靶向E-选择素的工程化脂质体的设计与炎症靶向评价

Design and inflammation-targeting efficiency assessment of an engineered liposome-based nanomedicine delivery system targeting E-selectin

摘要

目的 设计合成一种纳米药物递送系统，靶向E-选择素，可竞争性地抑制E-选择素与中性粒细胞表面的配体结合，阻断中性粒细胞在血管的黏附，进而抑制中性粒细胞向病变部位的募集和浸润。 方法 采用后插入法开发了基于E-选择素的亲和短肽IELLQARC标记的盐酸多柔比星（DOX）脂质体（IEL-Lip/DOX）。分别制备2-1P配方组［Mol（PC）：Mol（DPI）=100∶1］和2-3P配方组［Mol（PC）：Mol（DPI）=100∶3］，对其修饰密度、体外释放特性进行测定。并且通过脂多糖（LPS）诱导建立体外细胞炎症模型、小鼠急性肺损伤（ALI）模型、大鼠股动脉物理损伤炎症模型、斑马鱼局部炎症模型，尾静脉或躯干定点分别注射不同配方的PEG化DOX脂质体（P、2-1P、2-3P）测定其炎症靶向能力。 结果 不同配方（2-1P、2-3P）IEL-Lip/DOX的表面短肽修饰密度分别为4.76、7.57 pmoL/cm²。与未修饰脂质体相比，IEL-Lip/DOX在pH 5.5条件下的48 h累积释放速率均降低（P<0.05）；在体外细胞炎症模型中，活化炎症内皮细胞对IEL-Lip/DOX的摄取量增加（P<0.0001），且2-1P配方穿过内皮屏障的能力高于2-3P配方（P<0.01）；在小鼠ALI模型中，IEL-Lip/Cy5.5在肺组织中的荧光强度增加（P<0.05），Z-（2-1P）和Z-（2-3P）配方分别提高了53.71%和93.41%，且2-1P配方在肺中的分布相比于正常小鼠增加（P<0.05），提升幅度为24.19%；在大鼠股动脉物理损伤炎症模型中，2-1P配方的损伤侧/健康侧血管荧光强度值升高（P<0.05）；在斑马鱼局部炎症模型中，各配方在炎症部位的聚集程度均增加（P<0.001）。 结论 提出了一种靶向E-选择素的纳米药物递送系统，高效靶向活化炎症内皮细胞，增加药物在炎症部位的蓄积，为中性粒细胞不适当激活引起的炎症性疾病提供了一种新的治疗策略。

Abstract

Objective To develop an E-selectin-targeting nanomedicine delivery system that competitively inhibits E-selectin-neutrophil ligand binding to block neutrophil adhesion to vessels and suppress their recruitment to the lesion sites. Methods Doxorubicin hydrochloride (DOX)-loaded liposomes (IEL-Lip/DOX) conjugated with E-selectin-affinity peptide IELLQARC were developed using a post-insertion method. Two formulations [2-1P: Mol(PC): Mol(DPI)=100:1; 2-3P: 100:3] were prepared and their modification density and in vitro release characteristics were determined. Their targeting efficacy was assessed in a cell model of LPS-induced inflammation, a mouse model of acute lung injury (ALI), a rat femoral artery model of physical injury-induced inflammation, and a zebrafish model of local inflammation. Results The prepared IEL-Lip/DOX 2-1P and 2-3P had peptide modification densities of 4.76 and 7.57 pmoL/cm², respectively. Compared with unmodified liposomes, IEL-Lip/DOX exhibited significantly reduced 48-h cumulative release rates at pH 5.5. In the inflammation cell model, IEL-Lip/DOX showed increased uptake by activated inflammatory endothelial cells, and 2-1P exhibited a higher trans-endothelial ability. In ALI mice, the fluorescence intensity of IEL-Lip/Cy5.5 increased significantly in lung tissues by 53.71% [Z-(2-1P)] and 93.41% [Z-(2-3P)], and 2-1P had an increased distribution by 24.19% in the inflammatory lung tissue compared to normal mouse lung tissue. In rat femoral artery models, 2-1P had greater injured/normal vessel fluorescence intensity contrast. In the zebrafish models, both 2-1P and 2-3P showed increased aggregation at the site of inflammation. Conclusion This E-selectin-targeting nanomedicine delivery system efficiently targets activated inflammatory endothelial cells to increase drug concentration at the inflammatory site, which sheds light on new strategies for treating neutrophil-mediated inflammatory diseases and practicing the concept of "one drug for multiple diseases".

Graphical abstract

关键词

E-选择素 / IEL短肽 / 盐酸多柔比星脂质体 / 靶向递送

Key words

E-selectin / IEL short peptides / doxorubicin hydrochloride-loaded liposomes / targeted delivery

炎症是机体对感染或组织损伤的一种防御性反应，旨在清除外界刺激和维持体内平衡^［1］。然而，炎症反应的过度激活或失控与多种疾病的发生和发展密切相关，包括癌症、心血管疾病和自身免疫性疾病等^［2-4］。因此，开发能够精准调控炎症反应的靶向治疗策略具有重要的临床意义。中性粒细胞作为炎症反应的核心效应细胞，在炎症部位的募集和活化是炎症进展的关键环节。中性粒细胞与血管内皮细胞黏附，穿越内皮屏障并迁移至炎症部位^{［5， 6］}，这一过程的重要分子基础是中性粒细胞和血管内皮细胞表面的黏附分子间相互作用。E-选择素属于细胞黏附分子，在炎症等因子刺激的内皮细胞中过表达^［7］；并可特异性地与中性粒细胞表面或肿瘤细胞表面的E-选择素天然配体相结合，介导中性粒细胞或肿瘤细胞在血管内皮发生黏附，继而随着血液发生转移^［8］。基于此，选择E-选择素作为靶标，其配体^［9-12］则可以发挥靶向炎症或靶向肿瘤的作用，在阻断炎症进展或肿瘤转移中具有较大应用价值。目前唾液酸化路易斯X被广泛认为是E-选择素的天然配体，但该配体为寡聚四糖结构，存在合成复杂、与E-选择素的结合能力较弱等问题^{［13， 14］}。因此，设计开发新型的高效E-选择素配体十分必要。

除寡糖类物质外，研究还发现多肽类分子也可作为E-选择素的特异性结合配体。已有研究表明，七肽IELLQAR^［15］和十二肽DITWDQLWDLMK^［16］能够与E-选择素高效结合。与糖类配体相比，这些多肽分子具有合成工艺简单、成本较低、结合能力更强等优势。本文以结构相对简单的E-选择素肽配体IELLQAR为模板，设计开发了靶向短肽IELLQARC（IEL），合成了基于E-选择素的亲和短肽标记的DOX脂质体，通过构建体内外多种炎症模型系统评估了IEL-Lip/DOX的炎症靶向能力。IEL短肽能够特异性地与活化炎症内皮细胞表面的E-选择素结合，IEL-Lip/DOX比未修饰的脂质体能更优先靶向活化炎症内皮细胞，实现细胞内递送药物，提高药物在炎症部位的富集，在治疗炎症相关疾病方面具有巨大潜力，为中性粒细胞相关疾病提供了一种新的治疗策略和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

IELLQARC短肽（强耀生物合成，序列：ILe-GLu-Leu-Leu-GLn-ALa-Arg-Cys，纯度98.34%，相对分子质量：945.15，溶解度：1 mg/mL in 17% ACN/83% H₂O）；DSPE-PEG1K-MAL（委托方提供，西安瑞禧生物科技有限公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液（1 mol/L， pH 7.2）（LEAGENE）；磷酸二氢钾（GENERAL-REAGENT）；DMSO（Phygene）；乙酸、三氟乙酸（国药集团化学试剂有限公司）；卡巴他赛（江苏永安制药有限公司）；乙腈、甲醇（TEDIA）；乙酸铵（西陇化工）；重组Anti-CD31抗体（上海艾博抗）；Hoechst 33342细胞核探针、脂多糖（055：B5）、DIO［DIOC18（3）］细胞膜绿色荧光探针（MKbio）；Murine TNF-alpha（Peprotech）；12孔板Transwell嵌套（带聚碳酸脂膜12 mm，0.4 μm）（Corning）；35 mm细胞培养皿（Sorfa）；6孔板细胞爬片（24 mm）（WHB）；DMEM高糖（Hyclone）；RPMI 1640培养基（Gibco）；PBS缓冲液、胎牛血清（TBD）；SELE /CD62E Antibody-N-terminal（Affbiotech）；CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L） （Proteintech）；Cy5.5-NHS（西安瑞禧生物）；蛋黄卵磷脂、胆固醇、DSPE-mPEG2000［艾伟拓（上海）医药科技有限公司］；Triton X-100、山羊血清（Beyotime）。

1.2 实验动物

雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（250±20） g、无特异性病原体雄性ICR小鼠（20±2 g）由浙江省医学科学院动物实验中心（中国杭州）提供，在无特异性病原体条件下饲养。所有动物均按照“实验动物护理和使用指南”中列出的指南接受护理。将它们保持在12 h光照/黑暗循环的无菌条件室中，自由进入饮食和饮水，动物饲养在22±2 ℃的温度下。动物实验方案经浙江省医学科学院动物实验中心伦理委员会审核批准（伦理批号：ZJAMS20180409），并遵守国家实验动物关爱和使用指南。

斑马鱼均饲养于28 ℃的养鱼用水中（水质：按照200 mg/L的浓度要求，在反渗透水中加入速溶海盐，电导率为450~550 μS/cm；pH为6.5~8.5；硬度为50~100 mg/L CaCO₃），由杭州环特生物科技股份有限公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2012-0171，饲养管理符合国际AAALAC认证（认证编号：001458）的要求。转基因中性粒细胞绿色荧光MPX品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行，年龄为受精后3 d。

1.3 方法

1.3.1 空白脂质体的制备

分别称取蛋黄卵磷脂172.5 mg，胆固醇52.5 mg溶于30 mL乙醇中，同时配制180 mL 0.25 mol/L的硫酸铵溶液，置于60 ℃水浴锅中加热至恒温；随后将溶有磷脂的乙醇溶液通过蠕动泵快速注入至硫酸铵水溶液中，转速900~1200 r/min。将制备好的脂质体用去离子水通过中空纤维超滤膜包透析，保持温度在10 ℃以下，重复8次，随后将脂质体浓缩至10 mL，得到纯化的空白脂质体。

1.3.2 DOX载药

取8.5 mL空白脂质体，加入1.0 g蔗糖溶液和0.0193 g组氨酸，置于60 ℃水浴锅中孵育；将20 mg DOX溶解在1 mL水溶液中，分批次逐滴加入至空白脂质体中，每隔5 min取出，搅拌30 s，30 min后测定溶液pH值，并用NaOH（1 mol/L）调节脂质体的pH在6.5~7.0；最后加水补至10 mL即可。每10 mL脂质体含20 mg药。

1.3.3 DSPE-PEG-IEL偶联物的制备

准确称量短肽IEL 1.72 mg、DSPE-PEG1K-MAL 3.20 mg置于超声脱气的2 mLHEPES 缓冲液（50 mmol，pH 7.2）中，室温N₂保护低速搅拌反应12 h（DSPE-PEG1K-MAL与IEL摩尔比1∶1.1），得到DSPE-PEG-IEL偶联物（DPI）。上述步骤中IEL加入了20 μL DMSO助溶。

1.3.4 后插入法制备IEL-Lip/DOX

分别称取蛋黄卵磷脂172.5 mg，胆固醇52.5 mg，DSPE-PEG2000 46.76 mg，溶于30 mL乙醇中，同时配制180 mL 0.25 mol/L的硫酸铵溶液，置于60 ℃水浴锅中加热至恒温，其余步骤同1.3.1和1.3.2项，制得PEG化DOX脂质体。取1.3.3方案中制备的DPI 0.259 mL（M_DPI=0.221 μmol）加入到1 mL的PEG化DOX脂质体注射液中（M_PC= 21.379 μmol），在60 ℃水浴中孵育1 h［按照总磷脂Mol（PC）∶Mol（DPI）=100∶1］，或取0.776 mL的DPI（M_DPI= 0.663 μmol）加入到1 mL的PEG化DOX脂质体注射液中（M_PC=21.379 μmol），在60 ℃水浴中孵育1 h ［按照总磷脂Mol（PC）∶ Mol（DPI）=100∶3］，随后温度降至室温即可得到IEL-Lip/DOX。以此类推，可得Mol（PC）： Mol（DPI）为100∶0.5（2-0.5P）、100∶5（2-5P）的IEL-Lip/DOX。使用Zeta Sizer Nano-ZS90激光粒度仪测定粒径和Zeta电位。

1.3.5 脂质体表面短肽修饰密度的测定

采用HPLC定量分析短肽修饰后脂质体上DPI和总磷脂的摩尔比，计算脂质体分子单位表面积上分布的DPI。依照1.3.4中制得2-1P［Mol（PC）∶Mol（DPI）=100∶1］和2-3P［Mol（PC）∶Mol（DPI）=100∶3］配方的IEL-Lip/DOX，其反应液利用G25凝胶柱纯化以除去游离的DPI。为了提高纯化效果避免游离DPI对定量分析的影响，过柱纯化后采集前期流出的组分。纯化前和纯化后的产物加入等体积甲醇破乳，利用HPLC分别检测样品中DPI和DOX的量，总磷脂的量通过DOX和PC的药脂比推算，以此计算脂质体上DPI/PC的摩尔比。

表面短肽修饰密度=DPI摩尔数/脂质体表面积

1.3.6 IEL-Lip/DOX的体外释放

将不同配方（P、2-1P、2-3P）的脂质体加入透析袋中（MWCO=14000 D），置于装有不同pH值的PBS的烧杯中，锡箔纸避光封装后置于摇床中（37 ℃，100 r/min）2 d，在设定的不同时间点取出1 mL烧杯内磷酸缓冲液并补充1 mL新鲜的磷酸缓冲液。HPLC检测不同时间点取出样品的药物含量。

1.3.7 载Cy5.5荧光标记脂质体的制备

精确称取33.82 mg蛋黄卵磷脂，10.3 mg胆固醇，9.168 mg DSPE-mPEG2000，0.2 mg Cy5.5-NHS溶于2 mL无水乙醇中，随后在避光条件下注入10 mL水相中，静置5 min转移至茄形瓶内，60 ℃旋转蒸发除去有机溶剂至体系为2 mL后即可得到未修饰载Cy5.5荧光标记脂质体（Z-Cy5.5）。在水相中分别加入0.6146 mg，1.8438 mg上述1.3.3合成的DPI偶联物，其它步骤同Z-Cy5.5脂质体制备方法，得到 Z-（2-1P），Z-（2-3P）配方的IEL短肽修饰的载Cy5.5荧光标记脂质体（IEL-Lip/Cy5.5）。

1.3.8 体外细胞炎症模型的建立

HUVEC、bEnd.3细胞系在细胞培养瓶中生长至90%左右，胰酶消化，取2 mL细胞悬液铺于细胞爬片的6孔板上，细胞数量约为1×10⁵/孔，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养过夜。每孔加入适量LPS溶液（0.1 μg/mL）诱导4 h，活化细胞E-选择素的表达通过免疫荧光染色进行检测。

1.3.9 IEL-Lip/DOX在体外细胞炎症模型上的靶向评价

将LPS（0.1 μg/mL）诱导后的HUVEC、bEnd.3爬片细胞在设定的时间点弃去培养基，PBS清洗3次，分别加入1.8 mL新培养基和200 μL不同配方（P、2-1P、2-3P）的脂质体（DOX浓度为1 mg/mL）继续培养2 h，对照组不做处理。弃去培养基，PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS清洗3次；加入1 mL 0.2% Triton X-100通透10 min，PBS清洗3次；加入500 μL山羊血清37 ℃下封闭20 min，PBS清洗3次；加入300 μL PBS和E-选择素抗体（稀释比例为1∶100），于4 ℃条件下过夜，PBS清洗3次；加入300 μL PBS和荧光标记的二抗CoraLite488-山羊抗兔IgG （H+L）（稀释比例为1∶300），室温避光孵育2 h，PBS清洗3次；加入300 μL Hoechst 33342染色5 min，PBS清洗3次，倒置荧光显微镜下观察拍照。或者用胰酶消化细胞，PBS清洗3次，上流式细胞仪分析，计数1×10⁴个细胞。

1.3.10 IEL-Lip/DOX在体外穿透内皮和上皮屏障能力的评价

取生长状态良好的bEnd.3细胞接种于24孔板的Transwell小室内，密度约为5×10⁴/孔，向小室的顶侧及基底侧加入混有10%胎牛血清的新鲜培养基（上室100 μL，下室600 μL），培养7 d。通过DIO［DIOC18（3）］细胞膜绿色荧光探针标记细胞膜，荧光显微镜观察细胞的融合情况，当细胞连接处没有缝隙时弃去Transwell小室中上下室的培养液，于上室/下室加入100 μL/600 μL的含TNF-α（50 ng/mL）培养液，刺激4 h。诱导结束后弃去上下室培养液，PBS清洗3次，在下室加入600 μL新鲜培养液，上室中分别加入不同配方（P、2-1P、2-3P）的脂质体，DOX浓度为50 μg/mL；继续培养1 h，从下室收集200 μL培养液，加入乙腈萃取DOX，HPLC测定其含量。

1.3.11 小鼠ALI模型的建立

ICR小鼠腹腔注射舒泰50（80 mg/kg）进行麻醉，随后用微量注射器吸取LPS溶液（1 mg/mL）分次滴于小鼠鼻尖处，待液滴被吸入后继续滴液于鼻尖处直至50 μL体积被完全吸入，轻微来回摇晃小鼠30 s后放于笼中让其自然苏醒。吸入LPS后的模型组在设定的时间点分别实施安乐死，取出肺组织并用生理盐水洗去血液，4%多聚甲醛固定48 h以上，对照组的肺组织样品在任意时间点做同样处理。采用常规石蜡包埋后进行免疫组化分析以验证模型的成功建立。

1.3.12 IEL-Lip/DOX在小鼠ALI模型中的靶向评价

实验组ALI小鼠分别尾静脉注射不同配方（P、2-1P、2-3P）的脂质体（10 mg/kg）或者载Cy5.5荧光标记脂质体（1 mg/kg），对照组不做炎症诱导处理，其余操作均同实验组。给药1 h后，小鼠脱臼处死，取心、肝、脾、肺和肾在活体成像仪上观察荧光，并且准确称量心、肝、脾、肺和肾组织质量，分别加入4×、2×、5×、4×、2×体积/质量的提取缓冲液（10 mmol/L KH₂PO₄+0.5% HAc），匀浆后待用。取200 μL组织匀浆液，加入100 μL内标卡巴他赛（0.4 mg/mL）溶液、600 μL提取缓冲液和700 μL乙腈，涡旋混合均匀，离心（13 000 r/min，10 min）。取上清转移至1.5 mL尖底离心管中，4 ℃过夜后离心（13 000 r/min，10 min），取上层清液HPLC进样分析组织中DOX含量。

1.3.13 大鼠股动脉物理损伤炎症模型的建立

SD大鼠腹腔注射舒泰50（40 mg/kg）进行麻醉后，在外科手术显微镜的观察下沿着大鼠腹股沟纵向切开使其股动脉暴露，并用手术缝合丝线在血管的近心端和远心端系上结扣。随后在截断血流段血管的远心端处以G30针头（0.3 mm）扎入动脉血管内，进入约8 mm深度后反复旋转并适当挑起扩充血管壁约1 min，静置针头1 min后拔除；以棉签轻压创口处并依次松开远近心端结扣，恢复血流。

1.3.14 IEL-Lip/DOX在大鼠股动脉物理损伤炎症模型上的靶向评价

SD大鼠造模30 min后，尾静脉分别注射不同配方（P、2-1P、2-3P）的脂质体（10 mg/kg），30 min后截取动脉血管，截取长度为针头刺激段约1 cm长度，截取后浸泡于生理盐水中避光保存。利用活体成像仪观察血管内DOX荧光分布，划取血管区域面积并处理得到区域面积内单位面积荧光强度。

1.3.15 斑马鱼局部炎症模型的建立

选取受精后3 d的转基因中性粒细胞绿色荧光MPX品系斑马鱼于6孔板中，躯干定点注射LPS诱导建立斑马鱼细菌性血管炎症模型；通过观察中性粒细胞在LPS注射部位的聚集，评估血管炎症。

1.3.16 IEL-Lip/DOX在斑马鱼局部炎症模型上的靶向评价

随机选取30尾受精后3 d的中性粒细胞表达绿色荧光蛋白的MPX品系转基因斑马鱼，躯干定点注射LPS（40 mg/mL），注射体积均为5 nL/尾。LPS诱导30 min后分别注射不同配方（P、2-1P、2-3P、2-5P）的脂质体，浓度均为0.81 mg/mL，注射体积均为10 nL/尾。28 ℃处理1.5 h后，每个实验组随机选取4尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照，评价样品在细菌性血管炎症部位聚集情况。所有荧光强度数值的计算均采用imageJ软件分析处理得出，划取面积均统一在炎症区域。

1.3.17 统计学分析

采用SPSS 22.0软件以及GraphPad Prism 10.1.2统计软件对实验数据进行分析。计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IEL-Lip/DOX的制备及表征

2.1.1 IEL-Lip/DOX的粒径、电位及表面修饰密度

采用后插入法制备了两种配方的IEL-Lip/DOX，分别为Mol（PC）∶ Mol（DPI）=100∶1（2-1P）和100∶3（2-3P），两种配方的平均粒径均约为80 nm，多分散指数（PDI）分别为0.08和0.04，脂质体粒径分布均匀。IEL短肽的修饰使脂质体的Zeta电位从-1.66 mV降低至-25.30 mV（2-1P）和-23.87 mV（2-3P），证实了IEL短肽成功修饰到脂质体表面（表1）。通过定量分析，2-1P和2-3P配方中IEL短肽在脂质体表面的修饰密度分别为4.76 pmoL/cm²和7.57 pmoL/cm²（表2）。

2.1.2 IEL-Lip/DOX的体外药物释放特性

DOX在强酸性条件（pH 5.5）下释放最快，中性条件（pH 7.4）下次之，弱酸性条件（pH 6.5）下比较稳定，释放较慢。与未修饰脂质体（P）相比，IEL-Lip/DOX在pH 5.5条件下的48 h累积释放速率降低（P<0.05），尤其是2-3P配方（P<0.0001），而各组在pH 6.5，pH 7.4条件下差异没有统计学意义（P>0.05，图1）。

2.2 IEL-Lip/DOX在体外细胞炎症模型上的靶向评价

通过免疫荧光检测及显微镜观察发现，E-选择素在LPS刺激活化后的bEnd.3内皮细胞中表达（图2A），IEL-Lip/DOX在活化炎症内皮细胞中的药物摄取量高于未修饰脂质体（P）（图2B）。通过细胞流式分析荧光强度发现，活化炎症内皮细胞对IEL-Lip/DOX的摄取量均高于未修饰脂质体（P）（P<0.0001，图2C），且Mol（DPI）∶Mol（PC）大于1∶100（2-1P、2-3P、2-5P）后基本上达到最佳的摄取效果。HUVEC与bEnd.3两种细胞对药物的摄取规律是一致的，即活化炎症内皮细胞对IEL-Lip/DOX的摄取增加。Transwell实验结果显示，2-1P配方的IEL-Lip/DOX穿过内皮屏障的能力高于2-3P配方的脂质体（P<0.01，图2D）。

2.3 IEL-Lip/DOX的体内靶向评价

2.3.1 IEL-Lip/DOX在小鼠ALI模型上的靶向评价

通过免疫组化分析及其量化结果发现，在小鼠ALI模型中，LPS诱导后4 h时肺组织中E-选择素表达达到峰值（P<0.0001），并随着时间的推移逐渐减少（图3A、B）。

活体成像结果显示，IEL-Lip/DOX在ALI小鼠肺组织中的荧光强度与未修饰脂质体（P）相比差异无统计学意义（P>0.05），2-1P，2-3P配方的提升幅度依次为8.84%、6.51%，这可能与DOX自身的荧光强度较弱和药物进入脏器中的深浅等因素有关。相比之下，IEL-Lip/Cy5.5在ALI小鼠肺组织中的荧光强度均高于未修饰脂质体（Z-Cy5.5），Z-（2-1P）和Z-（2-3P）配方的提升幅度依次分别为53.71%、93.41%（P<0.05，图3C、D）。进一步分析DOX的体内分布，结果发现2-1P配方的IEL-Lip/DOX在ALI小鼠的肺中分布相比于正常小鼠增加（P<0.05），提升幅度为24.19%，而DOX血浆浓度差异无统计学意义（P>0.05，图3E、F）。

2.3.2 IEL-Lip/DOX在大鼠股动脉物理损伤炎症模型上的靶向评价

通过DOX荧光图（图4A）和荧光强度定量结果（图4B）分析发现，IEL-Lip/DOX的DOX荧光信号在损伤侧股动脉没有降低，且2-1P配方IEL-Lip/DOX的损伤侧/健康侧血管荧光强度值与未修饰脂质体（P）相比升高（P<0.05），而2-3P配方差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3.3 IEL-Lip/DOX在斑马鱼局部炎症模型上的靶向评价

利用荧光显微镜监测发现，IEL-Lip/DOX在斑马鱼炎症部位的聚集程度相比于未修饰脂质体（P）均增加（P<0.001），其中2-1P和2-5P配方优于2-3P配方（P<0.0001，图5A、B）。

3 讨论

中性粒细胞作为循环系统中含量最丰富的白细胞（占白细胞总数的50%~70%），是机体抵抗病原体入侵的第一道免疫防线^［17］。在炎症反应中，它们能够通过细胞因子介导的趋化作用，穿越血管屏障迁移至感染部位，并有效清除病原体^{［18， 19］}。另有研究发现，中性粒细胞异常的组织浸润和过度活化可能导致炎症/自身免疫性疾病和癌症进展^{［20， 21］}，这使其成为疾病治疗的潜在靶点。目前国内外的一些治疗策略已经开始进入临床试验阶段，例如在一项II期研究中发现CXCR₂阻断药物AZD5069（ClinicalTrials.gov Identifier： NCT01704495）减少了哮喘患者痰中中性粒细胞的数量^［22］；抗GM-CSF受体抗体Mavrilimumab（ClinicalTrials.gov Identifier： NCT01712399）已完成II期临床试验，该抗体通过抑制中性粒细胞的发育和/或功能来治疗类风湿关节炎^［23］。然而，尽管靶向中性粒细胞的策略在炎症治疗中显示出潜力，但广泛抑制中性粒细胞功能可能会损害宿主的免疫防御能力，增加感染风险^{［24， 25］}。因此，开发一种能够选择性调控中性粒细胞募集而不影响其免疫防御功能的新型治疗策略至关重要。

E-选择素作为一种细胞黏附分子，可与白细胞或肿瘤细胞表面的寡糖配体结合，促进内皮细胞与白细胞或肿瘤细胞之间的相互作用并参与炎症反应或肿瘤进展，最终导致氧化应激和细胞凋亡增加^［26-29］。基于此，E-选择素靶向可作为一种治疗方式，通过使用寡糖配体或多肽分子作为靶向剂，将脂质体和纳米颗粒等大分子递送到炎症和癌症组织^［30］。本研究以E-选择素为靶标，制备了一种能够靶向炎症内皮细胞的纳米药物递送系统，建立多种体内外炎症模型测定其炎症靶向能力，为治疗中性粒细胞不适当激活引起的炎症性疾病提供一种新的治疗策略和理论依据。

在ALI研究中，有研究^［31］通过琥珀酰亚胺碘乙酸将E-选择素结合肽的巯基与牛血清白蛋白表面的氨基偶联，制备了E-选择素结合肽修饰的牛血清白蛋白纳米颗粒，结果证实该纳米颗粒可被活化的HUVECs摄取，并在ALI小鼠模型的肺组织中富集。本研究通过LPS诱导炎症模型，利用免疫荧光检测和组化分析证实了活化炎症内皮细胞和ALI小鼠肺组织中E-选择素的表达，成功建立了炎症模型。在体外细胞炎症模型中，活化炎症内皮细胞对IEL-Lip/DOX的摄取量增加；在ALI小鼠模型中，IEL-Lip/Cy5.5在肺组织中的荧光强度增加，与上述研究结果一致。

在心血管疾病领域，多项研究表明冠心病患者血浆中可溶性E-选择素水平升高。例如，与新发病变相比，再狭窄冠状动脉中E-选择素mRNA的表达增加^［32］；外周动脉血管成形术后血管通畅性与低水平sE-选择素相关^［33］。有研究团队开发了一种新型抗大鼠E-选择素单克隆抗体，通过体内大鼠颈动脉球囊损伤模型和体外白细胞流动室实验证实，E-选择素通过白细胞粘附调节外膜炎症并有助于球囊损伤后内膜增生的过程^［34］。本研究通过建立大鼠股动脉物理损伤炎症模型，观察到IEL-Lip/DOX的损伤侧/健康侧血管荧光强度值升高，说明了IEL短肽可以靶向血管损伤部位，在治疗冠心病等相关疾病中具有巨大的应用潜力。

斑马鱼的免疫系统高度保守，具有与人类相似的中性粒细胞、单核巨噬细胞和淋巴细胞等免疫细胞类型^{［35， 36］}。斑马鱼对感染和组织损伤的天然免疫反应迅速，且易于诱导炎症反应，加之其胚胎期的透明特性和免疫细胞荧光标记的转基因品系的建立与发展，使其成为研究炎症和伤口修复的理想系统^［37］。本研究通过LPS诱导建立了斑马鱼局部炎症模型，并利用荧光显微成功观察到中性粒细胞的聚集。IEL-Lip/DOX在斑马鱼炎症部位的聚集程度均增加，其中2-1P和2-5P配方优于2-3P配方。

在肿瘤领域，治疗的难点之一在于提高肿瘤组织中积累的药物量。药物在肿瘤细胞中的最终积累量取决于其在肿瘤组织中的富集和内化过程。E-选择素在肿瘤细胞和炎症细胞上均高度表达，有研究表明^［38］，肿瘤周围炎性血管内皮细胞上E-选择素的过表达会增加肿瘤组织中胶束的积聚，而肿瘤细胞上E-选择素的过表达则促进了胶束的内化。本研究设计合成了与E-选择素结合能力更高的IEL短肽，进一步制备了相应的靶向肽脂质体。通过构建多种体内外模型均发现IEL短肽修饰后DOX药物在炎症组织的蓄积增加，脂质体对炎症组织的靶向能力提高，且不同修饰比例的脂质体表现出差异化的靶向性。同时多方面表现了其在治疗炎症相关疾病的潜力，也为未来拓展到其他癌症治疗提供了可能，为实现“一药多治”的目标奠定了基础。

综上所述，本研究证实了IEL短肽偶联脂质体靶向炎症组织的可行性，未来研究将进一步深入探讨IEL-Lip/DOX的药效学特性，探索其同时靶向炎症和肿瘤的可能性，以期实现一种药物同时治疗多种疾病的可行性，并为“一药治多病”提供新思路，未来也可期应用于其他抗炎症或抗癌纳米药物领域中。

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