敲除CDC20可明显抑制宫颈癌细胞的增殖及侵袭转移

CRISPR-Cas9-mediated CDC20 gene knockout inhibits cervical cancer cell proliferation, invasion and metastasis

摘要

目的 探讨细胞分裂周期蛋白20（CDC20）在宫颈癌中的功能及其对宫颈癌C33A细胞增殖、迁移以及侵袭的影响和作用机制。 方法 TCGA数据库分析CDC20在宫颈癌组织中的表达情况，免疫组化（IHC）检测宫颈癌组织与癌旁组织中的CDC20和β-Catenin蛋白表达水平。利用CRISPR/Cas9设计CDC20基因双靶点的sgRNA2＆7序列，构建重组质粒并测序验证。将宫颈癌细胞C33A按转染的质粒不同分为sgRNA-NC组和sgRNA-CDC20组，通过qRT-PCR和Western blotting检测CDC20的mRNA和蛋白表达水平，平板克隆检测其增殖能力，流式细胞术检测细胞周期和凋亡水平；Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力。将2组C33A细胞分别接种于裸鼠（5只/组）双侧腋下左、右两侧，定期监测肿瘤体积并绘制其生长曲线，称取裸鼠体质量并脱臼处死。Western blotting分别检测细胞和瘤体组织中的CDC20和 β-Catenin蛋白的表达水平；免疫共沉淀（CoIP）和免疫荧光共定位验证CDC20与β-Catenin的相互作用。 结果 CDC20和β-Catenin在宫颈癌组织中的表达高于癌旁组织（P<0.001）。体外细胞实验结果显示：与sgRNA-NC组细胞比较，sgRNA-CDC20敲除株的细胞增殖能力下降（P<0.001）且细胞凋亡显著升高（P<0.01）；迁移和侵袭能力受到明显抑制（P<0.05）。体内动物实验结果显示：与sgRNA-NC组比较，sgRNA-CDC20组的瘤体体积生长曲线明显减小（P<0.05），但裸鼠体质量无明显变化（P>0.05）；sgRNA-CDC20组中的细胞和组织中的CDC20和β-Catenin的蛋白水平明显降低（P<0.05），免疫共沉淀（CoIP）和免疫荧光验证CDC20和β-Catenin存在相关性。 结论 CDC20在宫颈癌组织、细胞以及瘤体中的表达明显升高，敲除CDC20可明显抑制C33A细胞的增殖和侵袭转移能力，并促进凋亡，其机制可能与Wnt/β-Catenin信号通路密切相关。

Abstract

Objective To study the effect of CDC20 knockdown on proliferation, migration and invasion of cervical cancer cells and its underlying mechanism. Methods CDC20 expression in cervical cancer tissues was analyzed using the TCGA database, and the protein expressions of CDC20 and β-Catenin in clinical specimens of cervical cancer and adjacent tissues were detected using immunohistochemistry. A dual target sgRNA2&7 sequence for CDC20 gene was designed for CDC20 gene knockdown in cervical cancer C33A cells using CRISPR/Cas9 technology, and CDC20 mRNA and protein expression levels in the transfected cells were detected using qRT-PCR and Western blotting. The changes in proliferation, cell cycle, apoptosis, migration and invasiveness of the transfected cells were evaluated using colony-forming assay, fluorescence activated cell sorting (FACS) and Transwell assay. In the animal experiment, naïve C33A cells and the cells with CDC20 knockdown were injected subcutaneously into the left and right axillae of nude mice (n=5) to observe tumor growth. The expressions of CDC20 and β-Catenin proteins in transfected cells and the xenograft were analyzed using Western blotting, and their interaction was confirmed by co-immunoprecipitation (CoIP) and immunofluorescence co-localization assays. Results Cervical cancer tissues expressed significantly higher CDC20 and β‑Catenin levels than the adjacent tissues. C33A cells with CDC20 knockdown showed reduced proliferation, increased apoptosis, and lowered migration and invasion abilities. CDC20 knockdown significantly suppressed the growth of C33A cell xenograft in nude mice, and the tumor-bearing mice did not exhibit obvious body mass changes. CDC20 and β-Catenin levels were both significantly lowered in C33A cells with CDC20 knockdown. Co-immunoprecipitation and co-localization assays confirmed the interaction between CDC20 and β‑Catenin. Conclusion CDC20 is highly expressed in cervical cancer tissues, and CDC20 knockdown can suppress proliferation, invasion, and metastasis while enhancing apoptosis of C33A cells, which is closely related with the regulation of the Wnt/β-Catenin signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

CRISPR/Cas9 / CDC20 / 宫颈癌 / Wnt/β-Catenin

Key words

CRISPR/Cas 9 / CDC20 / cervical cancer / Wnt/β-Catenin

宫颈癌（CC）是最常见的妇科恶性肿瘤之一，据最新统计分析，每年约有50万新发病例和27万死亡病例，虽然随着人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗的普及和宫颈癌筛查技术的不断更新有助于及早发现和预防，但对于中晚期患者的治疗效果不佳且病死率呈年轻化增长趋势^［1-3］。侵袭和转移是判别宫颈癌预后的关键，与细胞的异常增殖、凋亡，原癌基因的激活与抑癌基因的表达水平改变以及细胞内信号通路失调等密切相关^［4］。

细胞分裂周期蛋白20（CDC20）作为关键的细胞周期调节基因，在细胞周期进程中发挥着关键作用。许多研究表明，CDC20的失调与恶性实体瘤的多种病理过程有关，包括肿瘤发生、进展、放化疗耐药和不良预后等，为癌症诊断和预后提供了生物标志物^［4］。Gayyed等^［5］研究发现在肝癌组织中CDC20呈高表达，并与肿瘤的不良分化及TNM分期相关，是肝癌的不良预后因子，抑制CDC20表达能减慢肿瘤细胞的生长速度并诱导细胞 G2/M 期停滞。Song等^［6］研究表明CDC20在多种类型的乳腺癌样品中呈高表达且患者的生存情况较差，提示CDC20可能与乳腺癌的进展和不良预后密切相关；敲低CDC20水平后抑制乳腺癌细胞的增殖并诱导其凋亡。研究发现 CDC20在卵巢癌组织中高表达，且与组织学和肿瘤分级相关，敲低CDC20后，卵巢癌细胞的增殖和迁移能力下降，凋亡增加^［7］。Liu等^［8］在膀胱癌组织中发现CDC20呈高表达与化疗和放疗耐药性之间存在潜在关联，且较低的甲基化水平与较差的预后显著相关。CDC20的沉默可通过降低β-连环蛋白水平来抑制前列腺癌的生长^［9］。 此外，研究还发现CDC20的敲除增加了细胞凋亡，并通过抑制Wnt/β-Catenin通路降低了皮肤癌细胞的迁移能力^［10］。通过多组生物信息学分析筛选和鉴定CDC20在宫颈癌和子宫内膜癌呈高表达^{［11，12］}，与其发生发展密切相关。

CRISPR/Cas9作为一种新兴的基因治疗方法，在肿瘤研究中取得了显著的进展。该技术通过RNA引导的核酸酶Cas9，在基因组中进行精确的切割和编辑，从而实现对特定基因的功能研究和调控，能够有效地消除耐药性恶性肿瘤，加深了对肿瘤发生机制的理解^［13］。目前针对于CDC20的研究主要是侧重于肿瘤恶性度以及临床预后意义，其发病机制复杂，虽有研究表明宫颈癌的发生发展与Wnt/β-Catenin信号通路的异常激活密切相关^［14-16］，但有关CDC20与Wnt/β-Catenin通路如何影响侵袭转移，二者之间是否存在关联，其具体作用机制仍不清楚。因此，本研究拟通过TCGA数据库分析CDC20和β-Catenin在宫颈癌组织和癌旁组织中的表达，利用CRISPR/Cas9双靶点敲除CDC20后的C33A细胞在体内、外功能上的变化及其在宫颈癌发生中的作用及其相关的分子机制，为以后针对CDC20的靶向治疗提供理论和实验基础。

1 资料和方法

1.1 材料

1.1.1 临床组织标本的采集与细胞系

本研究所需的宫颈癌组织和其癌旁组织标本均从湘南学院附属医院中获取，收集2018年3月~2021年12月于妇产科住院经术后病理检查确诊的患者，年龄29~73岁（其中宫颈腺癌59例和鳞癌93例），并将所有收集到的标本进行常规切片并染色。本研究已获得湘南学院实验动物福利伦理委员会（NO：2024DWLL012）和医学伦理委员会的批准（NO：2024YXLL014）以及受试者签署的知情同意书。人宫颈癌细胞系C33A和胚肾细胞293T均购自于湖南丰晖生物公司细胞库。

1.1.2 主要试剂

胎牛血清、DMEM培养基、G418、胰酶和青链霉素双抗（Genview）；TRIzol试剂（QIAGEN）；逆转录试剂盒（ABI）；SYBR pre-mix Ex Taq Ⅱ试剂盒（TaKaRa）；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、ECL显色液以及BeyoECL Plus（超敏ECL化学发光试剂盒）、Cy3标记山羊抗兔IgG（H+L）和Cy3标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（上海碧云天生物技术有限公司）；PVDF膜（Milli-pore）；Transwell小室（Corning Costar）；BD Matrigel基质胶（BD）；Western blotting蛋白预染Marker，兔抗人CDC20和β-Catenin抗体以及鼠抗人GAPDH和β-actin抗体（Proteintech），标记的山羊抗兔和抗鼠IgG荧光二抗（KPL）。Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡试剂盒以及细胞周期试剂盒（上海浮生生物公司）。感受态Stb13（北京全式金生物技术有限公司）；Cas9病毒（sgRNA-NC、sgRNA-CDC20）（上海吉凯基因有限公司）；Lipofectamine3000（Invitrogrn）。CDC20-knockout质粒及其Control质粒于本实验室保存。由湖南通用生物系统有限公司完成引物和测序。

1.2 方法

1.2.1 生物信息分析

由TCGA数据集（http：//cancerg enome.nih.gov/portal gdc cancer gov）提供宫颈癌患者CDC20基因表达的微阵列数据和相应的临床数据，分别包含306例的宫颈癌患者和13例正常组织。基因表达谱的数据采用Bioconductor软件中的SVA软件包对其进行归一化^［17］。

1.2.2 免疫组化检测CDC20和β-Catenin 蛋白的表达水平

按照免疫组化的常规操作进行。宫颈癌组织和其癌旁组织标本用4%多聚甲醛固定，60 ℃烤片后制作蜡片，置于二甲苯中10 min，2次。依次在100%，95%，85%和75%乙醇放置5~10 min；蒸馏水浸洗5 min。后浸入柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0），加热、冷却，0.01 mol/L PBS（pH7.2~7.6）洗涤3 min×3次，分别加3%过氧化氢溶液10 min以灭活内源酶，PBS冲洗3 min×3次；切片滴加5%羊血清放入湿盒中，室温20 min。PBS洗涤3 min×3次；滴加适当稀释的一抗［（抗CDC20（FAB，Fab2490，at 1∶200）和 β-Catenin（FAB，Fab1976，at 1∶200）兔单克隆抗体；4 ℃过夜，然后二抗室温孵育2 h（羊抗兔 IgG；Servicebio，GB23303）20 min，对照组滴加等量PBS，4 ℃过夜；孵育二抗；用PBS冲洗后显色处理；蒸馏水洗涤，浸泡于苏木素中复染，蒸馏水冲洗，PBS返蓝；各级酒精（60%~100%）脱水5 min；置于二甲苯封片。在显微镜下进行观察并拍照。CDC20和β-Catenin染色结果由2名本校的病理学专家审阅评估，其染色强度通过ImagJ软件进行量化。

1.2.3 基于CRISPR/Cas9的基因敲除细胞系构建CDC20基因敲除的宫颈癌细胞模型

在NCBI数据库获取CDC20的基因序列（NM_001255.3），然后在http：//crispr.mit.edu/上设计2条sgRNA作为敲除靶位点（表1），构建到cas9病毒载体上，测序合格后，使用HEK293T细胞包装慢病毒（由上海吉凯基因有限公司完成）。HEK293T细胞转染前1 h更换为含2%血清培养基，加入所制备的各DNA溶液（pLentic-CRISPR-CDC20-sgRNA质粒20 μg、pHelper 1.0载体质粒15 μg、pHelper 2.0载体质粒10 μg）与相应体积的转染试剂（上海吉凯基因，GRCT105）混合均匀，调整总体积为 1mL 的转染体系，转染48 h后收集细胞上清液，4 ℃，4000 g离心10 min；除去细胞碎片及杂质，以 0.45 μm滤器过滤上清液于超速离心管中，4 ℃，25 000 r/min离心2 h后弃去上清，加入病毒对应体积保存液，10 000 r/min离心5 min后，取上清，于-80 ℃保存病毒。

将处于对数生长期的C33A细胞，用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，待细胞生长状态良好时进行病毒（sgRNA-NC病毒和sgRNA-CDC20病毒）感染；根据体系计算感染增强剂用量，将病毒与增强剂进行混合。把混合液加入到细胞培养板中，24 h后镜下观察荧光，出现荧光则换完全培养基继续培养24~48 h；加入嘌呤霉素进行稳筛，收集细胞，进行后续检测。

1.2.4 qRT-PCR和Western blotting检测敲除细胞系中CDC20 mRNA和蛋白的表达

将各组C33A细胞中CDC20 mRNA和Western blotting检测方法均参照参考文献^［18-20］。qRT-PCR 反应体系为10 μL，包括：2×SYBR Green I mix（全式金，AQ601-04） 5 μL；正反向引物工作液（10 μmol/L）各0.3 μL；cDNA模板2 μL；无菌水2.4 μL。每个时间点均含3个复孔。PCR反应条件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s；60 ℃ 15 s；72 ℃ 10 s；40个循环。在ABI 7500实时荧光定量PCR系统中检测CDC20的mRNA表达水平，基因的相对表达按照2^-ΔΔCt方法计算，目的基因的定量表达通过与内参基因GAPDH比较进行分析，利用引物（表2）对sgRNA的基因片段进行PCR扩增。Western blotting检测是将各组对数生长期细胞加入RIPA细胞裂解液；4 ℃下离心，上清转移至离心管中，蛋白定量检测；将标准品（1 mg/mL BSA）按0、1、2、4、6、8、10 μL的量分别加入96孔板中，各孔加入200 μL BCA工作液（37 ℃，30 min）；冷却至室温，酶标仪测定吸光度值A_{562 nm}；上样，进行SDS-PAGE电泳；硝化纤维素膜电转系统转膜，以非共价键形式吸附蛋白质；5% milk-PBST完全浸没，4 ℃过夜；5% BSA-PBST稀释一抗（CDC20 1∶500，GAPDH 1∶5000），4 ℃过夜，洗膜；PBST稀释二抗（1∶5000），室温孵育，洗膜；用ECL发光剂显色曝光。经Image J软件分析灰度值，计算sgRNA-CDC20组中的CDC20基因及蛋白水平的敲除效率。

1.2.5 CDC20基因敲除后检测C33A细胞的克隆形成能力

取对数生长期细胞以3×10⁵/皿的细胞密度分别接种于6孔板中，置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养，待细胞汇合度达到50%左右时开始感染sgRNA-NC和sgRNA-CDC20病毒，48 h后分别消化收集各组细胞，再以300/皿的数量接种于６孔板中，置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养；3周后可见单克隆细胞，终止培养；4%多聚甲醛固定；1%结晶紫染色；干燥；将皿叠加一张带网格的透明胶片倒置一张白纸上干燥，拍照记录实验结果。最终对克隆形成的细胞集落数进行计数统计。

1.2.6 流式细胞仪检测CDC20基因敲除对C33A的细胞周期和凋亡

周期检测：取对数期细胞；胰蛋白酶消化；中和；离心弃上清；预冷PBS洗涤；离心弃上清；200 μL 5%胎牛血清的PBS重悬浮细胞；预冷75%乙醇的PBS溶液固定过夜（-20 ℃）；PBS洗涤；加入200 μL 2 μg/mL RNAase溶液，静置；加入PI使终浓度为5 μg/mL；染色；加测试剂制单细胞悬液；进行流式细胞仪检测。利用Modfit软件分析细胞周期以确定细胞周期分布。 凋亡检测：取对数生长期的各组C33A细胞用胰蛋白酶消化；调整细胞密度，孵育过夜（37 ℃、5% CO₂）；离心并弃上清；4 ℃预冷生理盐水洗涤；加入500 μL结合液重悬细胞；加5 μL Annexin V-FITC和5 μL7-AAD轻轻混匀，室温避光孵育15 min；上样；流式细胞仪检测，FlowJo软件分析细胞凋亡的比例。

1.2.7 Transwell 检测CDC20基因敲除对细胞体外迁移和侵袭能力

迁移：分别消化收集各组细胞，用无血清培养基重悬细胞；加500 μL10% FBS至下室；加300 μL细胞悬液于细胞培养箱（37 ℃、5% CO₂）；4%多聚甲醛固定；擦拭；染色；PBS洗涤，干燥；100倍显微镜拍照，PBS进行细胞计数，计算各孔的穿过去的细胞数量。实验重复3次。采用ImageJ 软件进行结果分析。 侵袭：消化；无血清培养基重悬细胞；无血清培养基稀释Matrigel基质胶加入小室；凝固；出现白色层时取出小室；水化；后续操作同以上。

1.2.8 动物成瘤实验

BALB/C裸鼠15只，SPF级饲养，雌性，5~6周龄，体质量（20.3±0.4）g。将其随机分为2组，5只/组，分别为（sgRNA-NC）组和（sgRNA-CDC20）组。适应性喂养1周后，将2组C33A细胞重悬成细胞悬液（5×10⁶/mL）分别接种于裸鼠双侧腋下左、右两侧，接种细胞后每隔5 d对裸鼠进行体质量称量和肿瘤体积测量；25 d后，对10只裸鼠进行脱臼处死，并按要求剥离瘤体，测量瘤体体积并绘制肿瘤生长曲线和进行常规石蜡切片及HE染色，全切片扫描拍照。肿瘤体积计算公式：V=L×W²/2 （L∶肿瘤长度，W∶肿瘤宽度）。

1.2.9 Western blotting检测CDC20基因敲除后对C33A细胞中相关蛋白表达水平的影响

取裸鼠宫颈癌瘤体组织标本，研磨后加入RIPA裂解液，离心取上清液，用BCA试剂盒测定总蛋白质浓度，分装保存（-80 ℃）；上样；SDS-PAGE电泳；硝化纤维素膜转膜；5%脱脂奶粉封闭2 h，4 ℃一抗孵育过夜；室温二抗孵育1 h，ECL显色、曝光；GAPDH作为内参计算各组相对表达量；再用Image J软件进行灰度定量。以上Western blotting各个步骤均按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒标准流程进行操作并参照参考文献^［18-20］。

1.2.10 CDC20与β-Catenin的免疫共沉淀（Co-IP）验证

取对数生长期的C33A细胞，向其加入RIPA细胞裂解液；冰上裂解；超声破碎细胞；离心取上清液；加入抗体孵育（4 ℃，4 h）；蛋白质G琼脂糖凝胶混合；每个EP离心管加入20 μL protein A/G beads；孵育（4 ℃ 2 h）；每管加入20 μL的蛋白A/G 磁珠并孵育（4 ℃ 2 h）；取免疫沉淀（IP）管；离心；分离磁珠beads；冷磷酸盐缓冲液洗涤沉淀，加50 μL的2×SDS，煮样5 min，；4 ℃下离心；以鼠抗CDC20和兔抗β-Catenin单克隆抗体（均按照1∶2000 稀释）集上清液进行免疫印迹分析。其余步骤同1.2.9。

1.2.11 CDC20和β-Catenin免疫荧光共定位

2组细胞收集按1.2.5方法；生理盐水浸洗；4%的多聚甲醛固定；浸洗；0.5% Triton X-100（ PBS配制）室温通透；浸洗；滴加一抗（1∶200）；4 ℃孵育过夜；加荧光二抗；37 ℃湿盒中孵育1 h；浸洗；滴加DAPI避光孵育；染核；浸洗；在荧光显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学分析

实验数据结果均采用均数±标准差表示，多组样本间的均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两组样本间的均数比较采用t检验和 Wilcoxon 秩检验对CDC20基因在宫颈癌和癌旁组织中的表达量进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。采用SPSS 26.0统计软件进行数据的统计学分析GraphPad Prism 9.0 软件制图和Adobe Illustrator Cs 7计算机软件绘制图像。

2 结果

2.1 CDC20在宫颈癌组织中高表达

通过TCGA 数据库中宫颈癌组学数据分析显示，CDC20在宫颈癌组织（n=306）中高表达，与正常宫颈组织（n=13）比较差异有统计学意义（P<0.001，图1A）。生存分析结果显示宫颈癌患者组织中CDC20高表达患者较CDC20低表达患者生存期短，即高表达的CDC20预示了宫颈癌患者的不良预后（图1B）。同时收集了湘南学院附属医院2018~2021年随访队列中的218例宫颈原位癌手术切除患者（包括年龄、病理类型、肿瘤分化程度、临床分期和淋巴结转移），分析显示患者年龄多为40~60岁，宫颈鳞癌患者多于腺癌（表3）；CDC20在宫颈鳞癌中阳性表达高于腺癌，但差异无统计学意义（P>0.05），临床分期以及淋巴结转移密切相关（P<0.05，表4）。

2.2 免疫组化检测CDC20和β-Catenin在宫颈癌组织和其癌旁组织中的表达

在宫颈癌组织中，CDC20蛋白在基底层、中间层以及表层细胞的细胞膜和细胞质中有表达（黄色或棕黄色，图2A），而β-Catenin主要集中于基底层的细胞质中表达，其表达为黄色或棕黄色（深的可至褐色，图2C）；在宫颈癌旁组织中，CDC20蛋白细胞质无着色（图2B），而β-Catenin蛋白在棘层与上皮基底层细胞膜表达（图2D），在宫颈癌组织中 CDC20和β-Catenin阳性表达率高于癌旁组织（图2E、F，P<0.01）。其结果与TCGA数据分析结果一致（图2）。

2.3 CRISPR-Cas9 系统构建CDC20敲除细胞系的测序验证

CDC20-sgRNA 2&7感染细胞（C33A）后提取基因组DNA经PCR扩增后进行Sanger测序，凝胶电泳结果和测序结果均显示：在sg2和sg7位置有预期的剪切（图3A、B），CDC20敲除细胞系在基因组上有预期的剪切效果，可用于后续qRT-PCR和Western blotting验证。

2.4 慢病毒感染及qRT-PCR和Western blotting检测CC3A细胞中的CDC20基因敲除情况

将细胞转染CDC20敲除病毒后，选择5 μg/mL嘌呤霉素筛选后在荧光显微镜下观察sgRNA-NC组和sgRNA-CDC20组均有绿色荧光表达（图4A~A₂，图4A~A₄）。

qRT-PCR结果显示：CDC20基因敲除C33A细胞CDC20 mRNA表达量（0.07±0.00）低于sgRNA-NC组（1.00±0.50）（P<0.05，图4B）。Western blotting结果显示，在sgRNA-NC组细胞中的CDC20蛋白表达量为0.53±0.00，而在sgRNA-CDC20组胞中的CDC20表达量为0，差异有统计学意义（P<0.05），CDC20基因敲除成功（图4C、D）。

2.5 CDC20 基因敲除对C33A细胞增殖能力、细胞周期和凋亡的影响

平板克隆结果显示，与sgRNA-NC组相比，sgRNA-CDC20组的C33A细胞克隆形成能力明显减弱（P<0.001，图5A、B）。

流式细胞检测结果显示，相对于sgRNA-NC组，sgRNA-CDC20敲除组的C33A细胞增加了在S期的细胞比例，S期比例从35.38%增加至39.50%（P<0.01，图5C、D）。sgRNA-CDC20敲除组中的C33A细胞凋亡率明显高于sgRNA-NC组（P<0.001，图5E、F）。

2.6 CDC20敲除对 C33A细胞迁移和侵袭的影响

细胞迁移结果：与sgRNA-NC组相比，sgRNA-CDC20敲除组的C33A细胞Transwell小室迁移穿膜细胞数目低于sgRNA-NC组（P<0.05，图6A、C）。

细胞侵袭实验结果：与sgRNA-NC组相比，CDC20在C33A细胞中的表达下调导致细胞侵袭能力下降，穿过小室的细胞数量明显少于sgRNA-NC组（P<0.05，图6B、D）。

2.7 敲除CDC20表达显著抑制宫颈癌细胞在裸鼠体内生长能力的影响

与sgRNA-NC组相比，sgRNA-CDC20组裸鼠瘤体的生长速度明显减缓（几乎为零）（P<0.001，图7A、C）。在皮下注射25 d后，与sgRNA-NC组相比，sgRNA-CDC20敲除组裸鼠体质量无明显变化（P>0.05，图7B）。处死裸鼠后摘除瘤体，用卡尺测定肿瘤体积和石蜡切片及HE染色（图7A、C），C33A-sgRNA-NC组成瘤率为90%；C33A-sgRNA-CDC20敲除组成瘤率仅30%，该组裸鼠体质量与C33A-sgRNA-NC组体质量稍有降低，但差异无统计学意义（P>0.05，图7D）。活体成像结果显示，该细胞成瘤后荧光成像效果不佳（图7E）。

2.8 CDC20的缺失抑制Wnt/β-Catenin信号通路

利用CDC20敲除慢病毒感染C33A细胞后，Western blotting结果显示β-Catenin 蛋白表达下降（P<0.05，图8A、B）。通过裸鼠瘤体组织中的Western blotting结果发现，与sgRNA-NC组相比，sgRNA-CDC20组中β-Catenin和CDC20（P<0.05）蛋白表达水平均明显降低，差异具有统计学意义（图8C、D ）；体外细胞水平和体内动物水平的结果均一致。通过免疫共沉淀实验验证内源性CDC20与内源性β-Catenin能结合（图8E）；利用免疫荧光检测CDC20（CY5标签）与β-Catenin（CY3标签）的空间共定位，结果显示CDC20沉默导致荧光降低和β-Catenin蛋白在细胞核中的分布减少（图8F）。

3 讨论

近年来，宫颈癌的发病率和死亡率趋于年轻化增长，尤其是中晚期的宫颈癌患者，其5年的生存率仍很低且预后较差^［21］。因此，为进一步研究宫颈癌的发生和发展机制，寻找其有效的治疗靶点为其预防和诊断提供相关依据。既往研究表明CDC20高表达可导致基因组不稳定性增加，并与多种癌症的不良病理特征和预后不良密切相关^［22］。通过TCGA分析发现CDC20的高表达与各种肿瘤细胞的增殖、病理分期、侵袭转移、患者的预后不良、免疫细胞浸润以及耐药等密切相关^［23］。有研究发现，与癌症患者标本中正常上皮细胞和邻近正常组织相比，CDC20在乳腺癌、食管癌和前列腺癌细胞中呈过表达^［24-26］。本研究结合临床样本，利用免疫组化分析了CDC20和β-Catenin的阳性表达水平高于癌旁组织，宫颈癌患者年龄好发于40~60岁，宫颈鳞癌多于腺癌，并与其高分化和临床分期以及淋巴结转移密切相关。TCGA分析同时验证了CDC20在宫颈癌组织中呈高表达，宫颈癌患者总生存率更短。以上结果均表明CDC20可以作为宫颈癌病情评估和生存预测的分子标志物。

为了阐明CDC20在宫颈癌中可能的作用机制，通过CRISPR/Cas9双靶点sgRNA2＆7敲除CDC20基因，利用慢病毒转染并成功构建了宫颈癌sgRNA-CDC20-C33A细胞稳株。经慢病毒分别感染sgRNA-NC和sgRNA-CDC20-组均有绿色荧光表达，qRT-PCR和Western blotting 结果均进一步证实CC3A细胞中的CDC20基因敲除成功。通过CRISPR/Cas9双靶点敲除CDC20基因，可以观察到C33A细胞在体内外功能上的显著变化。CDC20基因敲除对宫颈癌C33A细胞的生长和凋亡有显著影响，其形成的细胞克隆在大小和数量上均明显低于sgRNA-NC组，而sgRNA-CDC20敲除组中的C33A细胞凋亡率明显高于sgRNA-NC组。这表明CDC20基因的缺失能够显著促进C33A细胞的凋亡。CDC20的下调被发现能够通过抑制自噬和p53诱导的凋亡来促进肿瘤发生，这进一步说明了CDC20在细胞生存和凋亡调控中的重要作用^［27］。然而，导致中晚期宫颈癌患者的生存率低和死亡率高的最主要原因归因于肿瘤的侵袭和转移。Shang等^［28］通过下调 CDC20 能够使骨肉瘤细胞中的细胞迁移和侵袭受到抑制； Cheng 等^［29］研究发现敲低CDC20基因能够抑制具有化疗耐药性的胰腺癌PANC-1细胞的迁移能力；在骨肉瘤细胞中，CDC20抑制剂apcin被证明能够抑制细胞生长并诱导显著的细胞凋亡，同时显著抑制细胞的侵袭和迁移能力^［30］。而本研究发现，敲除CDC20基因后，Transwell小室迁移和侵袭穿过膜的细胞数量显著减少，表明宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力受到明显抑制。此外，通过体内实验，将敲除CDC20基因的宫颈癌细胞接种到裸鼠体内，观察裸鼠成瘤和肿瘤的转移情况。结果显示sgRNA-CDC20敲除组的裸鼠皮下移植瘤的生长速度及瘤体体积曲线均明显小于sgRNA-NC组，表明敲除CDC20可明显抑制宫颈癌C33A细胞在裸鼠皮下瘤体的生长能力。以上结果充分证明CDC20在体内、外均可促进宫颈癌肿瘤细胞的生长。

在宫颈癌的发生发展过程中，异常激活的 Wnt/β-Catenin 信号通路可能作用于CDC20的启动子区域，上调CDC20的转录水平；β-Catenin是Wnt信号通路的关键分子，其异常表达与多种癌症的进展密切相关^［31］。β-Catenin在正常细胞中通过与钙粘蛋白的结合，参与细胞间的相互粘附作用。这种粘附作用对于维持组织的结构完整性和细胞间的信号传递至关重要。然而，在肿瘤细胞中，β-Catenin的功能发生了显著变化。β-Catenin可以在细胞核内积累，并与T细胞因子（TCF）/淋巴增强因子（LEF）结合，形成转录激活复合物，从而激活一系列与细胞增殖和生存相关的靶基因。这种转录激活作用可以导致细胞间黏附的降低，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭能力^［32］。在人类皮肤鳞状细胞癌中，CDC20的下调可以通过抑制Wnt/β-Catenin信号通路来抑制细胞增殖、诱导细胞周期停滞和促进细胞凋亡^［10］。在前列腺癌中，CDC20通过促进β-Catenin的核转位和转录激活来维持CD44⁺前列腺CSC的自我更新能力^［9］。本研究结果表明，敲除CDC20能够导致C33A细胞中和瘤体组织中β-Catenin表达明显降低，从而抑制宫颈癌C33A细胞的迁移和侵袭。通过免疫共沉淀和免疫荧光验证均证实CDC20与β-Catenin间的相互作用，CDC20敲除可导致β-Catenin表达水平显著降低，并抑制β-Catenin的核转位。这一现象在多种癌症中得到了验证。在胃癌细胞中，CDC20与MYBL2协同作用促进细胞增殖并抑制细胞凋亡，而这种效应可能涉及Wnt/β-Catenin信号通路^［33］。在前列腺癌中，CDC20的沉默不仅抑制了细胞增殖，还增强了化疗药物多西他赛的抗癌效果，这同样与Wnt/β-Catenin信号通路的抑制有关^［34］。由上可以推测CDC20与Wnt/β-Catenin信号通路的这种相互作用共同促进了宫颈癌变的进展。

综上，本研究通过体内外实验均证实CDC20的敲除通过诱导S期阻滞来抑制宫颈癌C33A细胞的增殖和迁移，其机制是CDC20可能通过调控Wnt/β-Catenin信号通路影响宫颈癌细胞的增殖和迁移，从而促进肿瘤的进展。这种机制的揭示不仅为宫颈癌的治疗提供了新的治疗靶点，也为其预后评估提供了潜在的生物标志物。因此，深入研究CDC20与Wnt/β-Catenin信号通路的相互作用机制，不仅有助于揭示宫颈癌的发病机制，还可能为开展新的治疗策略提供理论基础。

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