补阳还五汤通过调控外泌体miR-590-5p介导的巨噬细胞极化延缓大鼠血管衰老

摘要

目的 探讨补阳还五汤对血管衰老的延缓作用机制是否与外泌体miR-590-5p介导的巨噬细胞极化有关。方法 将18只雄性SD大鼠随机分为年轻组、衰老组和补阳还五汤组，6只/组。通过腹腔注射D-半乳糖300 mg·kg^-1·d^-1建立衰老模型，补阳还五汤组灌胃补阳还五汤4.4 g/kg，年轻组、衰老组给予等量生理盐水。Vevo 3100高分辨率超声成像系统检测大鼠腹主动脉脉搏波传导速度（PWV）。分离胸主动脉，ELISA法测定血管组织衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性；免疫组织化学法检测p16、p21和SA-β-gal表达。提取各组大鼠血清外泌体并通过纳米颗粒跟踪分析及透射电镜观察外泌体的大小及形态；Western blotting检测血清外泌体表面标记物（CD63和CD81）、血管内皮细胞和血管平滑肌细胞标记蛋白（CD31和SM-22）;qRT-PCR检测血清外泌体中miR-590-5p表达；免疫荧光染色和qRT-PCR检测巨噬细胞M1/M2比例及炎性细胞因子表达；生物信息学分析预测miR-590-5p靶基因；双荧光素酶报告基因实验验证miR-590-5p与SLC8A3的靶向关系；Western blotting检测血管组织中SLC8A3表达。结果 与年轻组相比，衰老组大鼠腹主动脉PWV升高（P<0.001），血管中p16、p21和SA-β-gal表达增加（P<0.05）；与衰老组相比，补阳还五汤组能够逆转衰老引起的上述变化（P<0.05）。提取的血清外泌体大小为50～150 nm，呈现经典的双凹状囊性小泡结构。分离的血清外泌体不仅表达外泌体表面标记CD63和CD81，还可表达血管内皮细胞及血管平滑肌细胞标记蛋白CD31和SM-22。与年轻组相比，衰老组大鼠血清外泌体中miR-590-5p表达下调（P<0.001），血管中M1和M2巨噬细胞比例（P<0.01）以及M1巨噬细胞特异性细胞因子白细胞介素6和白细胞介素1β升高（P<0.01）,M2巨噬细胞特异性细胞因子白细胞介素4和白细胞介素10降低（P<0.01）。与衰老组相比，补阳还五汤组上调衰老大鼠血清外泌体中miR-590-5p表达（P<0.001），抑制衰老血管巨噬细胞M1极化（P<0.05）。Pearson相关性分析显示，血清外泌体miR-590-5p表达升高与M1/M2巨噬细胞比例呈负相关（P<0.05）。生物信息学分析显示，miR-590-5p与SLC8A3基因序列存在特异性互补结合位点，双荧光素酶报告实验证实miR-590-5p靶向SLC8A3基因并负调控SLC8A3表达（P<0.05）。Western blotting表明，与年轻组相比，衰老组血管组织中SLC8A3表达升高（P<0.05）；与衰老组相比，补阳还五汤组中SLC8A3表达下调（P<0.05）。结论 补阳还五汤通过增加外泌体转运miR-590-5p靶向抑制SLC8A3基因表达，改善血管巨噬细胞M1极化及炎性细胞激活，进而延缓血管衰老。

关键词

补阳还五汤 / miR-590-5p / 外泌体 / 巨噬细胞极化 / 血管衰老