供理论支持。

Abstract

Objective To explore the therapeutic mechanism of Arctium lappa extract for treatment of Post-Viral Pneumonia Pulmonary Fibrosis (PPF). Methods The chemical constituents of Arctium lappa extracts were identified using UHPLC-Q-TOF-MS/MS. Mouse models of pulmonary fibrosis established by tracheal instillation of bleomycin were treated with Arctium lappa extract, and body weight changes were recorded and lung tissue pathology was examined using HE and Masson staining. Metabolomics analysis was used to identify the differential metabolites and the associated metabolic pathways in the treated mice. The common targets of viral pneumonia and pulmonary fibrosis were acquired from the publicly available databases, and the core targets and active constituents were screened using the protein-protein interaction (PPI) network, GO and KEGG enrichment analyses, and molecular docking, and a "gene-metabolite" regulatory network was constructed. The expressions of the core targets were detected in the lung tissues of the treated mice using Western blotting. Results Fifty-three chemical constituents were identified from Arctium lappa extract. In the mouse models of pulmonary fibrosis, treatment with Arctium lappa extract significantly improved weight loss and ameliorated lung inflammation and fibrosis. The differential metabolites in the treated mice were enriched in energy metabolism pathways involving citrate cycle, pentose phosphate pathway, glycolysis, tryptophan metabolism, glutamate metabolism and glutathione metabolism, which regulated the production of energy metabolism intermediates. Twenty-three key active compounds (mostly lignans and phenolic acids) and 82 core targets were screened, which were associated with the non-canonical Smad signaling pathways (including PI3K/AKT, HIF-1, MAPK, and Foxo) that participated in the regulation of energy metabolism. Arctium lappa extract also regulated the expressions of epithelial-mesenchymal transition (EMT)‑related proteins (fibronectin, vimentim, and Snail, etc.) and inhibited MAPK signaling pathway activation. Conclusion Preliminary findings suggest that Arctium lappa treats fibrosis by regulating metabolism to inhibit EMT and involves the modulation of non-canonical Smad signaling pathways, such as MAPK providing theoretical support for its clinical application and further research in treating PPF.

Graphical abstract

关键词

牛蒡子 / 病毒性肺炎后肺纤维化 / 网络药理学 / 代谢组学 / MAPK

Key words

Arctium lappa / post-viral pneumonia pulmonary fibrosis / network pharmacology / metabolomics / MAPK

病毒性肺炎是由病毒感染肺实质引起的肺部炎症，病毒通过直接损伤或持续的免疫反应引起肺损伤^［1］，肺损伤后的异常修复可导致肺纤维化（PF）^［2］。多种病毒感染后，尸检中组织病理学可见肺纤维化改变^［3］，COVID-19重症肺炎康复后约1/3现肺纤维化改变^［4］，流感病毒、禽流感病毒、SARS等病毒对肺部造成长期损害，许多患者残留肺纤维化^{［5， 6］}。目前认为肺泡上皮细胞损伤、成纤维细胞异常活化和细胞外基质大量沉积是病毒性肺炎后纤维化主要发病机制^{［7， 8］}。第 9 版国际疾病分类标准将病毒性肺炎后肺纤维化归类为炎症后肺纤维化。肺纤维化是一组慢性、进行性、弥漫性的间质性疾病，临床表现呼吸困难和肺功能进行性下降，治疗手段有限，预后较差^［9］。美国食品和药物管理局在2014并批准吡非尼酮和尼达尼布应用于肺纤维化治疗，但它们不能完全阻止或改善肺功能下降，并且有胃肠道不耐受和皮肤过敏等不良反应，限制了这些药物的应用^［10］。目前肺纤维化的唯一根治策略是进行肺移植，但供体器官数量有限、费用昂贵、移植后排斥等弊端影响了该策略的应用。因此，伴随着新冠的预后肺纤维化问题的日益凸显，亟需研发新的策略去预防和更有效地逆转该疾病。

近年来，中药通过多成分、多靶点治疗肺纤维化受到越来越多的关注^［11］。中医认为肺纤维化属于“肺痹”、“肺萎”等范畴，大多学者认为本病病机以本虚标实为主，本虚为肺脾肾亏虚，标实为痰瘀毒邪内蕴，始于肺气失宣，邪毒内伏，终至脾肾亏虚^［12］。牛蒡子性偏寒凉，味辛、苦，归肺、胃经，具有疏散风热、宣肺祛痰、利咽透疹、解毒消肿等功效。牛蒡子具有广谱的抗病毒活性，包括流感病毒、人腺病毒3型、疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒等，也是经典名方“银翘散”中的要药^{［13， 14］}。目前未见牛蒡子用于病毒性肺炎后肺纤维化研究的报道，故本研究通过超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联用技术（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）对牛蒡子的化学成分进行系统分析，体内外模型评估牛蒡子治疗肺纤维化的效果，代谢组学分析筛选差异代谢物及相关代谢通路，并基于网络药理学、分子对接和实验验证探讨潜在作用靶点与可能分子机制，为牛蒡子的临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

牛蒡子（AL）为市售药材（广东时珍制药有限公司），甲醇、甲酸（色谱纯，Merck）；实验用水由 Milli-Q 净水系统制备。博来霉素（MedChemExpress）。人源肺泡上皮细胞（A549）来源于ATCC。DMEM/F12培养基、胎牛血清（GIBCO）；TGF-β1（Millipore）；蛋白酶抑制剂、RIPA裂解液（碧云天）；磷酸酶抑制剂（凯基生物）；Loading Buffer（广州捷倍斯生物科技有限公司）；抗E-cadherin抗体、抗N-cadherin抗体、抗Vimentin 抗体、抗ERK抗体、抗PERK抗体、抗β-ACTIN抗体、抗GAPDH 抗体、抗Snail抗体、抗Fibronectin抗体均为单克隆抗体、羊抗兔二抗（CST）。

1.2 主要仪器

1290型液相色谱串联6545型四级杆-飞行时间质谱仪（安捷伦）；Milli-Q Synthesis超纯水仪（德国 Merck 公司）；PS-40超声仪（巩义予华）；5430R型高速离心机（艾本德）；显微镜（徕卡）；Western blotting电泳系统（伯乐）。

1.3 实验动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠32只，8周龄，体质量20±2 g，购于广东省动物中心，许可证号：SCXK（粤）2022-0002。所有动物实验均经广州医科大学动物委员会批准（伦理批号：20240372）。

1.4 方法

1.4.1 药物制备

称取牛蒡子药材100 g，加入2.5 L水浸泡30 min，煮沸后文火煎煮1 h，药液倒出冷却；加入1.5 L水煮，煮沸后文火煎煮1 h，倒出第2次煎液；再加入1 L水煎煮，煮沸后文火煎煮1 h，倒出第3次煎液；合并3次煎液，冷冻干燥制成冻干粉11.2 g。

1.4.2 UHPLC-Q-TOF-MS/MS牛蒡子化学成分分析

1.4.2.1 供试品制备 称取“1.4.1”项下AL粉末用甲醇配置成1 mg/mL的溶液，超声30min后进行4 ℃离心（14 000 r/min×10 min），后取上清进行分析。

1.4.2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent EclipsePlus C₁₈ RRHD色谱柱（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；流动相：0.1% 甲酸水（A）-甲醇（B），色谱洗脱梯度（0~1 min，15% B；1~5 min，15%~30% B；5~30 min，30%~70% B；30~35 min，70%~95% B；35~45 min，95% B），后运行时间为 5 min；流速0.4 mL/min；柱温 40 ℃；进样体积1 μL，检测波长254 nm。

1.4.2.3 质谱条件

采用电喷雾离子源（Dual AJS ESI），分别在正、负离子模式下采集数据，数据采集范围m/z： 50~1700，干燥气温度：320 ℃；干燥气流速8 L/min；毛细管电压3500 V；雾化气压力 45 Psi；鞘气流速11 L/min；鞘气温度350 ℃；碎片电压130 V；碰撞能量10、20、40 V。

1.4.3 动物实验

1.4.3.1 动物分组与取材

适应性饲养1周后，将小鼠随机分为4组，8只/组，分别为空白组（Ctrl）、模型组（BLM）、AL低剂量组（ALL）、AL高剂量组（ALH）。采用单次经气管插管给予浓度为2 mg/kg博莱霉素造模。造模前2 d开始给药，空白组和模型组不做任何处理；根据人与小鼠体表面积换算，其余各组分别予AL低剂量（800 mg/kg）、AL高剂量（1600 mg/kg）药液，灌胃体积为0.2 mL。连续给药29 d后处死小鼠，取肺组织，所有小鼠均取左肺置于4%多聚甲醛中固定，右肺置冻存管中液氮快速冷冻，后移至-80 ℃超低温冰箱保存；留取小鼠血浆样品，检查血浆中代谢物，样品用甲醇沉淀蛋白，离心后取上清检测。

1.4.3.2 组织病理学

小鼠肺组织置于4%多聚甲醛固定24 h后常规脱色、石蜡包埋，取肺切片（4 μm）进行HE染色和Masson染色。

1.4.3.3 Western blotting

取肺组织冰上剪碎后加入适量 RIPA 溶液（含蛋白酶及磷酸酯酶混合抑制剂）进行裂解，15 000 r/min离心15 min 后取上清，用 BCA 法测定蛋白浓度，上清中按比例加入上样缓冲液后置于沸水浴中煮10 min。随后用10%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳分离，并将蛋白转移至膜上。转膜完成后，使用5%的脱脂牛奶在室温下封闭2 h。将膜在4 ℃下与一抗（1∶1000）孵育过夜，次日使用TBST缓冲液洗膜（3次，7 min/次）后进行二抗（1∶5000）孵育，摇床上室温孵育2 h后再次使用TBST缓冲液洗膜（3次，7 min/次），最后相应条带通过ECL发光试剂盒在化学发光成像系统下显影。图片采用Image J 软件进行灰度值分析。

1.4.4 代谢组学分析

1.4.4.1 样品制备

A549细胞以10⁶/孔接种到6孔板，5%CO₂、37 ℃孵育48 h后，根据实验要求分为空白组、模型组（TGF-β1 20 ng/mL）、牛蒡子治疗组（AL 1000 μg/mL+ TGF-β1 20 ng/mL）。24 h后用冷的PBS洗2遍，刮取细胞转移至1.5 mL的EP管，4 ℃离心（14 000 r/min×10 min）收集细胞样品。每个样品中加入预冷的提取液（乙腈/甲醇/水=4∶4∶2），超声提取10 min后吸取上清上机检测。

1.4.4.2 色谱条件

色谱柱：ACQUITY BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相A：15 mmol/L乙酸铵-0.3%氨水-水，流动相B：15 mmol/L乙酸铵-0.3%氨水-乙腈-水（9：1），色谱洗脱梯度（0~8 min，90%~50% B；8~10 min，50% B；10~11 min，50%~90% B；11~20 min，90% B）。流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样体积5 μL。

1.4.4.3 质谱条件

采用电喷雾离子源（Dual AJS ESI），正负离子模式采集数据，数据采集范围m/z：50~1200，干燥气温度：280 ℃；干燥气流速 8 L/min；毛细管电压3500 V；雾化气压力45 Psi；鞘气流速 10 L/min；鞘气温度325 ℃；碎片电压140 V。

1.4.4.4 数据分析

将采集的液质数据导入Profinder软件，提取保留时间、质荷比、峰面积等数据，对峰面积进行归一化处理，导入MPP软件，进行多元统计分析，以P<0.05为标准筛选差异代谢物，并结合人类代谢组数据库HMDB和质谱数据库Massbank等鉴定差异代谢物，再将所得差异代谢物进行通路富集分析。

1.4.5 网络药理学

1.4.5.1 牛蒡子活性成分靶点预测

基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS 的结果，筛选出牛蒡子的活性成分作为候选化合物。利用PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找候选化合物的“Canonical SMILES”并下载候选化合物的SDF 格式文件，使用候选化合物的“Canonical SMILES”在Swiss Target prediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）进行靶点预测，靶点筛选条件为“Probability>0”，去重后合并所有预测靶点。

1.4.5.2 获取疾病靶点

分别以“Viral Pneumonia”、“Pulmonary Fibrosis”为检索词在OMIM数据库（https：//www.omim.org/）、TTD 数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/）、 GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）中检索疾病靶点，剔除重复的疾病靶点，最终获得疾病靶点数据库。

1.4.5.3 关键靶点预测

把疾病靶点输入Venny 2.1 平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），获得疾病共同靶点；然后疾病共同靶点和牛蒡子靶点取交集，得到牛蒡子治疗PPF的关键靶点。

1.4.5.4 牛蒡子治疗PPF的关键靶点PPI网络

将关键靶点输入STRING数据库，最低相互作用分数设置大于0.9，物种选择为“Homo sapiens”，构建PPI网络，导出TSV格式数据，然后输入Cytoscape 3.9.1软件，对连接度等参数进行分析，获取PPI网络中的核心靶点。

1.4.5.5 “活性成分-关键靶点”网络构建

将关键靶点和活性成分导入 Cytoscape 3.9.1 软件，通过“Layout”、“Fill Color”、“Node Shape”、“Mapping Type”、“Transparency”等优化网络图，导出“活性成分-关键靶点”网络图。

1.4.5.6 GO功能及KEGG通路富集分析

将关键靶点输入Metascape数据库进行 KEGG通路富集分析及GO功能，物种选择为“Homo sapiens”，阈值P设定小于0.05，并通过微生信网站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）对富集分析结果进行可视化处理。

1.4.5.7 分子对接验证

把关键靶点输入Uniprot数据库，选择物种为“Homo sapiens”，获取到关键靶点的Uniprot号，从蛋白质结构 PDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）查询Uniprot号获得关键靶点的 PDB 文件格式。运用 Autodock Vina软件进行分子对接，然后使用Pymol对结果进行可视化分析。

1.4.6 细胞实验

1.4.6.1 细胞分组

空白组（Ctrl）、TGF-β1+20 ng/mL组（T）、TGF-β1+AL 1000 μg/mL（TAH）、TGF-β1+AL 800 μg/mL（TAL）、AL 1000 μg/mL（CAH）、AL 800 μg/mL（CAL）。各组细胞于6 孔板中处理24 h后，使用RIPA 裂解缓冲液提取总蛋白。通过BCA 蛋白定量试剂盒测定各组样品的蛋白浓度，并确保每一样品蛋白等量上样。按照“1.4.3.3”项的条件进行蛋白质免疫印迹实验。

1.4.6.2 CCK-8法检测细胞增殖

A549细胞处于对数生长期，常规消化、计数，按500/孔铺96孔板，24 h后换含有不同药物浓度的完全培养基继续培养48 h，然后加入10 μL/孔的CCK8溶液，在培养箱中孵育0.5 h后酶标仪测吸光度A_{450 nm}。AL药物浓度设为100、200、400、800、1600、3200 μg/mL，另外设置空白对照组，每组6个复孔，周围每孔加100 μL的PBS溶液。

1.4.7 统计学分析

使用Graphpad Pism 9.5软件进行统计学分析，计量数据以均数±标准差表示；符合正态分布的多组间比较使用单因素方差分析，方差齐用Bonferroni检验，方差不齐则用Dunnett检验；不符合正态分布则用秩和检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 牛蒡子化学成分分析

通过UHPLC-Q-TOF-MS/MS 鉴定出牛蒡子中53个化合物（表1），牛蒡子提取物的总离子流图见图1，牛蒡子以木脂素、酚酸为主要化学成分。然后根据质谱总离子流图中响应较高的23个成分（注释为NBZ1等）进行网络药理学研究。

2.2 牛蒡子抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化

BLM组与Ctrl 组相比体质量下降，治疗组造模初期体质量下降、后期体质量逐渐回升（图2A）。此外，与Ctrl组相比，BLM组小鼠肺组织外观可见明显水肿、颜色变深，治疗组水肿明显好转（图2B）。病理HE染色显示，与Ctrl组小鼠肺组织相比，BLM组小鼠肺泡结构完整性丧失，肺泡间隔增厚，并伴有大量的炎性细胞浸润。治疗组肺泡结构较为完整，肺泡间隔变薄，炎性细胞浸润减少，病理评分改善（P<0.05，图2C）。Masson染色结果显示，与Ctrl组比较，BLM组小鼠肺间质可见大量的蓝色胶原纤维沉积，纤维化程度严重，治疗组改善了纤维化程度及Ashcroft评分（P<0.05，图2D）。

2.3 牛蒡子在体外调控TGF-β1诱导的能量代谢

正负模式下OPLS-DA散点图均发现空白组（Ctrl）、TGF-β1、牛蒡子治疗组（TAH）各组有显著的分离，组内样品具有比较好聚集性，各组样本代谢物具有显著差异（图3A、B）。正负模式的聚类热图显示了前25个差异代谢物不同组的差异表达，与空白组比较，TGF-β1组存在上调或下调的代谢物，通过AL的干预这些代谢物得到一定程度的恢复（图3C、D）。对上述差异代谢物进行代谢通路富集分析，主要富集在嘌呤代谢、柠檬酸代谢、磷酸戊糖途径、糖酵解途径、色氨酸代谢、谷氨酸代谢、谷胱甘肽途径等能量代谢及相关途径（图3E）。检测上述代谢途径的中间产物丰度，发现模型组中乳酸、6-磷酸-葡萄糖、1-磷酸-葡萄糖等明显上调，富马酸盐、L-色氨酸、谷氨酸等在模型组中下调，AL回调了上述代谢物紊乱（P<0.05，图3F）。

2.4 牛蒡子调控博来霉素诱导的代谢产物紊乱

通过代谢组学技术检测小鼠血浆代谢途径中间产物，主要涉及糖酵解途径、柠檬酸代谢、磷酸戊糖代谢和氨基酸代谢等过程，与空白组比较，苹果酸、乳酸、6-磷酸-葡萄糖、1-磷酸-葡萄糖、谷氨酰胺等在模型组上升，富马酸盐、L-色氨酸、L-犬尿氨酸等在模型组下调，AL治疗恢复了上述差异代谢物紊乱（P<0.05，图4）。

2.5 牛蒡子治疗病毒性肺炎后肺纤维化的网络药理学结果

获得1459个病毒性肺炎和1337个肺纤维化疾病靶点，牛蒡子关键活性成分靶点515个。通过韦恩分析，共获得557个疾病共同靶点（图5A）；疾病共同靶点与牛蒡子关键成分靶点取交集，共获得82个关键靶点（图5B）。牛蒡子治疗病毒性肺炎后肺纤维化关键靶点 PPI 网络涵盖了229条靶蛋白相互作用连线、75个靶点蛋白，STAT3、SRC、PIK3CA、HSP90AA1、AKT1等为核心靶点（图5C）。牛蒡子活性成分-关键靶点网络有101个节点、200条边构成（图5D），根据度值大小排序，前十位关键活性成分为：异牛蒡酚A、拉帕酚A、拉帕酚D、罗汉松脂素、牛蒡子苷元、亚油酸、拉帕酚F、羟基香豆素、咖啡酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸。关键靶点GO功能富集分析结果显示1518条生物过程、103条细胞组分以及119条分子功能，根据P值筛选出前10位的GO条目作图（图5E）。关键靶点KEGG通路富集分析获得177条信号通路，其主要涉及PI3K/AKT信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、FoxO信号通路等信号通路（图5F）。

2.6 分子对接结果

以 PPI 网络中5个度值较高的靶点作为本研究关键靶点，分别为AKT1、STAT3、SRC、HSP90AA1、PIK3CA。分子之间的结合能越小代表蛋白质与分子结合越紧密，结合能<-5 kcal/mol 时表示分子与蛋白存在结合能力。选择核心靶点与活性成分进行对接（表2）。选取结合能最小的3个进行可视化（图6）。

2.7 网络药理学与代谢组学整合分析

将筛选得到的42个差异代谢物与网络药理学得到牛蒡子与病毒性肺炎后肺纤维化82个关键靶点导入Metabo Analyst 6.0进行分析，构建“代谢物-靶点基因”网络，显示网络药理学筛选的SRC、AKT1等核心靶点参与了代谢物的调节（图7）。

2.8 牛蒡子调控TGF-β1诱导的A549细胞MAPK信号通路和EMT进程相关蛋白表达

在EMT过程中，上皮细胞标志物E-cadherin表达降低，间质细胞标志物如N-cadherin、Vimentin等表达升高，Snail驱动EMT进程，Fibronectin促成组织重塑。应用Western blotting检测TGF-β1刺激A549细胞的蛋白信号，与空白组比较，T组E-cadherin蛋白表达下调（P<0.05），N-cadherin、Vimentin、Snail、Fibronectin等蛋白表达上调（P<0.05）；AL治疗抑制了N-cadherin、Vimentin、Snail、Fibronectin蛋白表达，上调了E-cadherin蛋白表达（图8 A）。MAPK作为非经典Smad信号通路之一，TGF-β1刺激A549细胞后发现PERK明显升高，AL可抑制ERK的磷酸化水平（P<0.05，图8B）。CCK8法检测各组A549细胞活力，100~3200 μg/mL的牛蒡子处理A549细胞48 h，细胞活力均超过50%（图8C）。

2.9 牛蒡子调控了BLM诱导的EMT进程和MAPK信号通路

在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化中，使用Western blotting检测肺组织蛋白，Vimentin、Snail、Fibronectin等蛋白在模型组中明显上调，而E-cadherin蛋白表达明显下调，经AL治疗后恢复了上述蛋白的表达水平（P<0.05，图9A）。并且ERK磷酸水平在模型组中明显升高，ALH组显著抑制了该蛋白的磷酸化（P<0.05，图9B）。

3 讨论

PPF是病毒感染后的严重后遗症之一，患者出现呼吸功能障碍、运动耐力下降等，甚至呼吸衰竭，是导致临床预后不佳的重要因素^{［47， 48］}。本研究通过UHPLC-Q-TOF-MS/MS 鉴定了牛蒡子化学成分，动物实验表明牛蒡子可以改善小鼠肺纤维化，运用代谢组学技术分析差异代谢物及代谢通路，应用网络药理学筛选核心成分及靶点，分子对接技术进行验证；牛蒡子调控MAPK信号通路和EMT标志性蛋白的表达，初步揭示了牛蒡子治疗PPF的可能作用机制。

在肺纤维化的病理进程中，成纤维细胞、肺泡上皮细胞以及免疫细胞的代谢发生显著改变，这些代谢重编程不仅驱动了纤维化的发生与发展，还可能加剧组织损伤和炎症反应^［49］。在肺纤维化患者出现的Warburg效应可导致糖酵解代谢重编程^［50］，通过影响TGF-β1信号转导增加了葡萄糖转运蛋白、糖酵解限速酶表达，以更快的速率生成ATP满足细胞能量需求，大量中间代谢物（如乳酸盐、丙酮酸等）积累，导致上皮-间充质转化、细胞外基质沉积、成纤维化细胞活化、肌成纤维细胞分化以及巨噬细胞功能改变，促进肺纤维化的形成^{［51， 52］}。研究显示糖酵解抑制剂2-DG和PFKFB3抑制剂（糖酵解途径的关键调控因子）可以减少PI3K-Akt-mTOR/PFKFB3 通路激活，有效抑制糖酵解，减少胶原蛋白合成从而治疗肺纤维化^［53］。本研究发现，差异代谢物通路富集分析显示调控糖酵解途径，肺纤维化小鼠血浆的乳酸、6-磷酸-葡萄糖、1-磷酸-葡萄糖等糖酵解代谢物在模型组增加，牛蒡子减少了这些代谢物产生，因此牛蒡子可能通过调控糖酵解途径发挥抗肺纤维化作用。

柠檬酸代谢是生命活动的主要产生能量途径，糖酵解途径或脂肪酸的β-氧化途径生成的乙酰辅酶A进入线粒体，然后乙酰辅酶A经过氧化磷酸生成ATP。乙酰辅酶A、琥珀酸、延胡索酸、α-酮戊二酸等中间代谢产物的失衡可促进细胞外基质（ECM）的合成和沉积、促炎细胞因子的释放、氧化应激以及成纤维细胞异常增殖和抗凋亡，从而诱导、加重肺纤维化^{［54， 55］}。调控柠檬酸代谢重编程已成为潜在治疗靶点，富马酸二甲酯是中间代谢产物富马酸盐的一种细胞渗透性酯衍生物，经该药物治疗后小鼠肺Nrf2表达上调，抗氧化能力增强，可以减少炎症、氧化损伤和细胞外基质沉积^［56］。本研究应用代谢组学检测差异代谢物，检测出富马酸盐、苹果酸、乙酰辅酶A等代谢物在正常组与模型组发生显著性变化，牛蒡子能够回调这些代谢变化，提示牛蒡子通过改善柠檬酸代谢紊乱抗肺纤维化。

色氨酸代谢由犬尿氨酸途径、5-羟色胺途径和肠道菌群代谢等组成，色氨酸作为必需氨基酸，是多种生物活性化合物的合成前体；犬尿氨酸途径作为色氨酸代谢的主要途径，疾病条件下，各种细胞因子增强色氨酸代谢限速酶（IDO）的活性，色氨酸代谢出现增加，参与炎症反应、氧化应激、免疫反应和纤维化等病理进程。犬尿氨酸通过抑制成纤维细胞功能，有效地保护小鼠免受博来霉素诱导的肺纤维化^［57］；色氨酸代谢物5-甲氧基色氨酸在体内改善小鼠的肺功能，减轻肺泡结构的破坏和胶原蛋白沉积，通过调控PI3K/AKT信号通路抑制肺纤维化^［58］。本研究发现模型组小鼠色氨酸、犬尿氨酸产量下调，这些代谢物水平可以被牛蒡子恢复，推测牛蒡子可能通过色氨酸-犬尿氨酸途径治疗肺纤维化。

谷氨酰胺代谢涉及多种纤维化疾病，包括肝纤维化、肾纤维化和肺纤维化等，该代谢途径调控肌成纤维细胞分化和细胞外基质的产生，其中谷氨酰胺参与甘氨酸和脯氨酸合成，脯氨酸是合成胶原蛋白的重要成分，而且谷氨酰胺转化为谷氨酸是TGF-β1促进胶原蛋白合成所必需的^［59］。本实验发现牛蒡子对谷氨酰胺代谢物（谷氨酰胺）有明显调节作用，提示牛蒡子抗肺纤维化与谷氨酰胺代谢相关。

由此可见，牛蒡子通过靶向糖酵解代谢、柠檬酸代谢、色氨酸代谢、谷氨酰胺代谢等多条代谢通路抑制肺纤维化；在促纤维化微环境下，糖酵解提高了乳酸产量，造成柠檬酸代谢中间产物的不足，乳酸间接增强谷氨酰胺代谢补偿能量和生物合成需求，色氨酸代谢产物参与调控柠檬酸循环速率，而且α-酮戊二酸在将谷氨酰胺代谢途径与柠檬酸代谢联系起来方面起着重要的作用。因此，糖酵解、柠檬酸循环、谷氨酰胺代谢和色氨酸代谢等代谢重编程相互交织，共同调控纤维化发生发展。

本研究网络药理学及分子对接还发现AKT1、STAT3、SRC、HSP90AA1、PIK3CA等核心靶点是牛蒡子治疗PPF的关键靶点，这些蛋白主要富集在TGF-β1介导的非经典Smad信号通路，诱导上皮细胞转变为间充质细胞，引发肺纤维化。已知PI3K/AKT通过活化的AKT激活HIF-1a，使AEC转化为成纤维细胞促进EMT进程，AKT/FOXO 信号通路上调促纤维化细胞因子、TGF-β1和IL-13的产生，促进肺纤维化^［60-62］；抑制TGF-β1介导的STAT3、MAPK、HSP90信号通路激活可以阻断成纤维细胞中胶原蛋白的释放、ECM合成和EMT，有效抑制肺纤维化^［63-65］。本研究体内外实验显示牛蒡子能够有效抑制肺纤维化小鼠的EMT，与抑制MAPK等非经典Smad信号通路的激活相关。非经典Smad信号通路与细胞能量代谢之间的相互作用日益受到关注，激活通路下游的转录因子和蛋白信号可以增加代谢途径中葡萄糖、谷氨酰胺的摄取以及调控关键代谢酶表达，这些改变不仅影响成纤维细胞的活化和增殖，还在调节细胞的代谢状态、能量供应和EMT进程中起着重要作用^{［52， 66］}。因此，牛蒡子可能通过调控非经典Smad信号通路介导的能量代谢重编程抗纤维化。

本研究仍存在一定局限性。由于病毒感染导致的肺纤维化模型涉及不同的病毒种类，如流感病毒、中东冠状病毒、SARS‑CoV等，而它们感染后诱导纤维化的时间窗不尽相同，故研究中未使用此方法。基于博来霉素诱导的肺纤维模型与病毒性肺炎后肺纤维化模型具有高度相似的病理机制，并且操作简单，可重复性强，与人类疾病的典型特征相似，是目前应用最广泛的肺纤维化模型^{［1， 67］}。因此，选择更为稳定、经典的博来霉素模型评价牛蒡子药效。

综上所述，本研究结合UHPLC-Q-TOF-MS、网络药理学、代谢组学技术以及实验验证，初步推测牛蒡子可能通过多成分、多靶点的方式调控能量代谢并抑制EMT，涉及调控MAPK等非经典Smad信号通路，从而发挥对PPF的治疗作用。研究结果为牛蒡子在病毒性肺炎后肺纤维化治疗中的应用提供了理论支持。本研究重点分析了牛蒡子对EMT过程及能量代谢的调控作用。未来研究应基于UHPLC-Q-TOF-MS分析结果，进一步筛选出关键活性化合物，明确其物质基础及作用机制，从而为PPF治疗的新型药物研发提供候选化合物。此外，本研究还可为因纤维化导致的肺功能异常提供更多潜在的治疗选择。

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