补阳还五汤通过调控外泌体miR-590-5p介导的巨噬细胞极化延缓大鼠血管衰老

Buyang Huanwu Decoction delays vascular aging in rats through exosomal miR-590-5p signal-mediated macrophage polarization

摘要

目的 探讨补阳还五汤对血管衰老的延缓作用机制是否与外泌体miR-590-5p介导的巨噬细胞极化有关。 方法 将18只雄性SD大鼠随机分为年轻组、衰老组和补阳还五汤组，6只/组。通过腹腔注射D-半乳糖300 mg·kg^-1·d^-1建立衰老模型，补阳还五汤组灌胃补阳还五汤4.4 g/kg，年轻组、衰老组给予等量生理盐水。Vevo 3100高分辨率超声成像系统检测大鼠腹主动脉脉搏波传导速度（PWV）。分离胸主动脉，ELISA法测定血管组织衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性；免疫组织化学法检测p16、p21和SA-β-gal表达。提取各组大鼠血清外泌体并通过纳米颗粒跟踪分析及透射电镜观察外泌体的大小及形态；Western blotting检测血清外泌体表面标记物（CD63和CD81）、血管内皮细胞和血管平滑肌细胞标记蛋白（CD31和SM-22）；qRT-PCR检测血清外泌体中miR-590-5p表达；免疫荧光染色和qRT-PCR检测巨噬细胞M1/M2比例及炎性细胞因子表达；生物信息学分析预测miR-590-5p靶基因；双荧光素酶报告基因实验验证miR-590-5p与SLC8A3的靶向关系；Western blotting检测血管组织中SLC8A3表达。 结果 与年轻组相比，衰老组大鼠腹主动脉PWV升高（P<0.001），血管中p16、p21和SA-β-gal表达增加（P<0.05）；与衰老组相比，补阳还五汤组能够逆转衰老引起的上述变化（P<0.05）。提取的血清外泌体大小为50~150 nm，呈现经典的双凹状囊性小泡结构。分离的血清外泌体不仅表达外泌体表面标记CD63和CD81，还可表达血管内皮细胞及血管平滑肌细胞标记蛋白CD31和SM-22。与年轻组相比，衰老组大鼠血清外泌体中miR-590-5p表达下调（P<0.001），血管中M1和M2巨噬细胞比例（P<0.01）以及M1巨噬细胞特异性细胞因子白细胞介素6和白细胞介素1β升高（P<0.01），M2巨噬细胞特异性细胞因子白细胞介素4和白细胞介素10降低（P<0.01）。与衰老组相比，补阳还五汤组上调衰老大鼠血清外泌体中miR-590-5p表达（P<0.001），抑制衰老血管巨噬细胞M1极化（P<0.05）。Pearson相关性分析显示，血清外泌体miR-590-5p表达升高与M1/M2巨噬细胞比例呈负相关（P<0.05）。生物信息学分析显示，miR-590-5p与SLC8A3基因序列存在特异性互补结合位点，双荧光素酶报告实验证实miR-590-5p靶向SLC8A3基因并负调控SLC8A3表达（P<0.05）。Western blotting表明，与年轻组相比，衰老组血管组织中SLC8A3表达升高（P<0.05）；与衰老组相比，补阳还五汤组中SLC8A3表达下调（P<0.05）。 结论 补阳还五汤通过增加外泌体转运miR-590-5p靶向抑制SLC8A3基因表达，改善血管巨噬细胞M1极化及炎性细胞激活，进而延缓血管衰老。

Abstract

Objective To investigate the mechanism underlying the inhibitory effect of Buyang Huanwu Decoction (BYHWD) on vascular aging. Methods Eighteen male SD rats were randomized into young group, intraperitoneal D-galactose injection-induced aging group, and BYHWD gavage group. The changes in pulse wave velocity (PWV), vascular SA-β-gal activity, and expressions of p16, p21 and SA‑β‑gal of the rats were examined. Serum exosomes were isolated from the rats, and after characterization using NTA and TEM and for surface markers and vascular cell markers, were examined for miR-590-5p expression using qRT-PCR. The M1/M2 macrophage ratio and cytokine levels were evaluated using immunofluorescence staining and qRT-PCR. Bioinformatics analysis and dual-luciferase reporter assays were carried out to predict the potential target genes of miR-590-5p and validate its targeting relationship with SLC8A3, whose expressions were detected in the vascular tissues of the rats by Western blotting. Results Compared with the young rats, the aging rats exhibited significantly increased PWV in the abdominal aorta with elevated vascular expressions of p16, p21 and SA-β-gal, which were all reversed by BYHWD treatment. The isolated serum exosomes were positive for CD63, CD81, CD31 and SM-22, and the exosomes from aging rats showed significantly downregulated expression of miR-590-5p, which was upregulated after BYHWD treatment. The aging rat vessels showed an increased M1/M2 macrophage ratio with elevated M1-specific cytokines and reduced M2-specific cytokines, and BYHWD treatment effectively inhibited M1 polarization of the macrophages. Pearson analysis revealed a negative correlation between exosomal miR-590-5p upregulation and the M1/M2 ratio. Bioinformatics analysis and dual-luciferase assays confirmed that miR-590-5p targets SLC8A3. Western blotting demonstrated increased SLC8A3 expression in aging rat vessels, which was downregulated after BYHWD treatment. Conclusion BYHWD attenuates vascular aging in rats by modulating macrophage M1 polarization and suppressing vascular inflammation via exosomal miR-590-5p-mediated downregulation of SLC8A3.

Graphical abstract

关键词

补阳还五汤 / miR-590-5p / 外泌体 / 巨噬细胞极化 / 血管衰老

Key words

Buyang Huanwu Decoction / miR-590-5p / exosomes / macrophage polarization / vascular aging

人口老龄化是全球共同面临的社会问题，年龄的增长不仅促进心血管疾病（CVD）的发生和发展，同时增加CVD发作的严重性和死亡率^{［1， 2］}。血管衰老是血管的结构及功能随年龄增长而发生退行性改变的过程，是机体衰老的重要表现^［3］。延缓血管衰老是降低CVD发生和发展的重要举措，因此，探寻延缓血管衰老的机制和有效措施已成为当前的研究热点。然而血管衰老进程复杂，目前对其有效干预及相关机制的研究有限^［4］。

中医理论认为，生命的本质在于气血，气虚血瘀是衰老的主要原因^［5］。通过益气活血纠正气虚血瘀之证，是中医抗衰老的主要方法^{［6， 7］}。补阳还五汤作为益气活血的经典名方，研究发现其能通过促进内皮祖细胞增殖和迁移，有效修复血管内皮损伤^{［8， 9］}。此外，该方剂具有清除自由基^［10］、改善免疫功能^［11］等作用。补阳还五汤延缓血管衰老是本课题组基于持续性研究进行的学术创新，研究已发现补阳还五汤能通过上调去乙酰化酶表达抑制衰老相关血管平滑肌细胞（VSMCs）的迁移和侵袭^［12］，通过抑制基质金属蛋白酶Ⅱ的产生和分泌延缓VSMCs衰老^［13］，然而补阳还五汤延缓血管衰老的作用及潜在机制仍未完全阐明。

炎症微环境与衰老细胞的相互作用在衰老进程中发挥关键作用，其中巨噬细胞对炎症微环境的调节尤为重要^［14］。巨噬细胞根据炎症信号可极化为M1型（促炎型）巨噬细胞和M2型（抗炎型）巨噬细胞。巨噬细胞极化失衡与衰老过程中的慢性炎症状态密切相关。外泌体能够调控机体免疫应答，在炎症微环境和衰老的调节中发挥重要作用^［15］。研究表明，补阳还五汤可通过调节小窝蛋白-1介导的外泌体MALAT1/YAP1/HIF-1α轴，促进血管生成^［16］，改善缺血性脑血管疾病的血管功能。外泌体携带的miRNA、mRNA等生物活性分子在血液等体液内传播，介导细胞间的通讯及交互对话。然而，补阳还五汤能否通过外泌体转运特定miRNA调控炎症微环境，介导延缓血管衰老的作用鲜见报道。本课题组前期通过高通量测序发现miR-590-5p在年轻及血管衰老人群的血清外泌体中存在显著差异，并在血管中膜表达。因此，本研究采用D-半乳糖诱导的衰老大鼠模型，通过补阳还五汤干预，检测血管衰老标志物、血清外泌体miR-590-5p表达、血清外泌体中血管标志物与血管巨噬细胞极化情况及miR-590-5p调控的下游靶基因，旨在探讨补阳还五汤延缓血管衰老的作用及外泌体miRNAs相关机制，为防治衰老相关CVD提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

18只4周龄SPF级雄性SD大鼠，购自广东省实验动物中心，动物许可证号：SCXK（粤）2018-0002，动物合格证号：44007200101827。饲养环境：室温20~26 ℃，相对湿度40%~70%，12 h昼夜更替，自由进食和饮水。本研究经广东药科大学动物伦理委员会批准（伦理批号：gdpulacspf2017665），并且遵循实验动物保护法以及动物实验准则。

1.2 细胞与试剂

293T细胞（ATCC）；大鼠衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）ELISA试剂盒（江苏酶免实业有限公司），外泌体提取试剂盒（锐博生物），Evo M-MLV反转录预混型试剂盒、SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒（艾科瑞生物）；双荧光素酶报告基因试剂盒（Beyotime）；miR-590-5p mimic、miR-NC、SLC8A3野生型和突变型报告质粒由乐七生物合成。抗体：p16、p21（万类生物），β-gal（华安生物），CD63、SM-22、CD206（Boster），CD81、CD31（Servicebio），CD86（Abcam），SLC8A3（博奥森生物），GAPDH（Proteintech），辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠/兔IgG（S0002/S0001）（Affinity）。

1.3 补阳还五汤制备

补阳还五汤方剂中所有草药均购自中国广州臻品医药有限公司。黄芪4两（120 g），当归尾二钱（6 g），赤芍一钱半（4.5 g），地龙一钱（3 g），川芎一钱（3 g），红花一钱（3 g），桃仁一钱（3 g）。生药按组分剂量配制混合，洗净，加入10倍量水浸泡30 min，煮沸1 h，过滤。药渣再加入5倍量水煎煮30 min，过滤。合并2次滤液，加热浓缩至浸膏备用（浸膏率为34%）。

1.4 动物造模、分组及给药

将大鼠随机分为3组：对照组（年轻组）、D-半乳糖处理组（衰老组）和补阳还五汤组，6只/组。本实验采用腹腔注射D-半乳糖（300 mg·kg^-1·d^-1，9周）的方式诱导大鼠衰老模型^［17］，补阳还五汤组大鼠于造模第5周开始给予补阳还五汤4.4 g/kg灌胃，1次/d，连续给药4周。年轻组与衰老组灌胃等容积的生理盐水。末次给药后对大鼠行腹主动脉脉搏波传导速度（PWV）检测。然后麻醉大鼠，经腹主动脉取血，分离血清，收集主动脉组织，分装保存于-80 ℃备用或固定于4%多聚甲醛以供进一步实验。

1.5 PWV检测

超声检查前，均匀地将脱毛膏涂抹于待检测大鼠的胸部及腹部，数分钟后用纸巾轻轻拭去残留的脱毛膏和脱落的毛发，使胸腹部区域充分暴露。将大鼠放置于麻醉诱导盒中，使用3%异氟烷诱导麻醉，仪器流速为600 mL/min，麻醉成功后关闭诱导盒麻药气流，将大鼠仰卧固定在恒温板上，实时检测大鼠的生命体征。当大鼠心率稳定后，在胸腹部均匀涂抹超声耦合剂，使用Vevo 3100高分辨率超声成像系统（30 MHz），将探头横放于胸骨及剑突下方，在B模式下寻找腹主动脉，沿长轴扫描图像并获取血管长度；在M模式下测量血管远端和近端时间延迟并获取图像。每张图像测量5次。检测结束后，将大鼠放入保温箱。PWV的计算公式为：PWV（m/s）=血管长度/（远端延时-近端延时）。

1.6 ELISA法检测血管SA-β-gal活性

根据ELISA试剂盒实验步骤进行操作，约1 g大鼠胸主动脉组织充分匀浆，2000 r/min离心20 min后取上清液，用酶标仪测定吸光度A_{450 nm}，通过标准曲线计算样品中大鼠血管SA-β-gal活性。

1.7 免疫组化检测p16、p21和SA-β-gal表达

大鼠胸主动脉用4%多聚甲醛固定后常规脱蜡、梯度乙醇脱水、抗原修复及阻断内源性过氧化物酶。组织切片用5% BSA室温封闭30 min，加入p16、p21、SA-β-gal一抗（1∶150，1% BSA配制）孵育，4 ℃过夜。PBS漂洗3次后滴加二抗，室温孵育50 min，PBS漂洗后滴加DAB显色液，室温孵育10 min。苏木素复染3 min，1%盐酸乙醇分化、氨水返蓝、脱水封片、拍照。

1.8 血清外泌体提取及鉴定

血液标本室温静止30 min，2000 r/min离心30 min后取上清于新管，放置于冰上，加入1/3体积的RiboTM Exosome Isolation Reagent，使用移液器反复吹打，直至溶液呈现浑浊，样本完全混匀。然后4 ℃静置过夜，转移2 mL混合液于2 mL离心管，4 ℃离心机中15 000 r/min离心30 min，弃上清，得到部分外泌体。再次转移2 mL混合液至该离心管，4 ℃离心机中15 000 r/min离心30 min，弃上清，直至将全部混合液转移并离心获得全部的外泌体。将外泌体用PBS重悬后通过BCA法测定蛋白浓度，随后通过Western blotting检测CD63、CD81、CD31和SM-22蛋白表达。

1.9 透射电镜观察外泌体

吸取血清外泌体10 μL滴加在铜网上沉淀1 min，用滤纸吸去浮液，然后滴加醋酸双氧铀10 μL于铜网上沉淀1 min，用滤纸吸去浮液。在常温下干燥数分钟。100 kV条件下进行电镜检测成像，获得透射电镜成像结果。

1.10 纳米颗粒跟踪分析

取出适量外泌体并用PBS稀释成浓度为1×10⁶/mL的溶液，用1 mL注射器将溶液注入到纳米颗粒跟踪分析仪中，检测完成后获取外泌体粒径和分布。

1.11 免疫荧光染色法检测各组大鼠胸主动脉中M1/M2巨噬细胞比例

大鼠胸主动脉用4%多聚甲醛固定后，0.1% Triton X-100通透处理10 min，10%山羊血清常温孵育2 h，加入稀释的CD86抗体（1∶400）和CD206抗体（1∶400）4 ℃过夜。次日，PBS缓冲液洗涤，加入稀释的荧光标记的IgG抗体（1∶500），常温孵育1 h。PBS缓冲液洗涤，DAPI避光染核，清洗多余染料后，抗淬灭封片剂封固，自然晾干，荧光显微镜下观察荧光强度。

1.12 qRT-PCR检测

根据说明书TRIzol法提取总RNA。紫外分光光度仪检测RNA浓度，以1 μg总RNA为模板，按照Evo M-MLV反转录预混型试剂盒说明书配制总体系为10 μL的反转录反应体系，合成cDNA第1链。采用染料法（SYBR Green I）在Agilent StrataGene Mx3000P qPCR仪中进行qRT-PCR，U6用作内参。数据按照2^-ΔΔCt方法处理。所有引物由引物设计软件3.0（Applied Biosystems）设计并由Invitrogen公司合成，序列见表1。

1.13 双荧光素酶报告基因分析

设计及合成包含miR-590-5p结合位点的靶基因3'-UTR片段，将其插入至含荧光素报告基因的pGL3-control载体中，构建成SLC8A3报告质粒（野生型）。 同时构建SLC8A3突变型报告质粒。293T细胞转染前1 d传代至24孔板，第2天细胞生长60%~80%密度时，使用Lipofectamine 3000进行miR-590-5p mimic和SLC8A3报告质粒联合转染。24 h后使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒在具有检测化学发光功能的多功能酶标仪（BioTek Synergy H1）上检测荧光素酶活性。

1.14 Western blotting检测SLC8A3蛋白表达

用PBS缓冲液冲洗胸主动脉，将血管组织移入匀浆器，加入含蛋白酶抑制剂的组织裂解液进行研磨，4 ℃条件下15 000 r/min离心10 min，取上清即组织总蛋白。15~30 μg组织蛋白样品，10% SDS-PAGE电泳，200 mA恒流90 min转移至硝酸纤维素薄膜，放入封闭液中室温封闭2 h，一抗（SLC8A3 1∶500；GAPDH 1∶50 000）4 ℃过夜。反复洗膜后，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠/兔IgG（1∶5000）室温孵育1 h，洗膜后，滴加曝光液，放入化学发光检测仪显影。

1.15 统计学分析

使用GraphPad 9.0进行数据分析，所有实验均至少重复3次。计量数据以均数±标准差表示，使用Shapiro-Wilk检验和F检验检查数据的正态性和方差齐性，组间比较采用未配对双侧t检验，Pearson相关性分析用于检验血清外泌体miR-590-5p与M1/M2巨噬细胞比例的相关性，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 补阳还五汤延缓血管衰老

与年轻组相比，衰老组大鼠的腹主动脉PWV升高（P<0.001），而补阳还五汤干预降低了衰老大鼠的PWV（P<0.01，图1A）。ELISA法及免疫组织化学染色结果显示，衰老组大鼠主动脉的SA-β-gal活性升高（P<0.01）、p16/p21/SA-β-gal表达上调（P<0.05），补阳还五汤干预逆转了衰老引起的上述变化（P<0.05，图1B、C）。

2.2 补阳还五汤上调血清外泌体miR-590-5p表达

从年轻组、衰老组及补阳还五汤干预组的大鼠血清中分离出外泌体并对其进行鉴定，结果显示，分离的血清外泌体大小分布在50~150 nm，在约70 nm处达到峰值（图2A）。透射电镜扫描图像显示外泌体具有经典的双凹状囊性小泡结构（图2B），符合外泌体的典型形态。Western blotting结果显示，外泌体特异性表面标志物CD63和CD81呈高表达（P<0.01，图2C），并且表达血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的标记蛋白CD31和SM-22（图2D）。qRT-PCR检测结果显示，与年轻组相比，衰老组血清外泌体中miR-590-5p表达下调（P<0.001）；与衰老组相比，补阳还五汤干预组血清外泌体中miR-590-5p表达上调（P<0.001，图2E）。

2.3 血清外泌体miR-590-5p与血管巨噬细胞激活相关

免疫荧光染色检测结果显示，衰老血管中M1/M2巨噬细胞比例升高（P<0.01），而补阳还五汤降低血管中M1/M2巨噬细胞比例（P<0.01，图3A、B）。与免疫荧光染色结果一致，IL-6、IL-1β等M1巨噬细胞特异性细胞因子的表达水平在衰老组大鼠主动脉中升高（P<0.01），而在补阳还五汤干预组中下降（P<0.05，图3C）。相反，IL-4、IL-10等M2巨噬细胞特异性细胞因子的表达水平在衰老组中降低（P<0.01），而在补阳还五汤干预组中升高（P<0.05，图3D）。Pearson相关性分析显示，血清外泌体miR-590-5p表达升高与M1/M2巨噬细胞比例呈负相关（P<0.05，图3E）。

Fig.3　miR-590-5p expression in serum exosomes is associated with activation of vascular macrophages. A: Representative IFA images of CD86 and CD206 staining in the vascular tissue (×40; n=3). B: Quantification of the ratio of M1/M2 macrophages (n=3). C, D: Expression of IL-6, IL-1β, IL-4 and IL-10 mRNA in the vascular tissue of the rats (n=4) detected by qRT-PCR. E: Correlation analysis between serum exosomes miR-590-5p expression and the ratio of M1/M2 vascular macrophages. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

2.4 miR-590-5p靶向SLC8A3基因并负调控SLC8A3蛋白表达

TargetScan预测miR-590-5p与SLC8A3基因的3’-UTR存在结合位点（图4A）。双荧光素酶报告基因实验证实，与联合转染miR-NC和野生型SLC8A3报告质粒组相比，联合转染miR-590-5p mimic和野生型SLC8A3报告质粒组的荧光素酶活性降低（P<0.05）；联合转染miR-NC和突变型SLC8A3报告质粒组与联合转染miR-590-5p mimic和突变型SLC8A3报告质粒组相比，荧光素酶活性差异无统计学意义（图4B）。大鼠血管组织SLC8A3蛋白表达结果显示，衰老组表达水平上调（P<0.05），而补阳还五汤干预可下调其表达水平（P<0.05，图4C）。

3 讨论

本研究通过D-半乳糖诱导的大鼠衰老模型，揭示了补阳还五汤可能通过增加外泌体转运miR-590-5p，靶向调控SLC8A3表达，进而促进血管巨噬细胞M2极化，减少促炎细胞因子并增加抗炎细胞因子的分泌，发挥延缓血管衰老的作用。PWV作为血管功能和结构的无创检测，对诊断和监测衰老以及与衰老相关CVD具有重要意义^［18］。本研究发现补阳还五汤可显著降低衰老大鼠的PWV，并能够降低衰老血管中SA-β-gal活性及衰老标志物p16/p21/SA-β-gal的表达，延缓血管衰老。补阳还五汤的有效成分主要为黄芪甲苷、阿魏酸、芍药苷、红花黄色素、川芎嗪等，这些成分已被证明具有抗氧化、抗衰老等作用^［19］。研究表明，黄芪-当归配伍可以提高衰老小鼠脏器指数，改善氧化应激反应，发挥延缓衰老的作用^［20］；川芎能有效提高小鼠体内抗氧化酶含量，清除自由基延缓机体衰老^［21］；红花的活性成分羟基红花黄色素A可通过抑制p16-Rb通路改善肝脏衰老^［22］。课题组前期通过体外实验证实了补阳还五汤含药血清可降低SA-β-gal阳性细胞的百分率，能显著地延缓VSMCs衰老^［13］。本研究从体内实验的角度再次明确了补阳还五汤延缓血管衰老的作用。

外泌体通过胞吐的方式释放到细胞间隙，通过膜上特异性配体与靶细胞结合，从而进行细胞间精准的信息传递及物质交换^［23］，调节靶细胞的基因表达和功能状态。课题组前期通过高通量测序发现miR-590-5p是年轻及血管衰老人群血清外泌体中差异表达miRNA，且可在血管中膜表达。本研究发现，分离的血清外泌体能够表达血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的标记蛋白CD31和SM-22，衰老组血清外泌体中miR-590-5p表达显著下调，而补阳还五汤能够上调血清外泌体miR-590-5p表达，提示补阳还五汤延缓血管衰老的作用可能与血清外泌体携带的miR-590-5p相关。研究表明，衰老细胞外泌体中富集的非编码RNA与衰老相关疾病的发生密切相关，如动脉粥样硬化、2型糖尿病、骨质疏松症等^［24］。研究显示，老年小鼠的MALAT1表达降低，而含MALAT1的人脐带间充质干细胞来源外泌体可预防衰老诱导的小鼠心脏功能障碍及过氧化氢诱导的H9C2心肌细胞衰老^［25］，或通过递送miR-675靶向下调转化生长因子β1，降低H9C2细胞中衰老相关标志物的表达，其中miR-675被发现是衰老的候选标记^［26］。目前，中医药对血清外泌体的研究还相对较少，处于初步探索阶段。既往研究发现，补阳还五汤能够改变急性脑梗死患者的血清外泌体lncRNA表达谱，推测补阳还五汤可能通过调控这些lncRNA的表达水平，发挥抗脑缺血损伤的作用^［27］。本研究从外泌体的角度探讨补阳还五汤延缓血管衰老的作用机制，为后续的基础及临床研究提供了新思路。

近年来，炎症性衰老学说在国际学术界日益受到重视。该学说认为，随着年龄的增长，低级别、可控、无症状的全身性慢性炎症逐渐增强，进而促进衰老相关疾病的发生。促炎细胞因子水平的升高，导致处于稳态的血管内环境发生病理变化，更易于发生氧化应激反应，最终引起血管衰老，并引发动脉粥样硬化、高血压等疾病。本研究结果显示，衰老血管中M1/M2巨噬细胞比例显著升高，在补阳还五汤干预后该比例下调，并且血清外泌体miR-590-5p表达升高与M1/M2巨噬细胞比例呈负相关。这表明补阳还五汤可能通过上调血清外泌体携带的miR-590-5p，抑制巨噬细胞M1极化，促进巨噬细胞M2极化，减轻血管炎症激活，从而延缓血管衰老。特定的miRNA如miR-155、miR-126和miR-21等已被证实在血管炎症反应中起调控作用，通过影响NF-κB、MAPK和JAK-STAT等炎症信号通路的关键分子，参与炎症反应的调控。目前对于miR-590-5p的研究大多集中在肿瘤发展及细胞增殖与凋亡方面^［28］，例如，miR-590-5p可下调RTN4进而调节心力衰竭引起的心肌肥大和心肌细胞凋亡^［29］，或通过靶向YAP抑制肠道炎症及结直肠癌的发生^［30］。

SLC8A3基因编码的钠钙交换蛋白3是一种双向转运蛋白，在多种组织和细胞中参与钙离子稳态的调节^［31］。钙离子稳态对线粒体代谢及信号转导至关重要，短暂升高的钙离子可促进线粒体正常氧化呼吸和ATP生成，但过高的钙离子浓度可导致线粒体膜电位损伤、活性氧生成增多及线粒体DNA释放，从而激活炎症并促使巨噬细胞向促炎表型（M1型）极化^{［32，33］}。新进研制出的一种线粒体钙纳米调节剂能够特异性靶向线粒体钙离子通道，阻断过量钙内流，改善线粒体功能并改变巨噬细胞极化方向^［34］。本研究通过生物信息学分析预测miR-590-5p可能靶向调控SLC8A3，并通过双荧光素酶报告实验验证了这一相互作用。此外，Western blotting实验结果进一步表明，衰老组血管组织中SLC8A3表达水平显著上调，而补阳还五汤干预后其表达下调。这些结果表明，补阳还五汤可能通过上调miR-590-5p表达，进而靶向抑制SLC8A3，促进血管巨噬细胞向M2型极化，从而发挥延缓血管衰老的作用。既往研究表明，钠钙交换蛋白的表达在衰老状态下升高^［35］，这与本研究结果一致。此外，miR-590-5p还可靶向调控钙结合蛋白S100A10的表达，从而在肝细胞癌中发挥保护作用^［36］。然而，SLC8A3与血管衰老的确切关系和作用机制仍需更多的体内外研究进一步阐明。

随着延缓血管衰老、降低衰老相关CVD风险机制研究的大量开展，清晰地阐明补阳还五汤在干预血管衰老过程中的具体作用机制对于指导临床实践具有重要意义。然而，本研究也存在一些不足之处，例如血清外泌体miR-590-5p与血管组织的确切关系及其对血管巨噬细胞极化的调控机制，还需通过更多的体内外实验进一步深入研究，从而为补阳还五汤可能成为预防及治疗衰老相关CVD的药物提供重要的实验数据支持。

参考文献

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