Apelin通过激活 FGF2/FGFR1通路促进膀胱癌增殖、迁移及血管生成

Apelin promotes proliferation, migration, and angiogenesis in bladder cancer by activating the FGF2/FGFR1 pathway

摘要

目的 探究Apelin（APLN）对膀胱癌细胞增殖、迁移和血管生成的影响，并分析可能的作用机制。 方法 使用GEO数据筛选出膀胱癌组织及细胞中的差异表达基因。收集60例膀胱癌组织及癌旁组织样本，分析患者的临床及病理参数。体外培养膀胱癌J82细胞或人脐静脉内皮细胞HUVEC，转染相关质粒。并将其分为对照组、si-NC组、si-APLN组、oe-NC组、oe-APLN组、oe-APLN+si-NC组及oe-APLN+si-FGFR1组。qRT-PCR及Western blotting实验检测APLN在膀胱癌组织及细胞中的表达情况，平板克隆实验检测J82细胞增殖情况，Transwell小室实验检测J82细胞迁移情况，血管生成实验检测HUVEC细胞血管生成情况，Western blotting实验检测FGF2表达以及FGFR1磷酸化水平。 结果 APLN mRNA及蛋白表达在膀胱癌组织中的表达较正常组更高（P<0.05）。此外，与SV-HUC-1相比，膀胱癌细胞（T24和J82）中APLN mRNA及蛋白表达上调（P<0.05）。临床病理特征分析结果显示，APLN表达与膀胱癌的侵袭、远端转移及TNM分期密切相关（P<0.05）。si-APLN组J82细胞增殖和迁移率较si-APIN组下降，HUVEC细胞总血管生成长度减少（P<0.05）。与oe-NC组相比，oe-APLN组J82细胞增殖和迁移率上升，FGF2表达以及FGFR1磷酸化水平上升，HUVEC细胞总血管生成长度增加（P<0.05）。与oe-APLN+si-NC组相比，oe-APLN+si-FGF2组J82细胞增殖和迁移率下降，FGF2表达以及FGFR1磷酸化水平下降，HUVEC细胞总血管生成长度减少（P<0.05）。与oe-APLN+si-NC组相比，oe-APLN+si-FGFR1组J82细胞增殖和迁移率下降，FGFR1表达以及FGFR1磷酸化水平下降，HUVEC细胞总血管生成长度减少（P<0.05）。 结论 APLN可能通过促进FGF2/FGFR1通路活化，促进J82细胞增殖、迁移及HUVEC血管生成。

Abstract

Objective To investigate the role of apelin in regulating proliferation, migration and angiogenesis of bladder cancer cells and the possible regulatory mechanism. Methods GEO database was used to screen the differentially expressed genes in bladder cancer tissues and cells. Bladder cancer and paired adjacent tissues were collected from 60 patients for analysis of apelin expressions in relation to clinicopathological parameters. In cultured bladder cancer J82 cells and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), the effects of transfection with an apelin-overexpressing plasmid or specific siRNAs targeting apelin, fibroblast growth factor 2 (FGF2) and fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) on proliferation and migration of J82 cells and tube formation in HUVECs were examined using plate cloning assay, Transwell assay, and angiogenesis assay; the changes in FGF2 expression and FGFR1 phosphorylation were detected using Western blotting. Results The expression level of apelin was significantly higher in bladder cancer tissues than adjacent tissues, and bladder cancer cell lines (T24 and J82) also expressed higher mRNA and protein levels of apelin than SV-HUC-1 cells. Apelin expression level in bladder cancer tissues was correlated with tumor invasion, distant metastasis and advanced TNM stages. Apelin knockdown significantly suppressed proliferation and migration of J82 cells and decreased the total angiogenic length of HUVECs. In contrast, apelin overexpression significantly promoted proliferation and migration and enhanced FGFR1 phosphorylation in J82 cells, and increased the total angiogenesis length in HUVECs, but this effects were effectively mitigated by transfection of the cells with FGF2 siRNA or FGFR1 siRNA. Conclusion High expression of apelin promotes J82 cell proliferation and migration and HUVEC angiogenesis by promoting activation of the FGF2/FGFR1 pathway.

Graphical abstract

关键词

膀胱癌 / Apelin / FGF2/FGFR1通路 / J82细胞 / 血管生成

Key words

bladder cancer / apelin / FGF2/FGFR1 pathway / J82 cells / angiogenesis

膀胱癌（BC）是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，其发生率和死亡率都很高^［1］。膀胱癌根据肿瘤侵袭膀胱肌层分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌，约50%的患者在根治性膀胱切除术后出现复发，甚至直接进展为转移性膀胱癌^{［2， 3］}，目前的治疗方案不尽如人意。因此，探寻膀胱癌新型治疗靶标是提高早期诊疗敏感性及特异性的关键。

肿瘤进展通常与血管生成转换有关，血管生成转换是现有脉管系统的正常内皮从静止状态转变为激活和增殖状态的过程，这会导致新血管的发育并促进肿瘤生长^［4］。此外，膀胱癌细胞通过血行途径转移到肝脏、肺和骨骼等远处器官^［5］。因此，血管生成在膀胱癌的发生和扩散中起主要作用。研究表明，成纤维细胞生长因子（FGF）/成纤维细胞生长因子受体（FGFR）信号通路可形成异常血管系统并促进间质变化，并参与肿瘤血管生成^［6］。FGF是一种促血管生成因子，诱导肿瘤血管生成，包括膀胱癌^{［7， 8］}。

Apelin （APLN） 是一种脂肪因子，由脂肪组织分泌，它是一种含有77个氨基酸的肽，由APLN基因编码^［9］。APLN在体内血管发育、内皮细胞增殖和迁移研究中的有效血管生成因子，可诱导不同肿瘤如骨肉瘤、肺腺癌等的生长和转移^［10-12］。目前关于APLN对膀胱癌细胞生物学行为的作用及其是否调控FGF2/FGFR1通路暂未被报道。本研究通过临床水平分析APLN在膀胱癌中的表达，体外实验探究APLN调控FGF2/FGFR1通路对膀胱癌细胞增殖、迁移和血管生成的作用，以期为临床寻找膀胱癌新型生物治疗靶点，以及新的抗肿瘤药物和方法。

1 材料和方法

1.1 主要材料

膀胱癌细胞系（T24、J82）、人输尿管上皮永生化细胞SV-HUC-1和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（ATCC），RPMI 1640培养基、DMEM培养基、青霉素-链霉素溶液（Sigma-Aldrich），过表达APLN（oe-APLN）质粒以及靶向si-FGFR1的siRNA由上海吉因科技有限公司合成，Lipofectamine 3000（Invitrogen），Anti-APLN、Anti-FGF2、Anti-FGFR1、Anti-p-FGFR1（Abcam）。

1.2 基因表达数据下载与差异表达基因的筛选

2个膀胱癌数据集（GSE231383和GSE236932）的基因表达数据从GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载，使用GEO2R分析膀胱癌组织与正常膀胱组织，膀胱癌细胞与输尿管上皮永生化细胞SV-HUC-1中有显著差异表达的基因（筛选标准：|log FC|≥2，P<0.05），用韦恩图（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/） 筛选2个数据集的公共差异基因。

1.3 临床样本收集

收集60例膀胱癌患者膀胱癌组织和癌旁组织，患者充分了解研究目的和潜在风险。纳入标准：患者被诊断为膀胱癌，未接受过治疗，并自愿参加。标本切除后，迅速保存在液氮中冷冻3 h。随后保存于-80 ℃，该研究获得医院伦理审查委员会批准（伦理批号：2024-KY-227），患者均签署知情同意书。收集患者的临床样本及病理参数。

1.4 细胞培养和转染

J82和T24细胞培养在含有10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中。在37 ℃、5%CO₂的湿润环境进行细胞培养。每3 d更换1次培养基，当汇合度达到80%时进行细胞传代。将膀胱癌细胞接种到6孔板中，并按照制造商的方案使用 Lipofectamine3000进行转染。具体而言，单转染组中，质粒DNA（1 μg）或siRNA（50 pmol）分别与Lipofectamine™ 3000（1.5 μL）在Opti-MEM^®中形成复合物，质粒组额外添加P3000™增强剂（2 μL）；共转染组将质粒（1 μg）与siRNA（50 pmol）混合后同法处理，Lipofectamine™ 3000用量增至2.5 μL。复合物室温孵育15 min后加入无血清培养基覆盖的细胞中，6 h后更换完全培养基。转染48 h后，收集细胞用于下一步研究。

1.5 qRT-PCR法

用TRIzol试剂分离总RNA。用M-MuLV逆转录酶合成cDNA。然后使用SYBR green mix试剂盒进qRT-PCR。用Lightcycler 96实时PCR系统进行反应。GAPDH作为内参基因，根据GAPDH的转录水平对数据进行标准化，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，引物由生工生物工程有限公司合成，引物序列如下：APLN（F：5'-GTCTC CTCCATAGATTGGTCTGC-3'，R：5'-GGAATCATCC AAACTACAGCCA-3'）；GAPDH（F：5'-CACCCATGG CAAATTCCATGGCA-3'，R：5'-T CTAGACGGCAGG TCAGGTCCACC-3'）。

1.6 Western blotting实验

用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液溶解细胞。采用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。等量总蛋白上样行SDS-PAGE分离，并转移到PVDF膜。用5%无脂牛奶（Tris缓冲盐溶液中）封闭膜1 h。加入原抗体，在4 ℃下孵育一夜［（GAPDH，1∶10000）、（APLN，1∶1000）、（FGF2，1∶1000）、（p-FGFR1，1∶1000）、（FGFR1，1∶1000）］。TBST洗膜，将膜在室温下用适当的HRP偶联的二抗（1∶5000）孵育1 h。使用ECL试剂显影，拍照并半定量分析，所有指标均以GAPDH作为内参对照。

1.7 平板克隆实验

转染后的细胞在6孔板中生长，1000细胞/孔，培养14 d后，使用4%多聚甲醛固定细胞30 min，蒸馏水重复洗涤2次，2 min/次，之后用结晶紫染色20 min，对可见细胞克隆进行计数。

1.8 细胞迁移实验

采用Transwell小室进行迁移实验。在无血清RPMI 1640培养基中重悬的细胞（1×10⁵/200 μL），接种至Transwell板上室中进行迁移。然后，

在下室加入含有600 μL 20%FBS的DMEM培养基，在37 ℃下孵育12 h，将细胞放在4%多聚甲醛中固定1 h，并用0.1%结晶紫染色15 min。最后，在PBS中洗涤3次，在200×徕卡显微镜下捕获图像。

1.9 血管形成试验

在4 ℃融化Matrigel，96孔板加入50 μL/孔Matrigel，在37 ℃孵育1 h。消化转染后HUVEC细胞并计数，重悬细胞1×10⁴ /100 μL。在37 ℃孵育6 h，用光学显微镜评估HUVEC管形成，在光学显微镜下100×放大倍率拍照。使用lmageJ软件分析管总长度。

1.10 统计学分析

采用SPSS 23.0及GraphPad Prism9.0软件统计分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，采用卡方检验比较APLN基因表达与临床病理因素之间的关系。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基于GEO数据分析膀胱癌组织细胞与正常膀胱组织细胞中的差异表达基因

通过GEO数据GSE231383的高通量测序表达谱分析发现，与SV-HUC-1组相比，5637、UMUC3、T24和J82组中共有621个显著差异表达基因（图1A）。通过GEO数据GSE236932的高通量测序表达谱分析发现，与正常组织相比，膀胱癌组织有938个显著差异表达基因。取细胞与组织显著差异表达基因的交集，发现共有39个差异表达基因，其中SCD、MMP1与APLN在膀胱癌细胞与组织中均上调（图1B、C）。APLN在膀胱癌中暂时未被研究，因此选择APLN作为研究对象。

2.2 APLN在膀胱癌组织和细胞中的表达情况及其与患者临床病理的关系

qRT-PCR及Western blotting检测发现，APLN mRNA及蛋白表达在膀胱癌组织中的表达较正常组高（P<0.05，图2A、B）。与SV-HUC-1相比，膀胱癌细胞（T24和J82）中APLN mRNA及蛋白表达上调（P<0.01，图2C、D）。临床病理特征分析结果显示，APLN表达与膀胱癌的侵袭、远端转移及TNM分期密切相关（P<0.05，表1）。

2.3 APLN转染效率的验证

qRT-PCR及Western blotting结果显示，APLN mRNA及蛋白表达在oe-APLN组膀胱癌细胞（T24和J82）中较oe-NC组高（P<0.05，图3A、B）。APLN mRNA及蛋白表达在si-APLN组膀胱癌细胞（T24和J82）中较si-NC组低（P<0.05，图3A、C）。

2.4 干扰APLN表达抑制膀胱癌细胞增殖、迁移和血管生成

平板克隆实验显示，干扰APLN的表达抑制J82细胞增殖（P<0.01，图4A）。Transwell小室实验显示，干扰APLN的表达抑制J82细胞迁移（P<0.01，图4B）。血管生成实验显示，干扰APLN的表达抑制HUVEC血管生成（P<0.01，图4C）。

2.5 APLN通过FGF2/FGFR1信号通路促进膀胱癌细胞增殖、迁移和血管生成

Western blotting检测发现，oe-APLN组细胞中FGF2表达以及FGFR1磷酸化水平上升，干扰FGF2后，FGF2表达以及FGFR1磷酸化水平下降（P<0.05，图5A）。平板克隆实验显示，过表达APLN的表达促进J82细胞增殖，干扰FGF2逆转过表达APLN促进的细胞增殖（P<0.01，图5B）。Transwell小室实验显示，过表达APLN的表达促进J82细胞迁移，干扰FGF2逆转过表达APLN促进的细胞迁移（P<0.01，图5C）。血管生成实验显示，过表达APLN促进HUVEC血管生成，干扰FGF2逆转过表达APLN的结果（P<0.01，图5D）。干扰FGFR1后，FGFR1表达以及FGFR1磷酸化水平下降（P<0.05，图5E）。干扰FGFR1逆转过表达APLN所促进的细胞增殖、迁移及HUVEC血管生成（P<0.01，图5F~H）。

3 讨论

膀胱癌是泌尿系统恶性肿瘤，具有早期发病隐匿、高复发性等特点。目前，临床治疗膀胱癌主要采用手术切除及放化疗手段，而膀胱癌天然耐药及获得性耐药是治疗效果不佳的主要原因。因此探寻新型敏感及特异性治疗靶标提高药物疗效对改善患者预后具有重要含义。APLN是一种由脂肪组织分泌的脂肪因子，Apelin mRNA和蛋白在各种组织和系统中广泛表达，包括中枢神经系统、胃肠道、心肌细胞、平滑肌细胞、肺内皮细胞^［13-16］。Apelin介导多种病理生理和生理过程，包括代谢紊乱、心血管系统调节、炎症反应、肝脏和肾脏疾病^［17-19］。APLN水平与许多癌症的进展和不良临床结局密切相关^{［11， 12］}。有研究表明，MiR-204-5p靶向结合APLN抑制EC的恶性进展，可能为抗癌药物的设计提供潜在的候选药物^［20］。APLN也通过PI3K/AKT/mTOR 通路促进宫颈癌的增殖、迁移和糖酵解^［21］。在软骨肉瘤中，MicroRNA-631通过靶向Apelin使阿霉素耐药的软骨肉瘤细胞重新敏感^［9］。在肺癌中，Apelin通过增加SREBP1活性，诱导HMGA1的表达，促进肺癌细胞脂肪酸合成和增殖。因此，对于APLN在膀胱癌的发展和转移过程中的深入研究具有显著临床意义。

本研究基于GEO数据库探讨了APLN在膀胱癌组织和细胞的表达情况，并通过细胞过表达以及敲降实验探索了APLN在膀胱癌细胞中的生物学行为。本研究结果证明APLN在膀胱癌细胞增殖、迁移和血管生成中起重要作用。该结论基于以下事实：GEO数据库预测APLN在膀胱癌组织与细胞中都显著上调；qRT-PCR及Western blotting实验证实APLN在膀胱癌组织与细胞中都显著上调；临床病理特征分析结果显示APLN表达与膀胱癌的侵袭、远端转移及TNM分期密切相关，提示APLN在膀胱癌中升高并与较差的预后相关；干扰APLN表达抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移，并抑制HUVEC血管生成。本研究数据表明APLN可能在膀胱癌中具有显著致癌的作用。

肿瘤是一种增殖迅速、新陈代谢旺盛、生命力顽强的生物组织。由于肿瘤组织的快速增殖，周围组织中的资源难以维持肿瘤生长，肿瘤组织中逐渐形成缺氧、缺血、酸中毒、高间质压的微环境，释放丰富的促血管生成因子和细胞因子，促进内皮细胞激活、增殖和迁移，并刺激血管生成^［22］。最终诱导肿瘤增殖、扩散和转移。FGF2是一种肝素结合生长因子，在许多组织和细胞类型中表达，包括血管内皮细胞^［23］。FGF2与4种受体酪氨酸激酶（FGFR1-4）结合，在多种生理和病理过程中发挥作用，例如血管生成、肿瘤生长和发展^{［24， 25］}。FGFR1由一个细胞外区的3个免疫球蛋白样结构域，单个疏水跨膜片段和细胞质酪氨酸激酶结构域组成^［26］。FGFR1在组织和器官中广泛表达，在血管生成和多种类型肿瘤细胞的表型中起重要作用。FGFR1扩增或上调常见于不同类型的肿瘤中，例如乳腺癌、卵巢癌、尿路上皮癌和胃癌^［27-30］。由于其在肿瘤生长中的关键作用，FGFR1被认为是癌症治疗的重要药物靶点，并且已经开发了多种针对它的小分子抑制剂。尽管FGF2和FGFR1具有丰富的表达和有效的血管生成活性，但迄今为止尚不清楚如何调控FGF2/FGFR1 通路的有效血管生成作用。本研究结果显示：过表达APLN促进J82细胞增殖、迁移及HUVEC血管生成。而干扰FGF2表达逆转APLN的结果，提示APLN可能通过FGF2/FGFR1途径促进肿瘤血管生成导致肿瘤细胞的扩散转移和恶性生长。

综上所述，本研究揭示了APLN作为一种新型膀胱癌生物标记物，可能通过促进FGF2/FGFR1通路活化，促进J82细胞增殖、迁移及HUVEC血管生成。但APLN调控FGF2的分子通路的具体细节暂不明晰，下一步将探讨APLN对FGF2/FGFR1通路的具体调控作用。

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