扶正化积汤治疗非小细胞肺癌的分子机制：基于网络药理学及体外实验验证

Inhibitory effect of Fuzheng Huaji Decoction against non-small cell lung cancer cells in vitro and the possible molecular mechanism

摘要

目的 通过网络药理学、分子对接和体外实验探究扶正化积汤治疗非小细胞肺癌（NSCLC）的作用机制。 方法 通过TCMSP、SwissTargetPrediction数据库筛选扶正化积汤活性成分及其作用靶点。通过在GeneCards、PharmGKB数据库获取NSCLC相关靶点，与扶正化积汤活性成分靶点取交集。利用STRING数据库建立蛋白相互作用（PPI）网络，使用Cytoscape3.8.2软件CytoNCA插件筛选PPI网络核心靶点，利用DAVID6.8数据库进行GO和KEGG通路富集分析。使用A549细胞开展体外实验进行靶点验证，CCK-8法检测扶正化积汤含药血清对A549细胞增殖的影响。Annexin V-FITC/PI染色检测含药血清对A549细胞凋亡的影响。Western blotting检测含药血清对关键通路中相关蛋白表达的影响。 结果 扶正化积汤活性成分共140个，药物和疾病交集靶点共707个，PPI网络核心靶点有TP53， AKT1，HIF1A， GAPDH，ALB，EGFR，CTNNB1， TNF等，GO分析显示主要生物学过程为转移酶、激酶、受体、水解酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、氧化还原酶等，KEGG通路富集显示主要信号通路为PI3K-AKT信号通路、Ras信号通路、钙离子信号通路、MAPK信号通路等。分子对接结果显示，药物有效成分与TP53、AKT1、HIF1A均有效对接。体外实验结果： CCK-8实验确定以2.5%、5%、10%为扶正化积汤含药血清的低、中、高浓度（P<0.05，P<0.01，P<0.0001）。细胞凋亡实验显示扶正化积汤含药血清不同程度促进A549细胞凋亡（P<0.01，P<0.001）。Western blotting结果显示，扶正化积汤下调A549细胞中HIF1A、p-AKT 308和TP53蛋白的表达水平（P<0.05，P<0.01，P<0.001，P<0.0001）。 结论 扶正化积汤可能通过调控HIF1A，p-AKT 308，TP53蛋白的表达，抑制A549细胞增殖，发挥治疗NSCLC的潜在作用。

Abstract

Objective To investigate the inhibitory effect of Fuzheng Huaji Decoction against non-small cell lung cancer (NSCLC) cells in vitro and explore the underlying mechanism. Methods The active ingredients and targets of Fuzheng Huaji Decoction were identified using TCMSP and SwissTargetPrediction databases. NSCLC-related targets from GeneCards and PharmGKB were intersected with the targets of the Decoction, and a protein-protein interaction (PPI) network was constructed to identify the core targets, which were analyzed with GO and KEGG pathway enrichment analysis. Cultured A549 cells were treated with different concentrations of Fuzheng Huaji Decoction-medicated serum, and the changes in cell proliferation, apoptosis, and protein expressions were examined using CCK-8 assay, annexin V-FITC/PI staining and Western blotting. Results Fuzheng Huaji Decoction contained 140 active ingredients, and 707 drug-disease intersecting targets were identified. Among these targets, TP53, AKT1, HIF1A, GAPDH, ALB, EGFR, CTNNB1, and TNF were identified as the core targets which were involved in the biological processes related to kinases and receptors and the PI3K-AKT, Ras, calcium, and MAPK pathways. Molecular docking studies indicated strong binding affinity of the active ingredients with TP53, AKT1, and HIF1A. In cultured A549 cells, treatment with 2.5%, 5%, and 10% Fuzheng Huaji Decoction-medicated serum significantly inhibited cell proliferation, promoted cell apoptosis, and downregulated the expression levels of HIF1A, p-AKT (Thr308), and TP53 proteins. Conclusion Fuzheng Huaji Decoction inhibits proliferation of NSCLC cells possibly by downregulating the expressions of HIF1A, p-AKT (Thr308), and TP53.

Graphical abstract

关键词

扶正化积汤 / 非小细胞肺癌 / 网络药理学 / 分子对接 / 体外实验

Key words

Fuzheng Huaji Decoction / non-small cell lung cancer / network pharmacology / molecular docking / in vitro experiments

肺癌作为死亡率最高的恶性肿瘤之一，已成为全球性的健康问题^［1］。据统计，2020年我国约有82万例肺癌新诊断病例和71.5万例肺癌相关死亡病例，其发病率和死亡率逐年攀升^［2］。根据病理改变差异，肺癌分为非小细胞肺癌（NSCLC）与小细胞肺癌，其中，NSCLC约占肺癌的85%，其发病与吸烟、空气污染、遗传易感性等因素密切相关^［3-5］。目前NSCLC的治疗以手术治疗、放化疗、免疫治疗和靶向治疗为主，但西医治疗过程中复杂的并发症及耐药抵抗也使得疗效受限，NSCLC患者5年总体生存率仍然较低^［6］。因此，寻求有效的药物治疗NSCLC仍非常有必要。

中药由于其多靶点、个性化组方等特点，能够有效改善肺癌患者临床症状和生活质量，在肿瘤防治和并发症治疗中逐渐受到关注^［7］。NSCLC属于中医“肺积”、“肺岩”“息贲”等范畴^［8］，以正气亏虚为本，气毒痰瘀胶着成积为标，治疗上以扶正解毒为主要治则^［9］。师林教授在临床工作中依据其中医治则，自拟扶正化积汤加减运用于临床，该方在长期临床实践中取得了良好疗效。课题组在临床研究中发现，扶正化积汤能够减轻患者咳嗽、咳痰以及食欲不振的症状。此外，它还能够改善骨髓抑制和胃肠道反应的程度，从而提高患者的生存质量。但该方目前作用分子机制尚不明确。因此，本文运用网络药理学的方法，探究扶正化积汤治疗NSCLC的有效成分和潜在靶点并进行初步实验验证，为进一步挖掘其潜在临床应用价值奠定基础。

1 材料和方法

1.1 扶正化积汤有效成分筛选及靶点预测

使用中药系统药理学分析平台TCMSP（版本：2.0），以口服生物利用度（OB）≥30%、药物相似性（DL）≥0.18作为筛选条件，进行药物化学成分筛选。使用SwissTargetPrediction数据库，根据筛选化学成分的Canonical SMILES预测筛选出的化学成分的作用靶点。使用Excel进行数据整理。

1.2 NSCLC相关基因筛选

在GeneCards数据库、PharmGKB数据库（版本：Release 21.4）查找NSCLC疾病靶点，检索词为“non-small cell lung cancer”。得到各数据库靶点基因后，删去重复项，获NSCLC的疾病靶点。将疾病靶点与扶正化积汤化学成分作用靶点导入Venn Diagram绘制Venn图，并获得共同靶点。

1.3 靶蛋白相互作用网络构建与分析

将扶正化积汤的单味药物-有效化学成分和有效成分-靶点信息导入Cytoscape软件（版本：3.8.2），绘制“药物成分-靶点-疾病”网络图。再将预测、筛选并映射到扶正化积汤的NSCLC共同靶点导入STRING数据库（版本：11.5）的“multiple proteins”检测栏，物种选择“homo sapiens”，构建扶正化积汤-NSCLC共同靶点之间的相互作用图（PPI网络），将图片导出为TSV格式，在Cytoscope（3.8.2）软件中对网络进行整理。

1.4 GO与KEGG富集分析

我们使用Cytoscape 3.8.2软件及其插件CytoNCA来计算PPI网络中每个节点的拓扑参数。这些参数包括节点的连接度、紧密度和介数。以节点连接度的两倍中位数为筛选标准，以节点连接度和节点紧密度的中位数作为筛选依据，对PPI网络中共同靶点进行筛选，获得核心靶点。将核心靶点基因序列录入David数据平台（版本：6.8），选择标识为“AFFYMETRIX-3PRIME-IVT-ID”，背景集设为“homo sapiens”，对核心靶基因序列进行GO和KEGG富集分析。

1.5 分子对接

将扶正化积汤的核心活性成分与PPI网络中筛选出的核心靶点进行分子对接。在PDB数据库获取核心靶点蛋白三维结构，并使用PyMol软件（版本：2.4.1）对受体蛋白三维结构进行去水和加氢等预处理。使用Open Babel软件（版本：3.1.1）更改活性成分文件为Mol2格式。使用AutoDockTools 1.5.7 软件将活性成分和受体蛋白文件进行格式转化，并运行AutoDock Vina进行分子对接。以上数据库检索时间为2023年1月。

1.6 实验验证

1.6.1 动物与细胞系

Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，200 g左右，共40 只，南方医科大学珠江医院实验动物中心购入（生产许可证号SYXK（粤）2023-0215）。人肺腺癌细胞株（A549，长沙艾碧维生物科技有限公司）。实验均经过中山大学实验动物伦理委员会批准（伦理批号：SYSU-IACUC-2025-000084），实验动物使用许可证号：中山大学（实验动物中心东校园），SYXK（粤）2023-0112。

1.6.2 药物、试剂和仪器

扶正化积汤由黄芪20 g、冬凌草20 g、五指毛桃30 g、三棱10 g、莪术10 g、全蝎 10 g、仙鹤草30 g、蜈蚣1 g、白术15 g、党参15 g、防风15 g、浙贝20 g、杜仲20 g、陈皮5 g、法夏15 g、茯苓15 g组成，购自南方医科大学珠江医院。CCK-8试剂盒（Glpbio）；BCA蛋白定量试剂盒（江苏康为世纪生物科技股份有限公司）；SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；兔抗TP53多克隆抗体（proteintech，1∶5000）；兔抗Phospho-Akt（Thr308）多克隆抗体（proteintech，1∶1000）；兔抗HIF-1α多克隆抗体（proteintech，1∶2000）；鼠抗AKT单克隆抗体（proteintech，1∶5000）；鼠抗GAPDH单克隆抗体（proteintech，1∶5000）；山羊抗兔（proteintech，1∶5000）；山羊抗鼠（proteintech，1∶5000）；超强ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；细胞凋亡检测试剂盒（Elabscience）。超净工作台（苏州赛恩斯仪器有限公司）；光学显微镜（Olympus）；电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；台式离心机（Sigma）；多功能酶标仪（BMG）； 电泳仪、转膜仪（Bio-Rad），cytoFLEX 流式细胞分析仪（Beckman）。

1.6.3 扶正化积汤含药血清的制备及细胞培养

在本研究中，扶正化积汤的煎煮工艺参考了课题组前期已成熟的技术^［10］。具体步骤如下：根据“实验动物与人体表面积等效剂量换算比率”计算扶正化积汤大鼠等效剂量，扶正化积汤各组分煎煮2 次，混匀得到水煎剂，开始灌胃的前1 d制备后保存于4 ℃冰箱备用。将雄性SD大鼠随机分为对照组、中药组，20 只/组，中药组以22.41 g/kg剂量进行灌胃，对照组给予等体积生理盐水灌胃，早晚各1 次，持续5 d。最后1 次给药前大鼠禁食不禁水12 h。末次给药后1 h，通过脱臼处死大鼠后，心脏取血，置于无菌抗凝管内。室温静置30 min，待凝血坚固，血清析出。按4 ℃，3000 r/min离心15 min，吸出上清，同组血清混匀，56 ℃灭活30 min，在超净生物安全柜内用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，EP管分装、标记，置于-80 ℃冰箱保存备用。

使用A549细胞进行扶正化积汤的体外药效验证。A549细胞在DMEM培养基（Gibco）中培养，培养基中含有10%胎牛血清（FBS，Gibco），1%青霉素-链霉素，并置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中。

1.6.4 细胞增殖能力检测（CCK-8法）

使用扶正化积汤含药血清干预A549细胞，研究扶正化积汤药效和作用机制。培养A549细胞，将其分为空白血清对照组、不同浓度扶正化积汤含药血清处理组（0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%），干预一定时间后，根据CCK-8试剂盒（Glpbio）说明书进行实验，用酶标仪测定吸光值A_{450 nm}并计算细胞活力，细胞存活率（%）=［（A_实验组-A_空白组）/（A_对照组-A_空白组）］×100%。

1.6.5 流式细胞术检测细胞凋亡

将A549细胞以每孔2 mL接种于6孔板中，于37 ℃培养箱培养24 h后，加入不同浓度的扶正化积汤继续培养，用不含EDTA的胰酶消化，收集细胞沉淀，加入预冷PBS清洗细胞并重悬、计数，在细胞沉淀中各加入1×结合缓存液100 μL，混匀细胞，5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI双染，混匀，常温避光放置15 min，每组再加入1× 结合缓存液400 μL，混匀，用45 μm滤网过滤细胞碎片，置于冰上，流式仪检测凋亡情况。

1.6.6 Western blotting配制蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂

RIPA裂解液（1000∶1∶1）用于冰上裂解细胞30 min，超声处理15 s（每5 s停1 s）。4 ℃下，13 000 r/min离心15 min，收集上清。使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品经100 ℃变性10 min后，按SDS-PAGE试剂盒说明配制凝胶并上样，电泳参数为80 V、30 min，120 V、1.5 h。根据目的蛋白相对分子质量选择转膜时间，以250 mA恒流转膜。PVDF膜经TBST润洗后，用5%脱脂牛奶4 ℃封闭过夜，TBST漂洗5 min，重复6 次。裁膜后，一抗（TP53，1∶5000；p-AKT308，1∶1000；HIF-1A：1∶2000；AKT：1∶5000；GAPDH：1∶5000）4 ℃孵育过夜，TBST漂洗5 min，重复6 次；二抗（1∶5000）室温孵育1.5 h，TBST漂洗5 min，重复6 次。ECL发光液A、B等量混匀后滴加于膜上，化学发光仪自动曝光成像，保存结果。最后，用Image-Pro Plus 6.0分析条带灰度值。

1.6.7 统计学分析

所有数据统计分析均使用GraphPad Prism软件v10.1.2进行，所有数据均用均数±标准差描述，并至少3个生物学重复。对于样本数量n≥3组的数据，若数据满足正态分布且方差齐性，采用单因素分析进行统计分析，然后采用Tukey检验进行多重比较；若不满足，则采用Kruskal-Wallis检验进行非参数分析，然后采用Dunn检验进行多重比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 扶正化积汤的活性成分筛选与ADME分析

通过检索TCMSP数据库，获得单味药的活性成分，共得到活性成分157个。其中陈皮5个，白术7个，党参21个，杜仲28个，莪术3个，法半夏13个，防风18个，茯苓15个，黄芪20个，三棱5个，仙鹤草15个，浙贝母7个。剔除重复单体17个，最终获得140个活性成分。其中，8-羟环氧树脂醇、黄芩素、黄樟醇、木犀草素、槲皮素、山奈酚、异鼠李素和7-o-甲基异聚脲醇为扶正化积汤治疗NSCLC的核心活性成分。

2.2 扶正化积汤治疗NSCLC的潜在靶点预测

分别在GeneCards数据库、Pharm GKB数据库查找NSCLC疾病潜在靶点，剔除重复靶点后，获得NSCLC相关靶点7365个。在SwissTargetPrediction数据库中检索扶正化积汤的140个活性单体对应的靶点，删除重复靶点后，获得药物靶点1291个。将扶正化积汤中药活性成分靶点与NSCLC靶点进行映射，获得药物与疾病的共同靶点707个（图1）。

2.3 “成分-靶点-疾病”网络图构建

将扶正化积汤的单味药物、药物对应的有效化学成分、化学成分对应的靶点信息导入Cytoscope软件中，绘制“药物-成分-靶点-疾病”可视化网络图（图2）。中部正方形节点为疾病与药物的共同靶点，四周椭圆形节点代表药物成分，按中药来源分类排列，节点之间的连线代表靶点与药物活性成分之间的作用关系。

靶点与药物成分之间的关联度由低到高，如图例所示节点由黄色变化为紫色，由此获得扶正化积汤治疗NSCLC的关键药物成分。以关联度≥80为标准，筛选获得关键药物成分包括8-Hydroxypinoresinol（8-羟环氧树脂醇）、baicalein（黄芩素）、Jaranol（黄樟醇）、luteolin（木犀草素）、kaempferol（山奈酚）、quercetin（槲皮素）、isorhamnetin（异鼠李素）、7-O-methylisomucronulatol（7- o -甲基异聚脲醇）等，这些关键药物成分主要来自扶正化积汤中的中药黄芪、杜仲、党参和法半夏（表1）。

2.4 扶正化积汤治疗NSCLC的靶点蛋白相互作用网络分析

将药物与疾病的交集靶点导入STRING数据库构建蛋白之间的相互作用关系（PPI）网络，使用Cytoscope对PPI网络进行拓扑分析，将关联度前100位的靶点设定为扶正化积汤治疗NSCLC的关键靶点（图3）。这些核心靶点包括TP53，AKT1，HIF1A，GAPDH，ALB， EGFR，CTNNB1，TNF，SRC，IL-6等。

2.5 GO功能分析与KEGG通路富集分析

利用DAVID数据库对扶正化积汤治疗NSCLC的潜在作用靶点进行GO功能富集分析。以P<0.05和FDR<0.05为筛选标准（图4），共得到BP条目32条，CC条目15条，MF条目18条。其中BP条目主要涉及宿主病毒相互作用、细胞凋亡、脂质代谢、细胞周期、生物节律、血管生成、炎症反应、应激反应等；CC条目主要涉及膜结构、细胞核、外泌体、线粒体等多个细胞结构；MF条目主要涉及转移酶、激酶、受体、水解酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、氧化还原酶等。

利用DAVID在线数据库对扶正化积汤作用于NSCLC的有效作用靶点进行KEGG通路富集分析。以P<0.05和FDR<0.05为筛选标准，取排名前15条通路（图5）。主要涉及脂质和动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、肿瘤中的蛋白聚糖、化学致癌受体反应、Ras信号通路、人巨细胞病毒感染、钙离子信号通路、MAPK信号通路、肿瘤信号通路、PI3K-AKT信号通路、肿瘤中的MicroRNA响应、神经配体-受体相互作用、阿兹海默病、神经退化性疾病相关通路和代谢通路。

2.6 分子对接

选取PPI网络中核心的3个靶点TP53和AKT1、HIF1A反向追溯其关联活性化合物，将这3个靶点与扶正化积汤核心活性成分单体进行分子对接（表2），扶正化积汤的主要活性成分与3个靶点的结合能均较低，提示药物可能通过TP53、AKT1、HIF1A发挥作用。其中3个靶点于DS10（luteolin）亲和力较佳，化合物与靶蛋白结合效果良好，其中TP53与DS10结合能为-10.40 kcal/mol。DS10的3，4-二羟基与TP53的Ser149形成氢键，其4'-甲氧基与TP53的Leu143发生疏水相互作用。AKT1与DS10结合能为-11.10 kcal/mol。DS10的3，4-二羟基与AKT1的Thr308形成氢键，其4'-甲氧基与AKT1的Leu211发生疏水相互作用。HIF1A与DS10结合能为-6.00 kcal/mol。DS10的3，4-二羟基与HIF1A的Ser846形成氢键，其4'-甲氧基与HIF1A的Leu820发生疏水相互作用，共同促进了分子间的紧密结合（图6）。

2.7 体外实验验证

不同浓度扶正化积汤含药血清对A549细胞的增殖能力的影响（图7），干预24 h后，与对照组相比，5%，7.5%，10%，12.5%，15%，17.5%，20%扶正化积汤含药血清能有效降低A549细胞的细胞活力（P<0.01，P< 0.001，P<0.0001），干预48 h后，与对照组相比，2.5%，5%，7.5%，10%，12.5%，15%，17.5%，20%扶正化积汤含药血清能有效降低A549细胞的细胞活力（P<0.05，P<0.01，P<0.001，P<0.0001）。因此选择2.5%（低浓度，TMC-L）、5%（中浓度，TMC-M）、10%（高浓度，TMC-H）扶正化积汤含药血清为实验组，空白血清为对照组干预A549细胞，干预处理48 h。

不同浓度扶正化积汤含药血清对A549细胞凋亡的影响：与对照组相比，不同浓度含药血清能促进细胞凋亡（P<0.01，P<0.001，图8），扶正化积汤含药血清的作用呈现浓度依赖性。

扶正化积汤含药血清对A549细胞HIF1A，p-AKT 308，TP53的表达影响：与对照组相比，低、中、高浓度含药血清组能显著降低A549细胞HIF1A，p-AKT 308，TP53的蛋白表达水平，差异具有统计学意义（P<0.05， P<0.01，P<0.001，P<0.0001，图9）。扶正化积汤含药血清的作用呈现浓度依赖性。

3 讨论

目前，大量研究表明中药辅助肺癌治疗能够有效提高临床疗效^［11］，中医药在扶助正气，维持体内环境稳态性，改善症状，提高患者生活质量及延长生存期方面有独到的优势。从中医病机角度分析，肺癌是一种整体属虚局部属实的疾病，其正虚为本，邪实为标^［12］，扶正解毒法更契合肺癌治疗病机^［13］，是肺癌的有效治法之一，NSCLC的治疗当扶正解毒、固本清源。课题组所研究的扶正化积汤是师林教授多年临床经验总结的有效方，属于扶正解毒的重要方剂。现临床用药中清热解毒类、抗癌药物种类诸多，清热解毒法代表药物为半枝莲、白花蛇舌草、重楼、漏芦、天葵子、山豆根等^［14］，运用冬凌草者较少，但通过检索文献运用数据挖掘分析，国医大师刘尚义治疗恶性肿瘤常用药物中，冬凌草的使用频次位于莪术、鳖甲之后第3位^［15］。其中，刘尚义治疗肺癌的临床用药特点中，冬凌草是使用频次最高的清热解毒类药物^［16］。我们在扶正化积汤中选取冬凌草、黄芪组合为君药，其中冬凌草归肺、胃、肝经，具有清热解毒、活血止痛功效，气为血之帅，配合黄芪补气升阳，使气旺则血行，瘀去络通；臣以全蝎、蜈蚣、浙贝母更益化痰通络、攻毒散结之功；脾为肺之母，脾气虚则肺气绝，遂配合五指毛桃、党参、白术健脾益肺养血，以培土生金，与防风配伍可升阳运脾，加强益气助运之力，以上为佐药；莪术、三棱均归肝、脾经，二者相须为用，助君药活血行气、消瘀止痛；运用法半夏、陈皮，理气化痰，使气顺则痰消，辅以茯苓燥湿健脾，以杜生痰之源；同时运用仙鹤草、杜仲加强补虚之效。诸药合用，气血兼顾，以达解毒、扶正、祛瘀、抗肿瘤的目的。同时，现代研究证实，黄芪中的黄芪甲苷IV可增加NSCLC细胞Bax，减少Bcl-2，通过抑制AKT/GSK-3β/β-catenin信号轴而抑制了NSCLC的发展^［17］。黄芪多糖可以抑制A549异种移植裸鼠的生长，下调A549细胞的P65mRNA和蛋白表达，并降低p50，CyclinD1和Bcl-xL蛋白的表达，对人肺癌细胞A549和NCI-H358具有显著的抗肿瘤活性。黄芪多糖联合顺铂能抑制Lewis肺癌细胞生长并降低瘤组织CD44、CD62P和骨桥蛋白的蛋白表达。黄芪多糖能明显增加A549/DDP耐药细胞对DDP的敏感性，提高细胞死亡率，具有逆转耐药作用^［18-20］。冬凌草合成的金纳米颗粒对肺癌A549细胞具有抗癌和抗凋亡作用。冬凌草甲素通过促进ATM活化来促进A549细胞中G2/M阻滞，从而抑制A549细胞的增殖。冬凌草甲素可以通过增强细胞杀伤能力、诱导凋亡、调控AMPK/AKT/mTOR通路来提高A549肺癌细胞对顺铂的敏感性^［21］。以上药理实验表明扶正化积汤中君药黄芪、冬凌草可抑制NSCLC生长，并增强肺癌DDP化疗药敏性。但该方确切的抗肿瘤作用分子机制尚未明晰，因此，本研究拟通过网络药理学和分子对接探讨扶正化积汤治疗NSCLC的分子机制并进行初步实验验证，为临床应用和进一步研究提供科学依据。

本研究首先运用网络药理学与分子对接对扶正化积汤治疗NSCLC的分子机制进行了系统分析。网络药理学结果表明，扶正化积汤治疗NSCLC的作用涉及140个活性成分、707个分子靶点。我们通过网络药理学方法探讨了扶正化积汤治疗NSCLC的潜在分子机制。然而，需要注意的是，TCMSP数据库中并未包含蜈蚣和全蝎两味药物，因蜈蚣和全蝎属于动物药，其个体差异较大，品种来源多样。不同亚种、个体之间的有效物质含量不尽相同，难以进行精确量化。这种多样性使得在数据库中准确记录和分析其化学成分和药理作用面临挑战。现代研究表明，它们的主要有效成分为蛋白质、多肽和脂肪酸^{［22， 23］}。这些成分在药理作用中发挥重要作用，但单体化合物的含量和作用效果相对较少受到关注。目前，关于蜈蚣和全蝎的化合物成分解析及功效研究相对较少，这进一步限制了它们在数据库中的详细记录和分析。尽管TCMSP数据库中未包含蜈蚣和全蝎，但扶正化积汤的其他成分在数据库中得到了详细记录和分析。这些成分的活性和作用机制为复方的药理作用提供了重要支持。

扶正化积汤防治NSCLC的GO生物学过程与肿瘤微环境改变密切相关；KEGG富集分析所富集到的肿瘤中的PI3K-AKT信号通路、蛋白聚糖、化学致癌受体反应、Ras信号通路、钙离子信号通路、MAPK信号通路、肿瘤信号通路、肿瘤中的MicroRNA响应通路与肿瘤发生发展病理过程契合。其中，蛋白质相互作用分析提示TP53和AKT1、HIF1A等分子度值排名靠前，是蛋白相互作用网络中的核心靶点。扶正化积汤的核心靶点与NSCLC疾病发生发展关系密切，提示扶正化积汤能够多靶点调节NSCLC疾病进程。TP53是重要的抑癌基因，在肺癌进程中常发生突变^［24］，其突变与NSCLC的耐药性、放疗抵抗进化密切相关，往往伴随着较差的预后^{［25， 26］}；PI3K-AKT通路是调节细胞运动、侵袭和转移的经典通路之一，同时也是各类癌症的主要信号通路，与癌细胞的增殖、迁移、凋亡等相关^［27］。AKT1的激活能够通过加剧KRAS或EGFR突变等途径促进NSCLC肿瘤细胞的迁移和侵袭^［28］，同时，AKT在NSCLC进程中能够通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节细胞代谢的关键因子，这使得AKT1成为当前许多用于防治NSCLC的活性小分子的目标靶点^{［29， 30］}。

值得注意的是，通过网络药理学分析我们发现扶正化积汤治疗NSCLC的多个核心靶点涉及HIF1A介导的低氧反应及其相关通路。具体而言，核心靶点中包括HIF1A、AKT1、TP53、EGFR和CTNNB1等蛋白，这些蛋白在HIF1A介导的低氧反应通路中发挥关键作用。缺氧是实体肿瘤微环境特征之一，HIF1A作为肿瘤细胞的主要生存因子，在许多肿瘤中高表达^{［31， 32］}，是导致多种肿瘤不良预后的重要因素，当氧浓度过低时，HIF1A表达增加，并通过调控多种靶基因的表达，以适应低氧环境，HIF1A在肿瘤生长、浸润和转移过程中具有重要作用。因此，下调HIF通路被认为是抗实体肿瘤的有效策略。有研究发现，HIF1A表达升高与NSCLC发生密切相关，缺氧环境中培养的A549细胞株表达水平高于常氧环境中培养的细胞，缺氧条件下A549中lncRNA H19表达上调，此外，缺氧促进肺癌细胞增殖和转移，缺氧环境下的A549细胞对顺铂也具有更强的耐药性。这表明HIF1A可能是具有潜质的预后生物标志物及治疗靶点^{［33， 34］}。基于网络药理学的推测，我们在流式细胞凋亡实验中发现，随着扶正化积汤浓度的升高，A549细胞凋亡率逐渐增高，呈浓度依赖性。WB实验中表明扶正化积汤能降低A549细胞中HIF1A，p-AKT 308，TP53的表达。我们预测扶正化积汤可能通过靶向核心靶点等基因，调控PI3K/Akt/mTOR信号通路、HIF1A介导的低氧反应及其相关通路起到治疗NSCLC的作用。

综上所述，本研究运用网络药理学和分子对接筛选出扶正化积汤治疗NSCLC的潜在重要通路及所涉及的重要作用靶点，并且进一步通过体外实验验证了扶正化积汤含药血清能显著抑制A549细胞HIF1A，p-AKT 308，TP53蛋白的表达。然而，本研究也存在一些不足之处。尽管体外实验结果令人鼓舞，但缺乏体内实验的验证，因此未来的研究需要通过动物模型进一步验证扶正化积汤的抗肿瘤效果。本研究体外实验的结果也为扶正化积汤的抗肿瘤作用提供了初步证据，为进一步开展体内实验和临床研究奠定了基础。

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