敲除CDC20可明显抑制宫颈癌细胞的增殖及侵袭转移

摘要

目的 探讨细胞分裂周期蛋白20(CDC20)在宫颈癌中的功能及其对宫颈癌C33A细胞增殖、迁移以及侵袭的影响和作用机制。方法 TCGA数据库分析CDC20在宫颈癌组织中的表达情况，免疫组化（IHC）检测宫颈癌组织与癌旁组织中的CDC20和β-Catenin蛋白表达水平。利用CRISPR/Cas9设计CDC20基因双靶点的sgRNA2&7序列，构建重组质粒并测序验证。将宫颈癌细胞C33A按转染的质粒不同分为sgRNA-NC组和sgRNA-CDC20组，通过qRT-PCR和Western blotting检测CDC20的mRNA和蛋白表达水平，平板克隆检测其增殖能力，流式细胞术检测细胞周期和凋亡水平；Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力。将2组C33A细胞分别接种于裸鼠（5只/组）双侧腋下左、右两侧，定期监测肿瘤体积并绘制其生长曲线，称取裸鼠体质量并脱臼处死。Western blotting分别检测细胞和瘤体组织中的CDC20和β-Catenin蛋白的表达水平；免疫共沉淀（CoIP）和免疫荧光共定位验证CDC20与β-Catenin的相互作用。结果 CDC20和β-Catenin在宫颈癌组织中的表达高于癌旁组织（P<0.001）。体外细胞实验结果显示：与sgRNA-NC组细胞比较，sgRNA-CDC20敲除株的细胞增殖能力下降（P<0.001）且细胞凋亡显著升高（P<0.01）；迁移和侵袭能力受到明显抑制（P<0.05）。体内动物实验结果显示：与sgRNA-NC组比较，sgRNACDC20组的瘤体体积生长曲线明显减小（P<0.05），但裸鼠体质量无明显变化（P>0.05）;sgRNA-CDC20组中的细胞和组织中的CDC20和β-Catenin的蛋白水平明显降低（P<0.05），免疫共沉淀（CoIP）和免疫荧光验证CDC20和β-Catenin存在相关性。结论CDC20在宫颈癌组织、细胞以及瘤体中的表达明显升高，敲除CDC20可明显抑制C33A细胞的增殖和侵袭转移能力，并促进凋亡，其机制可能与Wnt/β-Catenin信号通路密切相关。

关键词

CRISPR/Cas9 / CDC20 / 宫颈癌 / Wnt/β-Catenin