精胺抑制巨噬细胞中GBP5介导的NLRP3炎性小体活化减轻感染肠道病毒71型的新生小鼠脏器损伤

Spermine suppresses GBP5-mediated NLRP3 inflammasome activation in macrophages to relieve vital organ injuries in neonatal mice with enterovirus 71 infection

摘要

目的 基于巨噬细胞中GBP5调控NLRP3炎症小体活化，探究精胺（Spm）治疗肠道病毒71型（EV71）感染引起的重症手足口病的机制。 方法 体内实验：将3~5 d龄的BALB/c乳鼠随机分为对照组（CON组）、感染组（EV71组）、治疗组（SPM组），感染组和治疗组每只腹腔注射浓度为1×10⁶半数组织培养感染剂量（TCID50）病毒液50 μL，治疗组在注射病毒3 d后注射100 μmol/L 精胺50 μL，对照组腹腔注射无菌PBS 50 μL。观察小鼠状态1周，提取小鼠心、肝、肺及肾组织全蛋白、RNA及组织切片，Western blotting、qPCR检测小鼠组织GBP5、NLRP3、CXCL10、TNFSF10表达水平，HE染色观察小鼠组织损伤及炎症细胞浸润状况，免疫组化法观察组织巨噬细胞浸润情况及GBP5的表达水平。体外实验：分别设置对照组（CON组）、感染组（EV71组）、治疗组（SPM组）、多胺生物合成抑制剂组。提取THP-1及RAW细胞RNA，通过RT-PCR检测细胞GBP5、NLRP3、CXCL10、TNFSF10表达水平。 结果 与对照组相比，小鼠在感染EV71后心、肝、肺及肾组织出现明显损伤，其中心、肺组织中明显观察到巨噬细胞的浸润。心、肝、肺及肾组织中GBP5、NLRP3、CXCL10、TNFSF10表达水平明显升高（P<0.05）；经精胺治疗后，与感染组相比治疗组小鼠组织损伤明显改善，心、肺组织中的巨噬细胞浸润减少。精胺治疗后小鼠心、肝、肺及肾组织中NLRP3、GBP5、CXCL10、TNFSF10表达水平降低（P<0.05）。在THP-1及RAW细胞中发现，感染EV71病毒后GBP5、NLRP3、CXCL10、TNFSF10表达升高（P<0.05），经精胺治疗后细胞中GBP5、NLRP3、CXCL10、TNFSF10表达降低（P<0.05）。在THP-1细胞中使用多胺生物合成抑制剂减少精胺合成可改善由GBP5 siRNA干扰引起的GBP5、NLRP3、CXCL10、TNFSF10表达降低（P<0.05）。 结论 精胺治疗可以降低EV71感染引起的巨噬细胞中GBP5介导的NLRP3炎症小体活化，减少炎症因子释放从而发挥治疗儿童重症手足口病的作用。

Abstract

Objective To observe the therapeutic effect of spermine in neonatal mouse models of severe hand, foot and mouth disease (HFMD) caused by enterovirus 71 (EV71) infection and explore its therapeutic mechanism in light of regulation of macrophage GBP5/NLRP3 inflammasome pathway. Methods Neonatal BALB/c mice (3-5 days old) were divided into control group, EV71 infection group and Spermine treatment group. The mice in the latter two groups received an intraperitoneal injection of 50 μL EV71 suspension (1×10⁶ TCID50 of EV71), followed 3 days later by intraperitoneal injection of 50 μL PBS or 100 μmol/L spermine. GBP5, NLRP3, CXCL10, and TNFSF10 expressions in heart, liver, lung and kidney tissues of the mice were detected using Western blotting and qPCR, and tissue pathologies and macrophage infiltration were assessed with HE staining and immunohistochemistry. In cultured THP-1 and RAW264.7 cells, the effects of EV71 infection, GBP5 siRNA transfection and treatment with spermine or eflornithine on GBP5, NLRP3, CXCL10, and TNFSF10 mRNA expressions were investigated using qPCR. Results In the neonatal mice, EV71 infection resulted in multiple organ damage, macrophage infiltration and activation of the GBP5/NLRP3 pathway, and spermine treatment significantly improved tissue injuries, reduced macrophage infiltration, and down-regulated the expressions of GBP5, NLRP3 and the inflammatory factors in the infected mice. In THP-1 and RAW264.7 cells, EV71 infection caused significant upregulation of GBP5, NLRP3, CXCL10, and TNFSF10 expressions, which were obviously lowered by spermine treatment. In THP-1 cells, treatment with eflornithine significantly suppressed the reduction of GBP5, NLRP3, CXCL10, and TNFSF10 expressions induced by GBP5 siRNA transfection. Conclusion Spermine suppressed EV71 infection-induced inflammatory responses by inhibiting GBP5-mediated NLRP3 inflammasome activation, suggesting a new strategy for treatment of severe HFMD.

Graphical abstract

关键词

重症手足口病 / 肠道病毒71型 / NLRP3 / GBP5 / 巨噬细胞 / 精胺

Key words

severe hand-foot-mouth disease / enterovirus 71 / NLRP3 / GBP5 / macrophages / spermine

手足口病（HFMD）是一种常见的危害儿童健康的传染性疾，而我国儿童手足口病中常见的病原是肠道病毒71型（EV71）^［1］。感染后症状主要表现为咳嗽、发热以及手、足、口腔、臀等部位皮肤出疹，少数重症患儿可出现中枢神经系统和心肺系统病变造成肺水肿、中毒性心肌炎、脑炎等症状危及性命^［2-4］。研究表明，这些危及生命的临床症状可能归因于组织中巨噬细胞的浸润以及炎症因子的释放^{［5， 6］}。有研究表明感染EV71可导致小鼠各组织器官出现炎症损伤，减轻组织炎症损伤可提高重症手足口病小鼠的存活率^［7］。

巨噬细胞活化是多种疾病发生发展过程中发生的重要的一个免疫过程^［8］。NLRP3炎性小体是目前研究最为广泛的炎症小体之一。在巨噬细胞中感染EV71可激活NLRP3炎症小体并产生大量的炎症因子^［9］。鸟苷酸结合蛋白5（GBP5）是GBP家族的一员，其表达是由炎症信号触发，由干扰素刺激诱导产生^［10］。研究发现，GBP5可以增强巨噬细胞中NLRP3炎性小体活性促进NLRP3炎症小体的组装^{［11， 12］}。

氨基酸是人体必需的营养物质，在维持免疫系统稳态方面发挥着关键作用，氨基酸代谢可以调节巨噬细胞中促炎细胞因子的分泌^{［13， 14］}。研究发现，小鼠感染EV71后，体内氨基酸水平发生了显著变化，其鸟氨酸代谢紊乱，导致多胺合成受阻。对小鼠注射精胺治疗，可显著逆转EV71感染引起的严重表型，降低其死亡率^［15］。在哺乳动物中，鸟氨酸是精氨酸/多胺代谢途径中的重要中间体。精氨酸经过精氨酸酶1 （ARG1）和精氨酸酶2（ARG2）的酶解产生鸟氨酸，而鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶1（ODC1）、亚精胺合成酶（SRM）和精胺合成酶（SMS）的作用下被依次转化为腐胺（PUT）、亚精胺（SPD）和精胺（SPM）^{［16， 17］}。

近年来，精胺在肿瘤增殖、组织损伤保护、病毒感染和抗炎症等方面的重要作用已经被广泛证实^{［18， 19］}。但目前精胺治疗重症手足口病的分子机制仍不明确。本研究将在动物及细胞水阐明精胺治疗EV71感染所致的重症手足口病的机制，为精胺治疗重症手足口病提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株和EV71病毒株

人单核细胞（THP-1）、小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）购于海星生物科技有限公司，EV71病毒株由东莞市第八人民医院儿科研究所惠赠。

1.1.2 实验动物

BALB/c孕鼠，购自南方医科大学实验动物管理中心，实验操作通过广东医科大学实验动物伦理委员会审核（伦理批号：GDY2302210）。

1.1.3 试剂

1640培养基、DMEM培养基（Gibco）、胎牛血清（ECB）、依氟鸟氨酸盐酸盐一水合物（MCE）、GBP5 siRNA（上海吉玛生物科技有限公司）、RNAiMAX（赛默飞世尔科技公司）、EZ-press RNA Purification Ki、color Reverse Transcription Kit、2xColor SYBR Green Qpcr Master Mix（EZB Bioscience）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、苏木素伊红（HE）染色试剂盒（上海碧云天）、重组Anti-GBP5抗体、重组Anti-F4/80抗体（Abcam）、小鼠/兔IgG-免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、qPCR引物由上海生工公司设计合成，引物序列见表1。

1.1.4 仪器

离心机（Eppendorf），荧光定量PCR仪（Roche），分光光度计（BioTek），电泳及转膜系统（Mini-Proteam），凝胶成像仪（BIO-RAD），荧光倒置显微镜（奥林巴斯），自动组织脱水机、石蜡包埋机、轮转式切片机（上海徕卡）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立

将3~5 d龄的BALB/c乳鼠随机分为空白对照组、EV71感染组和精胺治疗组，感染组以及治疗组每只腹腔注射浓度为1×10⁶半数组织培养感染剂量（TCID50）病毒液50 μL，治疗组在注射病毒3 d后注射100 μmol/L 精胺50 μL，空白组腹腔注射无菌PBS 50 μL。观察小鼠状态1周，待小鼠出现活动减少、精神萎靡震颤、 颈部僵硬、抽搐、后肢瘫痪等症状时对小鼠进行取材。

1.2.2 细胞培养

人单核细胞（THP-1）在含10%胎牛血清的1640培养基中培养（37 ℃、5%CO₂），每3 d加1次液，待细胞生长密度于80%~90%时以1∶2的比例传代。小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）在含10%胎牛血清的1640培养基中培养（37 ℃、5%CO₂），待细胞生长密度于 80%~90%时以1∶3的比例传代。

1.2.3 细胞分组与处理

细胞分为4组：对照组（CON组）、模型组（EV71组）、治疗组（SPM组）、多胺生物合成抑制剂组（Eflornithine组）。处理方法如下：CON组给予完全培养基培养；EV71组使用含有10³TCID50 的病毒液培养24 h，24 h后弃上清用PBS清洗并给予完全培养基继续培养24 h；SPM组使用含有103TCID50的病毒液培养24 h，24 h后弃上清用PBS清洗在含10 μmol/L精胺的完全培养基继续培养24 h；Eflornithine组在含3 mmol/L依氟鸟氨酸盐酸盐一水合物的完全培养基中培养24 h。

1.2.4 细胞转染

细胞分为NC组、S1组、S2组、S3组，siRNA序列见表，待培养皿中THP-1细胞密度达到80%后，将细胞以每孔70万的数量接种在六孔板中。经PMA处理24 h，待细胞贴壁后进行转染。每孔加入2.5 μg siRNA、8 μL RNAiMAX以及500 μL的Opti-MEM培养基随后用含10%胎牛血清的1640培养基补至2 mL，24 h后进行换液，48 h后进行后续检测。

1.2.5 qPCR实验

对处理后的细胞根据RNA提取试剂盒说明书提取RNA并逆转录为cDNA，随后进性qPCR检测。

1.2.6 Western blotting

将组织进行研磨，加入RIPA裂解液及PMSF在冰上裂解。用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，每孔蛋白质20 μg进行SDS-PAGE电泳，250 mA转膜90 min，5%脱脂牛奶常温封闭60 min，4 ℃一抗孵育过夜（稀释比例为GBP5 1∶1000，ACTIN 1∶5000），洗膜后二抗（稀释比例为1∶5000）常温孵育2 h，最后进行曝光。

1.2.7 病理组织切片与染色

对小鼠进行心、肝、肺、肾组织的取材，置于4%多聚甲醛固定3 d。再进行脱水、透明、石蜡包埋及切片，切片厚度为4 μm。切片再摊片机40 ℃温水上展平。将组织片捞起漂浮于载玻片上置于60 ℃烘箱内烤1.5 h。按照苏木素伊红（HE）染色试剂盒操作说明进行HE染色。

1.2.8 免疫组化

对石蜡切片进行脱蜡清洗，进行高温抗原修复。冷却后将玻片浸泡于PBS洗涤3次，放入3%过氧化氢溶液，避光孵育30 min，将玻片再次PBS洗涤3次。滴加3% BSA，均匀覆盖组织，室温封闭30 min。将玻片甩干，在组织切片上滴GBP5抗体（稀释比例为1∶300），4 ℃ 孵育过夜后PBS溶液洗涤3次。后滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG覆盖组织，室温孵育30 min，再次PBS洗涤3次。滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色。苏木素复染10 min，自来水冲洗10 min。脱水，使用中性树脂封片，最后用显微镜镜检。

1.2.9 统计学分析

采用 GraphPad Prism 8软件统计分析，多组间比较应用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 建立EV71感染的重症手足口病小鼠模型

通过对3~5 d龄小鼠腹腔注射EV71造模3 d，观察7 d。观察到小鼠在接种病毒后第3天出现活动减少、精神萎靡震颤、 颈部僵硬、抽搐、后肢瘫痪等症状（图1A）。部分感染EV71的小鼠出现了死亡。转录组测序结果显示，与对照组相比，GBP5位于升高的差异表达基因前50（图1B）。

2.2 感染EV71后小鼠组织出现损伤并伴巨噬细胞浸润

HE染色结果发现，与对照组相比EV71组小鼠肺泡破裂形成较大的肺泡，肺泡腔扩张充血，肺泡壁明显增厚，并伴随大量炎性细胞浸润及红细胞渗漏。心肌细胞出现坏死，心肌纤维排列间隙增大且紊乱，组织间隙可见炎症细胞浸润并伴有出血水肿的病理改变。肝组织视野内可见肝细胞脂肪变性及炎症细胞浸润。肾组织中观察到肾小球变小变少，肾间质可见少量炎症细胞浸润（图2A）。免疫组化结果显示，与对照组相比EV71组小鼠心、肺组织中出现了巨噬细胞浸润（P<0.05，图2B）。

2.3 感染EV71导致GBP5表达增加促进NLRP3炎症小体组装及相关炎症因子分泌

免疫组化结果显示，与对照组相比，EV71组小鼠心、肝、肺和肾组织切片经GBP5抗体染色后阳性面积明显增多（图3A）。提取小鼠组织蛋白质及RNA，经Western blotting技术及qPCR检测发现EV71组小鼠心、肝、肺以及肾的GBP5、NLRP3及CXCL10、TNFSF10表达升高（P<0.05，图3B、C）。同时，我们在THP-1及RAW细胞中添加EV71病毒，24 h后提取细胞RNA经逆转录和qPCR测定发现，与对照组相比，EV71组的GBP5、NLRP3及CXCL10、TNFSF10表达升高（P<0.05，图3D）。

2.4 建立精胺治疗EV71感染的重症手足口病的小鼠模型

接受精胺治疗的小鼠与未接受治疗的小鼠相比活动增加，精神萎靡震颤、颈部僵硬、抽搐、后肢瘫痪等症状有所改善（图4A）；且接受精胺治疗重症手足口病小鼠未出现死亡现象。

2.5 精胺治疗可以改善感染EV71所致的组织损伤，减少组织中巨噬细胞的浸润

HE染色结果显示，精胺治疗后重症手足口病小鼠的组织损伤有所改善。与EV71感染组相比治疗组小鼠肺组织未见水肿及出血等情况，小鼠心肌细胞排列整齐，肝脏未见脂肪变性且肝脏与肾脏炎细胞浸润减少（图4B）。使用巨噬细胞标志物F4/80抗体染色，免疫组化结果显示，小鼠心肺组织中巨噬细胞浸润减少（图4C）。

2.6 精胺治疗可感染降低GBP5表达，减少NLRP3炎症小体激活，减少相关炎症因子的分泌

免疫组化结果显示，与EV71组相比治疗组小鼠心、肝、肺和肾组织切片经GBP5抗体染色后阳性面积明显增少（图5A）。Western blotting技术及RT-PCR检测结果显示，SPM组心、肝、肺以及肾组织的GBP5、NLRP3及炎症因子CXCL10、TNFSF10与EV71相比表达降低（P<0.05，图5B）。THP-1及RAW细胞感染EV71病毒，24 h后提取细胞RNA经逆转录和qPCR测定发现，在接受精胺治疗后GBP5、NLRP3及炎症因子CXCL10、TNFSF10表达降低（P<0.05，图5C）。

2.7 精胺在巨噬细胞中通过调控GBP5表达，影响NLRP3炎症小体的激活及相关炎症因子的分泌

在THP-1细胞中使用GBP5 siRNA降低GBP5表达，NLRP3、炎症因子CXCL10、TNFSF10分泌减少（P<0.05，图6A）。在THP-1细胞中使用多胺生物合成抑制剂抑制精胺的合成，GBP5、NLRP3及炎症因子CXCL10、TNFSF10表达升高（P<0.05，图6B）。在THP-1细胞中使用GBP5 siRNA降低GBP5表达的基础上使用多胺生物合成抑制剂处理细胞24 h，发现与转染组相比添加了多胺生物合成抑制剂后GBP5、NLRP3及炎症因子CXCL10、TNFSF10表达升高（P<0.05，图6C）。

3 讨论

重症手足口病患儿病情发展迅速会出现肺水肿、中毒性心肌炎、脑炎等症状危及性命^［2-4］。但是研究发现在患者的心脏和肺组织当中未检测的病毒蛋白，这可能是由于EV71经血液或淋巴循环以肌肉作为中间载体将巨噬细胞向心、肺等组织扩散，引起组织炎症因子表达升高，最终导致心肺功能衰竭乃至死亡^［20］。研究发现^{［21， 22］}巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活引起的炎症反应会导致心肌细胞受损进而引起心肺功能衰竭。我们的实验结果显示小鼠在感染EV71后，其心肺组织中出现了明显的巨噬细胞浸润与上述研究结果一致。这提示感染EV71引起的心肺组织中巨噬细胞的浸润引发的心肺功能衰竭可能是导致重症手足口病患儿死亡的一个重要原因。

巨噬细胞是人体先天免疫的重要组成部分，巨噬细胞激活与分化被认为和疾病进展密切相关^{［8， 23］}。M1型巨噬细胞具有促炎作用并产生促炎细胞因子。当器官受到严重感染时，巨噬细胞就会表现出M1表型，当促炎因子过度分泌时就会导致组织损伤^{［24， 25］}。鸟苷酸结合蛋白5（GBP5）在M1型巨噬细胞中高表达，是M1型巨噬细胞的一个标志物^［26］。GBP5可以激活并促进 NLRP3炎症小体的组装，在先天免疫和炎症中发挥作用^{［6， 27］}。有研究表明感染EV71可引起巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活并产生大量的炎症因子^［9］。本研究发现感染EV71的重症手足口病小鼠组织及巨噬细胞中GBP5、NLRP3、CXCL10、TNFSF10表达升高。这提示感染EV71病毒会引起巨噬细胞中GBP5表达升高，而GBP5表达升高会促进NLRP3炎症小体的组装与激活，导致促炎因子CXCL10及TNFSF10表达升高，最终引起各组织器官的损伤。

氨基酸是免疫细胞在器官发育、组织稳态和免疫反应过程中的基本营养物质，在先天免疫和适应性免疫的调节中发挥着至关重要的作用^{［28， 29］}。研究发现感染EV71病毒会导致鸟氨酸代谢的破坏，精胺治疗可以显著改善EV71感染所致的严重表型^［15］。精胺在组织损伤保护和抗炎症等方面的重要作用被广泛证实^{［18， 19］}。可通过抑制TLRs/STAT1和NFkB信号通路激活或促进STAT6/PPARγ信号通路，抑制NLRP3炎症小体激活、抑制CXCL10等促炎细胞因子的合成^［30-32］。本研究建立了精胺治疗的重症手足口病小鼠模型。发现给予精胺后，小鼠组织中及THP-1、RAW巨噬细胞中。小鼠心肺组织中巨噬细胞的浸润情况有所改善，症状有所缓解，生存时间延长。在巨噬细胞中，发现抑制精胺合成GBP5表达升高，NLRP3炎症小体激活，炎症因子CXCL10及TNFSF10分泌增加，证实精胺确实调控GBP5。

综上所述，本研究发现在巨噬细胞中GBP5基因介导的NLRP3炎症小体活化在感染EV71病毒所致的手足口病发病过程中具有重要作用。精胺可以通过下调GBP5的表达，从而抑制NLRP3炎症小体的活化，减少促炎因子的释放，减少各个组织器官的炎症损伤，这为精胺治疗EV71感染所致的重症手足口病提供了参考依据。

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