外胚层间充质干细胞来源的外泌体通过控制炎症和氧化损伤减少M1型小胶质细胞并促进H₂O₂处理后PC12细胞的存活

摘要

目的 探究外胚层间充质干细胞来源的外泌体（EMSCs-exo）对脊髓继发性损伤的潜在修复作用。方法 从大鼠鼻黏膜中分离培养EMSCs，并通过免疫荧光染色鉴定。采用超速离心法获取EMSCs-exo，并通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和Western blot进行鉴定。利用差速贴壁法纯化小胶质细胞，并通过免疫荧光染色鉴定。根据BCA法测得的蛋白浓度对EMSCs-exo进行定量分析。设置对照组、含100μg/L脂多糖（LPS）的组和含LPS及37.5 mg/L或75 mg/L EMSCs-exo的组对小胶质细胞进行处理。设置对照组、含400μmol/L H₂O₂的组和含H₂O₂及37.5 mg/L或75 mg/L EMSCs-exo的组对PC12细胞进行处理。通过Western blot和qRT-PCR测定小胶质细胞各组Arg1和iNOS蛋白和mRNA表达量。通过酶联免疫吸附实验测定上清中IL-6、IL-10和IGF-1的浓度。通过CCK-8和Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测PC12细胞各组的活力和凋亡情况。结果 免疫荧光染色显示EMSCs高表达标志物Nestin、CD44、CD105、Vimentin。透射电镜显示EMSCs-exo呈典型的杯状结构，NTA显示其平均粒径为142 nm,Western blot显示其表达外泌体标志蛋白CD63、CD81、TSG101，不表达Vimentin。当小胶质细胞在LPS环境中时，75 mg/L的EMSCs-exo能够有效提高其Arg1蛋白量、降低iNOS蛋白量（P<0.05），且相比于37.5 mg/L的浓度，其更能有效提高其Arg1 mRNA水平和IGF-1、IL-10（P<0.05）的生成，降低iNOS mRNA水平和IL-6的生成（P<0.05）；也更有效促进H₂O₂环境中PC12细胞的存活，降低凋亡率（P<0.05）。结论 75 mg/L的EMSCs-exo在体外有效减少M1型小胶质细胞比例，减轻氧化应激下的神经元凋亡，促进神经元存活，因此在控制脊髓继发性损伤中具有一定应用潜能。

关键词

外胚层间充质干细胞 / 外泌体 / 小胶质细胞 / 炎症 / 氧化应激 / 脊髓继发性损伤