ATF3通过NF-κB信号通路调控动脉粥样硬化斑块内的炎症反应

ATF3 regulates inflammatory response in atherosclerotic plaques in mice through the NF-κB signaling pathway

摘要

目的 探讨转录激活因子3（ATF3）在动脉粥样硬化斑块内的表达及其调控炎症反应参与动脉粥样硬化（AS）进程的机制。 方法 收集尸检案例中的人冠状动脉标本，免疫荧光和Western blotting检测ATF3蛋白表达及分布；高脂饮食12周后的载脂蛋白E基因敲除（ApoE^-/-）小鼠尾静脉注射9型腺相关病毒（AAV9）敲低ATF3的表达，继续高脂喂养5周构建ATF3基因敲除的动脉粥样硬化ApoE^-/-小鼠模型。麻醉处死后观察主动脉斑块结构改变，检测斑块内ATF3、炎症相关因子及NF-κB信号通路蛋白表达改变，并在体外构建ATF3的过表达质粒及siRNA干预THP-1诱导的泡沫细胞模型验证ATF3与NF-κB信号通路间关系。 结果 在人冠状动脉粥样硬化斑块内，ATF3的表达增高（P<0.05），且与CD68呈部分共表达；在ATF3基因敲除后，小鼠的主动脉斑块体积增大（P<0.05），斑块内炎症相关因子（CD45、CD68、IL-1β、TNF-α）表达增强（P<0.05），NF-κB信号通路相关蛋白（P-IKKα/β、P-NF-κB p65）表达增高（P<0.05），VCAM1、MMP9及MMP2表达增强（P<0.05）；在离体THP-1细胞实验中验证了沉默ATF3后NF-κB信号通路进一步激活，而过表达ATF3后NF-κB信号受到抑制。 结论 动脉粥样硬化诱导ATF3的表达，ATF3的缺乏会促进AS的发生，增强斑块内炎症反应，其机制可能是通过进一步激活NF-κB信号通路导致，ATF3可能是AS潜在的治疗靶点。

Abstract

Objective To investigate the role of activating transcription factor 3 (ATF3) in atherosclerotic plaques for regulating inflammatory responses during atherosclerosis (AS) progression. Methods Human coronary artery specimens from autopsy cases were examined for ATF3 protein expression and localization using immunofluorescence staining and Western blotting. Apolipoprotein E-deficient (ApoE^-/-) mouse models of AS induced by high-fat diet (HFD) feeding for 12 weeks were subjected to tail vein injection of adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) to knock down ATF3 expression. After an additional 5 weeks of HFD feeding, the mice were euthanized for analyzing structural changes of the aortic plaques, and the expression levels of ATF3, inflammatory factors (CD45, CD68, IL-1β, and TNF-α), and NF-κB pathway proteins (P-IKKα/β and P-NF-κB p65) were detected. In the cell experiment, THP-1-derived foam cells were transfected with an ATF3-overexpressing plasmid or an ATF3-specific siRNA to validate the relationship between ATF3 and NF‑κB signaling. Results In human atherosclerotic plaques, ATF3 expression was significantly elevated and partially co-localized with CD68. ATF3 knockout in ApoE^-/- mice significantly increased aortic plaque volume, upregulated the inflammatory factors, enhanced phosphorylation of the NF‑κB pathway proteins, and increased the expressions of VCAM1, MMP9, and MMP2 in the plaques. In THP-1-derived foam cells, ATF3 silencing caused activation of the NF‑κB pathway, while ATF3 overexpression suppressed the activity of the NF-κB pathway. Conclusion AS promotes ATF3 expression, and ATF3 deficiency exacerbates AS progression by enhancing plaque inflammation via activating the NF-κB pathway, suggesting the potential of ATF3 as a therapeutic target for AS.

Graphical abstract

关键词

动脉粥样硬化 / 转录激活因子3 / 炎症反应 / NF-κB / 冠心病猝死

Key words

atherosclerosis / activating transcription factor 3 / inflammatory response / nuclear factor-κB / sudden cardiac death

冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD） 是全球非传染性疾病死亡的头号杀手，所致全球死亡人数占全球总死亡人数的16%，且呈逐年增高的趋势^［1］。研究表明，炎症反应可严重破坏动脉生理结构及功能，促进动脉粥样硬化的发生，导致冠心病猝死等不良事件的发生^［2］，因此，对冠心病的病因及发病机制深入研究意义重大。

近年来，细胞信号转导和基因表达功能障碍被证明是心血管疾病发生的关键分子机制之一^［3-5］，而在众多的信号分子中，转录因子直接影响基因表达并在调节细胞功能和疾病发展中发挥关键作用^［6］。转录激活因子3（ATF3）属于ATF/cAMP反应元件结合（CREB）蛋白家族的重要转录因子之一^{［7， 8］}。相关研究表明，ATF3基因功能障碍与炎症、信息传递、凋亡、氧化应激和内质网等多种病理生理反应有关，并参与动脉粥样硬化发展过程中的细胞外基质功能障碍、平滑肌细胞增殖和迁移、泡沫细胞形成等多种病理生理变化^［9］。课题组前期研究也表明，ATF3的表达变化与动脉粥样硬化斑块稳定性相关^［10］，但ATF3在动脉粥样硬化中的作用仍存在争议，其作用机制尚不清晰。Kwon等^［11］的体外实验发现，在应激信号的刺激下，ATF3可能通过和NF-κB的p65亚基直接相互作用来抑制炎症反应的发生，而NF-κB信号通路在调节动脉粥样硬化中的炎症反应中起着关键作用，磷酸化激活的NF-κB促进许多炎症基因的表达，包括白细胞介素、凋亡抑制因子、黏附分子、趋化因子、基质金属蛋白酶等的表达，促进动脉粥样硬化的发生^{［12， 13］}。上述研究提示ATF3通过调控炎症反应可能是其机制之一。本课题拟收集贵州医科大学法医司法鉴定中心的人体冠状动脉组织直接检测ATF3表达水平，并通过建立ATF3沉默的ApoE^-/-小鼠及ATF3敲低和过表达的泡沫细胞模型，探讨ATF3在动脉粥样硬化中的作用及其与机制，拟为ATF3作为冠心病的诊断或治疗靶点提供更加有力的证据。

1 材料和方法

1.1 人体标本的选取

选取贵州医科大学法医司法鉴定中心2018~2022年尸检案例的冠脉组织标本40例，所选案例年龄30~50岁，分为冠心病组20例（CHD组）和对照组20例（Con组），CHD组肉眼及组织病理学证实冠状动脉粥样硬化存在，Con组为同期尸检证实冠脉无病变且非心源性疾病死亡者，尸体解剖在死后48 h内或冰冻保存72 h进行，并排除患有风湿性心脏病、心肌病、心肌炎等心脏病者或多发全身感染性炎症者。冠脉标本的选取符合中华人民共和国卫生部颁布的《解剖尸体规则》并遵循《赫尔辛基宣言》，得到患者直系亲属的知情同意并获得贵州医科大学伦理审查委员会审批（伦理批号：201801）。

1.2 人冠状动脉组织HE染色

HE染色观察人冠脉组织结构改变。将选取的人冠状动脉组织或小鼠主动脉组织4%多聚甲醛固定72 h后，血管横断面石蜡包埋，4 µm切片后常规HE染色，显微镜下观察血管形态结构变化。

1.3 免疫荧光检测人冠脉内膜ATF3的表达与分布

免疫荧光检测ATF3的表达及其与CD68共表达。人体冠脉组织石蜡切片脱蜡水合，EDTA抗原修复缓冲液（pH8.0）微波抗原修复，牛血清封闭30 min，分别用兔单克隆抗体ATF3（1∶150，Abcam）和CD68（1∶150， Gene Tex）按照1∶1比例混合后，以PBS缓冲液为阴性对照，湿盒内4 ℃冰箱孵育过夜。次日，CY3山羊抗小鼠和488山羊抗兔混合二抗（中国武汉赛维尔公司）覆盖组织，避光室温孵育50 min，加入自发荧光淬灭剂孵育后DAPI复染细胞核，抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜观察并拍照：复染细胞核的DAPI紫外激发波长为330~380 nm，发射波长420 nm，发蓝光；复染ATF3的488二抗激发波长为465~495 nm，发射波长515~555 nm，发绿光；复染CD68的CY3二抗激发波长为510~560 nm，发射波长590 nm，发红光。

1.4 人冠脉组织蛋白印迹检测

采用Western blotting法进行检测人冠脉血管组织的蛋白表达量。取-80 ℃保存的血管组织，按照1 mg/20 μL的比例加入蛋白裂解液［RIPA裂解液（强）：蛋白酶抑制剂：磷酸酶抑制剂=100∶1∶2］充分研磨匀浆，离心后取上清液，紫外分光光度计测量蛋白浓度，8-12%SDS-PAGE电泳，转膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂牛奶封闭2 h后洗膜，根据目标蛋白分子大小，对相应PVDF膜分别加入1×TBST缓冲液配制的第一抗体ATF3（1∶300，Abcam），CD68（1∶1000，武汉三鹰），于4 ℃孵育过夜，洗膜后加山羊抗兔 IgG （H+L） 抗体（1∶8000，赛默飞）室温孵育1 h，增强化学发光液（ECL）（Millipore）于Bio-Rad凝胶成像系统（伯乐）显色。实验重复3次，以β-actin为内参，利用Image J软件分析测量条带灰度值，以3次测量的均值作为测定结果。

1.5 实验动物模型的构建

SPF级8~9周龄雄性ApoE^-/-小鼠32只（维通利华公司许可证号：SCXK（京）2016-0006），动物实验遵循动物福利原则并获得贵州医科大学伦理审查委员会批准（伦理批号：1901096）。小鼠饲养环境温度为22~26 ℃；湿度为（50±5）%的微隔离笼中，12 h∶12 h明/暗循环，自由进食和饮水。普通饲料饲养适应1周后，采用随机数字表法将小鼠分为正常组、AS组、AAV9-eGFP及AAV9-ATF3组，8只/组，除正常组予以普通饲料饲养外，其余各组小鼠均予以高脂饲料（0.25% 胆固醇、15%脂肪）［迪科技（深圳）有限公司］^［14］饲养继续饲养12周，AAV9-ATF3基因敲除组予以尾静脉注射5×10¹¹vg/100 μL/只^［15］的AAV9-ATF3病毒（#5'-ATTCACACTC TCCA GTTTCTC-3'，以GV629为载体，NheI/HindIII 酶切，由上海吉凯基因化学技术有限公司设计包装和合成），AAV9-eGFP空载组予以尾静脉注射5×10¹¹vg/100 μL/只的AAV9-eGFP空载病毒（GV629载体），Con组及AS组予以100 μL/只等量生理盐水尾静脉注射，继续高脂喂养5周后予以戊巴比妥钠腹腔注射过量麻醉（20 mg）安乐处死，灌注后钝性分离小鼠胸主动脉至腹主动脉、肾动脉分叉处（黄色线内，图2B），取胸主动脉接近主动脉弓段约0.3 mm（红色框内，图2B），4%多聚甲醛固定液固定供冰冻和石蜡切片用，剩余血管组织PBS缓冲液清洗血液后，液氮迅速固定3 min后-80 ℃冻存供蛋白提取。0.5%滂胺天空蓝（上海生工）遮蔽自发荧光后eGFP观察小鼠主动脉斑块内转染效率并计算：eGFP转染效率=eGFP阳性表达面积/主动脉斑块面积×100%。HE染色观察小鼠主动脉斑块的改变并测量斑块面积。

1.6 小鼠主动脉油红O染色

油红O染色观察小鼠主动脉整体及横断面脂质沉积。钝性分离的小鼠胸、腹主动脉至肾动脉分叉处，眼科剪纵行剖开，用细微的固定针将血管平铺固定至泡沫板上，滴加预先配制好的油红O染液（中国索莱宝公司）浸染15 min，弃油红O染液，70%酒精浸洗分化5 min，再次更换70%酒精继续分化至组织变为乳白色，PBS缓冲液清洗3遍，观察油红O染色情况，拍照并使用Image-J计算红染面积占整个血管面积百分比。

取出-20 ℃冻存的切片，室温回温后蒸馏水浸洗，洗掉包埋剂，60%异丙醇提前润洗2 min，油红O工作液染色3 min，显微镜下控制染色时间，采用60%异丙醇调色，蒸馏水润洗终止染色时间，苏木精复染细胞核，盐酸酒精分化并严格控制分化时间，流水非直接接触浸洗10 min返蓝，甘油明胶封片剂封片。显微镜下观察，拍照并计算红染面积占斑块面积百分比。

1.7 小鼠主动脉免疫组织化学染色

免疫组织化学检测小鼠主动脉ATF3及相关因子的表达及分布。4 ℃ 冰箱冻存的组织切片，取出后室温回温后，脱蜡水合后，3% H₂O₂ 37 ℃ 孵育10 min封闭内源性过氧化物酶，高压热修复抗原4 min，以PBS缓冲液按比例配制抗体MMP-2（1∶250）、ATF3（1∶150）（Abcam）；MMP-9（1：50）、CD68（1∶150）、CD45（1∶200）（Proteintech）；IL-1β（1：150）、VCAM1（1∶200）（Absin）；p-NF‑κB P65（Ser536）（1∶200）、TNF‑α（1∶100）（Immunoway）； p-IKKα/β（Ser176/180）（1∶75，CST），每张切片50 μL抗体覆盖组织切片，阴性对照选用PBS缓冲液，于湿盒内4 ℃孵育过夜。次日加入HRP标记二抗（中杉金桥），37 ℃恒温孵育50 min后DAB显色，苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察，排除非特异性染色，以黄色或黄褐色为阳性染色，于400×下选取3个视野拍照，IPP6.0软件测量血管内膜平均光密度值（MOD值），即MOD=阳性表达光密度值/测量总面积。结果为重复测量3次平均值。

1.8 小鼠主动脉组织蛋白印迹检测

Western blotting检测小鼠主动脉ATF3及相关因子的表达量。参照人冠脉组织的Western blotting检测方法，按照一抗浓度为：ATF3（1∶300）、MMP-2（1∶200）、β-actin（1∶2000）（Abcam）；CD68（1∶1000）、CD45 （1∶1000）、 MMP-9（1∶600）、NF-κB P65（1∶2000）、IKKβ（1∶800）（Proteintech）；IL-1β（1∶1000）、VCAM1（1∶1000）（Absin）；TNF-α（1∶1000）、p-NF-κB P65（Ser536）（1∶1000）（Immunoway）；p-IKKα/β（Ser176/180）（1∶1000）（CST）孵育第一抗体。实验重复3次，以β-actin为内参，利用Image J软件分析测量条带灰度值，以3次测量的均值作为测定结果。

1.9 THP-1细胞构建ATF3沉默泡沫细胞模型

采购THP-1（上海中桥）细胞株（#ZQ0086），用RPMI 1640培养基进行细胞培养，ATF3 siRNA（#1： 5'-G AGGCGACGAGAAAGAAAUAAGAUU-3'；#2：5'-A AUCUUAUUUCUUUCUCGUCGCCUC-3'）为干扰序列（Thermo Fisher），Lipofectamine3000（Thermo Fisher）为载体，靶向敲低THP-1细胞ATF3表达，160 nmo1/mL佛波酯PMA（Sigma）诱导THP-1细胞成为巨噬细胞，并进一步用80 ng/L氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）（中国广州奕源生物科技有限公司）诱导建立ATF3基因沉默的泡沫细胞模型。采用油红O染色试剂盒（中国索莱宝）鉴定泡沫细胞的建模情况，Western blotting检测ATF3基因沉默效果。

1.10 ATF3过表达的泡沫细胞模型构建

THP-1细胞用RPMI 1640培养基培养，以pcDNA3.1-C-3×Flag为克隆载体，构建ATF3 过表达的重组质粒（中国上海吉玛制药技术有限公司），以pcDNA3.1-GFP空载质粒作为对照，PMA、Ox-LDL诱导后建立ATF3基因过表达的泡沫细胞模型。

1.11 Western blotting检测体外ATF3及NF-κB相关因子表达情况

细胞调整至1.5×10⁶/mL的密度，加入100 μL细胞裂解液［RIPA裂解液（强）∶蛋白酶抑制剂∶磷酸酶抑制剂按照100∶1∶2）（Beyotime Biotechnology）提取细胞蛋白。参照人冠脉组织的Western blotting方法检测IKKβ， p-IKKα/β， NF-κB P65，p-NF-κB P65（Ser536）及β-actin的表达，实验独立重复3次，以β-actin为内参，利用Image J软件分析测量条带灰度值，以3次测量的均值作为测定结果。

1.12 统计学分析

用SPSS22.0统计软件对所得数据分析处理，将所得数据行正态分布及方差齐性检验，计量资料采用均数±标准差表示，方差齐性的多组间均数比较采用单因素方差分析，事后两两比较用LSD法，方差不齐者用Games-Howell法。当P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 人体冠状动脉组织病理学观察

HE染色结果显示，光镜下，Control组冠状动脉内膜壁薄而光滑，内、中、外膜厚度均匀一致；CHD组中，内膜不均匀增厚，管腔不同程度狭窄，内膜下见典型纤维帽，出现典型粥样坏死灶，坏死灶周边残留数量不等的泡沫细胞等炎细胞，坏死灶内可见斑块内出血、斑块破裂等继发病变形成，中膜显著受压变薄，管腔多呈偏心性狭窄（图1A、B）。

2.2 人冠状动脉粥样硬化病灶内ATF3蛋白表达及分布

免疫荧光及Western blotting结果显示，在正常组冠脉内膜未见ATF3表达，而CHD组的ATF3蛋白表达较正常组增高（图1C、D，P<0.05）。在人冠状动脉粥样硬化斑块内，ATF3（红光）与单核巨噬细胞的标记分子CD68（绿光）呈部分共表达（图1C）。

2.3 ApoE^-/-小鼠主动脉AAV9转染及ATF3基因敲低

在荧光显微镜下观察，对于ApoE^-/-小鼠转染eGFP的血管组织，在未经滂胺天空蓝处理的冰冻切片可见自发绿色荧光，用滂胺天空蓝处理后，Con组未见荧光表达，而在转染组，可见主动脉斑块内广泛不均匀的荧光分布，荧光面积占斑块面积的百分比约8%（图2C）。

免疫组化染色显示，Con组未见ATF3表达，在AS组和AAV9-eGFP组，ATF3表达在泡沫细胞胞质，光密度检测结果显示，与对照组比较AS组和AAV9-eGFP组ATF3表达增高（P<0.05），而AAV9-ATF3组的ATF3表达水平仅略高于Con组，明显低于AS组和AAV9-eGFP组（P<0.05），Western blotting法检测结果与IHC结果一致（图2D、E）。

2.4 ATF3的敲除增加ApoE^-/-小鼠主动脉斑块内脂质的沉积

大体结合冰冻切片油红O结果显示，小鼠主动脉斑块脂质被油红O染为红色或粉红色。Con组几乎未见红染，而在AS组、AAV9-eGFP组和AAV9-ATF3组中可见显著的红染，AAV9-ATF3组脂质红染面积占血管面积的百分值较AS组和AAV9-eGFP组增高（P<0.05，图3A、B）。

2.5 ATF3的敲除增加ApoE^-/-小鼠主动脉斑块面积

HE染色结果显示，Con组小鼠主动脉内膜光滑整齐，而AS组、AAV9-eGFP组和AAV9-ATF3组可见主动脉内膜不同程度增厚，管腔不同程度狭窄。对斑块面积进行检测，结果显示AAV9-ATF3组斑块面积高于AS组和AAV9-eGFP组（P<0.05，图3C）。

2.6 ATF3基因敲低增加ApoE^-/-小鼠主动脉斑块内炎症相关因子蛋白表达

免疫组化和Western blotting结果显示，和AS组、AAV9-eGFP组相比，ATF3基因KO小鼠主动脉斑块内，CD45、CD68、IL-1β及TNF-α蛋白水平增高（P<0.05，图4A、B）。

免疫组化和Western blotting结果显示，和AS组、AAV9-eGFP组相比，在ATF3基因KO小鼠主动脉斑块内，VCAM1、MMP-2及MMP-9水平增高（P<0.05，图5A、B）。

2.7 ATF3基因敲低进一步激活ApoE^-/-小鼠主动脉NF-κB通路

在ATF3敲除小鼠主动脉斑块内，P-IKKα/β和P-NF-κB p65较AS组及空载组升高，而IKKβ、NF-κB p65组间蛋白水平无差异（P<0.05，图6A、B）。

2. 8 细胞实验结果

泡沫细胞油红O结果显示，泡沫细胞模型建立成功（图7A）。siRNA干扰后，ATF3蛋白表达降低（P<0.05），这证实ATF3基因沉默有效，ATF3基因沉默后，P-IKKα/β和P-NF-κB p65升高（P<0.05），而IKKβ、NF-κB p65组间蛋白水平无差异（P>0.05，图7B）；反之，ATF3基因过表达后，P-IKKα/β和P-NF-κB p65降低（P<0.05，图7C）。

3 讨 论

动脉粥样硬化被认为是一种血管慢性炎症疾病，病灶内存在的炎细胞及多种炎症因子参与动脉粥样硬化的发生发展^{［16， 17］}。研究表明，动脉粥样硬化斑块的不稳定性与单核巨噬细胞在内的多种炎症细胞富集等多种因素直接相关^{［18， 19］}。VCAM-1介导炎细胞的滚动和黏附，从血液中招募并促进单核细胞进入血管内膜，VCAM-1表达的上调被认为是斑块不稳定的危险因素^［20］。CD45、CD68作为炎症细胞的标记分子^［21］，而IL-1β和TNF-α均是由炎症细胞所产生的促炎因子，主要介导人体免疫反应和炎症反应^［22-24］。在动脉粥样硬化晚期病变中，MMP-2和MMP-9表达增强并可降解斑块内多种胶原蛋白，诱导斑块破坏的发生^{［25， 26］}。斑块内单核细胞等炎症细胞粘附于内皮进入内膜下沉积并激活释放大量的炎症因子，促进斑块内胶原的降解后导致斑块稳定性的下降，最终导致不良事件的发生。我们的研究表明，在动脉粥样硬化发生后，斑块内上述因子的表达增强，这进一步证实动脉粥样硬化的发生与炎症反应相关。

ATF3是一种应激反应基因，在各种脂肪因子、趋化因子、细胞因子、缺氧和化疗药物等各种应激信号的刺激下诱导表达，在炎症细胞、神经元、胶质细胞、内皮细胞等多种细胞中均有表达^［27-30］。研究表明，ATF3基因功能障碍与炎症、信息传递、凋亡、氧化应激和内质网等多种病理生理反应有关，参与动脉粥样硬化的发生发展^［9］。既往研究通过分析来自NCBI-GEO（Gene Expression Omnibus）数据库的动脉粥样硬化数据集，发现破裂的动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞ATF3表达水平低于稳定的动脉粥样硬化斑块，并在动物实验中进一步证实，ATF3的缺乏和巨噬细胞增多可能是形成破裂的动脉粥样硬化斑块的危险因素^［31］。研究显示，ATF3为脂代谢和炎症途径在这些细胞中的关键交点，通过抑制25-羟基引起的脂质体形成防止动脉粥样硬化^［32］。ATF3可通过调控巨噬细胞的脂质代谢和诱导C型凝集素结构域家族4成员E（Clec4e）下游产生负反馈环来抑制小鼠主动脉粥样硬化的进展^［33］。本研究在人冠状动脉及ApoE^-/-小鼠主动脉中发现，动脉粥样硬化的发生可诱导斑块内ATF3在泡沫细胞的表达，这提示ATF3可能通过调节炎症反应在动脉粥样硬化中发挥重要作用。

为进一步验证ATF3与炎症反应间关系，靶向敲低ApoE^-/-实验小鼠主动脉ATF3的表达后结果显示，斑块内CD45、CD68、IL-1β和TNF-α表达增高，VCAM1、MMP-2和MMP-9的表达也进一步增加，斑块面积增加。而这些因子被证实在动脉粥样硬化发生发展过程中发挥重要作用，并受到NF-κB信号通路的调控。研究证实，动脉粥样硬化内活化的NF-κB通过调控白细胞介素（IL）、凋亡抑制因子、黏附分子、趋化因子、基质金属蛋白酶等的表达，促进动脉粥样硬化的发展^{［12， 34］}。ATF3和NF-κB的间接相互作用已经在脂多糖激活的巨噬细胞、脑缺血和肾脏的缺血-再灌注模型中被证实^{［35， 36］}，靶向ATF3基因敲除小鼠短暂性脑缺血后炎症反应和脑损伤加重，其机制可能与NF-κB信号通路进一步激活上调炎症反应基因转录水平有关^［37］，更有研究指出，ATF3通过和 NF-κB的p65亚基直接相互作用来抑制炎症反应的发生^［11］。本研究结果显示，ApoE^-/-小鼠ATF3基因靶向敲除后，小鼠主动脉斑块内NF-κB信号通路激活，斑块内磷酸化激活的IKKα/β和NF-κB p65就说明了这一点，而在Ox-LDL诱导的泡沫细胞模型中，ATF3的靶向敲低后，NF-κB信号通路亦呈现进一步激活状态，反之，过表达ATF3后，NF-κB信号通路的激活受到抑制。因此我们推测，ATF3靶向敲除后，小鼠主动脉粥样硬化斑块的加重，斑块内炎症反应的增强，其机制可能是ATF3对NF-κB信号通路具有抑制功能，当ATF3表达下降或沉默时，NF-κB信号通路会被明显激活，导致一系列炎症因子表达增加，使病灶的稳定性下降。因此，ATF3可能是动脉粥样硬化的重要保护因子，给予外源性ATF3可能为动脉粥样硬化的预防和治疗提供一种新的治疗策略。但ATF3是否通过调控NF-κB信号通路外其他机制发挥作用也尚未可知，由于ATF3在心血管系统中的关键和多效性作用，了解ATF3如何调控靶基因和细胞功能将使ATF3成为心血管疾病治疗的一个有吸引力的靶点，在课题组后面的实验设计和研究中，我们将针对这些问题进行下一步的研究。

综上所述，本研究证实了动脉粥样硬化明显诱导ATF3的表达。在ApoE^-/-小鼠靶向敲除ATF3后，动脉粥样硬化斑块面积增加，斑块内炎症反应程度增强，其机制可能部分通过进一步激活NF-κB信号通路。在动脉粥样硬化的进程中，ATF3可能是一种重要的保护调节剂。

参考文献

[1] Grandhi GR, Mszar R, Vahidy F, et al. Sociodemographic disparities in influenza vaccination among adults with atherosclerotic cardiovascular disease in the United States[J]. JAMA Cardiol, 2021, 6(1): 87-91.

[2] Döring Y, van der Vorst EPC, Weber C. Targeting immune cell recruitment in atherosclerosis[J]. Nat Rev Cardiol, 2024, 21(11): 824-40. doi：10.1038/s41569-024-01023-z

[3] Akazawa H. Mechanisms of cardiovascular homeostasis and pathophysiology: from gene expression, signal transduction to cellular communication[J]. Circ J, 2015, 79(12): 2529-36. doi：10.1253/circj.cj-15-0818

[4] Ghigo A, Laffargue M, Li MC, et al. PI3K and calcium signaling in cardiovascular disease[J]. Circ Res, 2017, 121(3): 282-92. doi：10.1161/circresaha.117.310183

[5] Wang XW, Yan KY, Wen CF, et al. Simvastatin combined with resistance training improves outcomes in patients with chronic heart failure by modulating mitochondrial membrane potential and the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathways[J]. Cardiovasc Ther, 2022, 2022: 8430733. doi：10.1155/2022/8430733

[6] Bauer AJ, Martin KA. Coordinating regulation of gene expression in cardiovascular disease: interactions between chromatin modifiers and transcription factors[J]. Front Cardiovasc Med, 2017, 4: 19. doi：10.3389/fcvm.2017.00019

[7] Hai T, Wolfgang CD, Marsee DK, et al. ATF3 and stress responses[J]. Gene Expr, 1999, 7(4-6): 321–35.

[8] Thompson MR, Xu DK, Williams BRG. ATF3 transcription factor and its emerging roles in immunity and cancer[J]. J Mol Med (Berl), 2009, 87(11): 1053-60. doi：10.1007/s00109-009-0520-x

[9] Zhou H, Li N, Yuan Y, et al. Activating transcription factor 3 in cardiovascular diseases: a potential therapeutic target[J]. Basic Res Cardiol, 2018, 113(5): 37. doi：10.1007/s00395-018-0698-6

[10] Peng J, Le CY, Xia B, et al. Research on the correlation between activating transcription factor 3 expression in the human coronary artery and atherosclerotic plaque stability[J]. BMC Cardiovasc Disord, 2021, 21(1): 356. doi：10.21203/rs.3.rs-155718/v1

[11] Kwon JW, Kwon HK, Shin HJ, et al. Activating transcription factor 3 represses inflammatory responses by binding to the p65 subunit of NF-κB[J]. Sci Rep, 2015, 5: 14470. doi：10.1038/srep14470

[12] Mussbacher M, Salzmann M, Brostjan C, et al. Cell type-specific roles of NF-κB linking inflammation and thrombosis[J]. Front Immunol, 2019, 10: 85. doi：10.3389/fimmu.2019.00085

[13] Zhao YL, Shao CY, Zhou HF, et al. Salvianolic acid B inhibits atherosclerosis and TNF-α-induced inflammation by regulating NF-κB/NLRP3 signaling pathway[J]. Phytomedicine, 2023, 119: 155002. doi：10.1016/j.phymed.2023.155002

[14] Sun Y, Guan J, Hou YF, et al. Silencing of junctional adhesion molecule-like protein attenuates atherogenesis and enhances plaque stability in ApoE^-/- mice[J]. Clin Sci (Lond), 2019, 133(11): 1215-28. doi：10.1042/cs20180561

[15] Chen QJ, Zhai H, Li XM, et al. Recombinant adeno-associated virus serotype 9 in a mouse model of atherosclerosis: Determination of the optimal expression time in vivo [J]. Mol Med Rep, 2017, 15(4): 2090-6. doi：10.3892/mmr.2017.6235

[16] Wen YC, Ahmad F, Mohri Z, et al. Cysteamine inhibits lysosomal oxidation of low density lipoprotein in human macrophages and reduces atherosclerosis in mice[J]. Atherosclerosis, 2019, 291: 9-18. doi：10.1016/j.atherosclerosis.2019.09.019

[17] Li HY, Sun K, Zhao RP, et al. Inflammatory biomarkers of coronary heart disease[J]. Front Biosci (Schol Ed), 2018, 10(1): 185-96. doi：10.2741/s508

[18] Ma CY, Xu ZY, Wang SP, et al. Change of inflammatory factors in patients with acute coronary syndrome[J]. Chin Med J (Engl), 2018, 131(12): 1444-9. doi：10.4103/0366-6999.233953

[19] Hou PB, Fang JK, Liu ZH, et al. Macrophage polarization and metabolism in atherosclerosis[J]. Cell Death Dis, 2023, 14(10): 691. doi：10.1038/s41419-023-06206-z

[20] Radecke CE, Warrick AE, Singh GD, et al. Coronary artery endo-thelial cells and microparticles increase expression of VCAM-1 in myocardial infarction[J]. Thromb Haemost, 2015, 113(3): 605-16. doi：10.1160/th14-02-0151

[21] Woudstra L, Biesbroek PS, Emmens RW, et al. CD45 is a more sensitive marker than CD3 to diagnose lymphocytic myocarditis in the endomyocardium[J]. Hum Pathol, 2017, 62: 83-90. doi：10.1016/j.humpath.2016.11.006

[22] Libby P. Interleukin-1 beta as a target for atherosclerosis therapy: biological basis of CANTOS and beyond[J]. J Am Coll Cardiol, 2017, 70(18): 2278-89. doi：10.1016/j.jacc.2017.09.028

[23] Williams JW, Huang LH, Randolph GJ. Cytokine circuits in cardiovascular disease[J]. Immunity, 2019, 50(4): 941-54. doi：10.1016/j.immuni.2019.03.007

[24] Xia F, Zeng QR, Chen J. Circulating brain-derived neurotrophic factor dysregulation and its linkage with lipid level, stenosis degree, and inflammatory cytokines in coronary heart disease[J]. J Clin Lab Anal, 2022, 36(7): e24546. doi：10.1002/jcla.24546

[25] Wågsäter D, Zhu CY, Björkegren J, et al. MMP-2 and MMP-9 are prominent matrix metalloproteinases during atherosclerosis development in the Ldlr (-/-) Apob(100/100) mouse[J]. Int J Mol Med, 2011, 28(2): 247-53. doi：10.3892/ijmm.2011.693

[26] Volkov AM, Murashov IS, Polonskaya YV, et al. Changes of content of matrix metalloproteinases and their tissue expression in various types of atherosclerotic plaques[J]. Kardiologiia, 2018(10): 12-8. doi：10.18087/cardio.2018.10.10180

[27] Hai T, Wolford CC, Chang YS. ATF3, a hub of the cellular adaptive-response network, in the pathogenesis of diseases: is modulation of inflammation a unifying component[J]? Gene Expr, 2010, 15(1): 1-11. doi：10.3727/105221610x12819686555015

[28] Udayakumar TS, Stoyanova R, Shareef MM, et al. Edelfosine promotes apoptosis in androgen-deprived prostate tumors by increasing ATF3 and inhibiting androgen receptor activity[J]. Mol Cancer Ther, 2016, 15(6): 1353-63. doi：10.1158/1535-7163.mct-15-0332

[29] Zhao J, Li XY, Guo MX, et al. The common stress responsive transcription factor ATF3 binds genomic sites enriched with p300 and H3K27ac for transcriptional regulation[J]. BMC Genomics, 2016, 17: 335. doi：10.1186/s12864-016-2664-8

[30] Jeong BC, Kim JH, Kim K, et al. ATF3 modulates calcium signaling in osteoclast differentiation and activity by associating with c-Fos and NFATc1 proteins[J]. Bone, 2017, 95: 33-40. doi：10.1016/j.bone.2016.11.005

[31] Qin WW, Yang HY, Liu GZ, et al. Activating transcription factor 3 is a potential target and a new biomarker for the prognosis of atherosclerosis[J]. Hum Cell, 2021, 34(1): 49-59. doi：10.1007/s13577-020-00432-9

[32] Gold ES, Ramsey SA, Sartain MJ, et al. ATF3 protects against atherosclerosis by suppressing 25-hydroxycholesterol-induced lipid body formation[J]. J Exp Med, 2012, 209(4): 807-17. doi：10.1084/jem.20111202

[33] Clément M, Basatemur G, Masters L, et al. Necrotic cell sensor Clec4e promotes a proatherogenic macrophage phenotype through activation of the unfolded protein response[J]. Circulation, 2016, 134(14): 1039-51. doi：10.1161/circulationaha.116.022668

[34] Ren JC, Han YS, Ren TM, et al. AEBP1 promotes the occurrence and development of abdominal aortic aneurysm by modulating inflammation via the NF-κB pathway[J]. J Atheroscler Thromb, 2020, 27(3): 255-70. doi：10.5551/jat.49106

[35] Gilchrist M, Thorsson V, Li B, et al. Systems biology approaches identify ATF3 as a negative regulator of Toll-like receptor 4[J]. Nature, 2006, 441(7090): 173-8. doi：10.1038/nature04768

[36] Li HF, Cheng CF, Liao WJ, et al. ATF3-mediated epigenetic regulation protects against acute kidney injury[J]. J Am Soc Nephrol, 2010, 21(6): 1003-13. doi：10.1681/asn.2009070690

[37] Wang L, Deng S, Lu Y, et al. Increased inflammation and brain injury after transient focal cerebral ischemia in activating tran-scription factor 3 knockout mice[J]. Neuroscience, 2012, 220: 100-8. doi：10.1016/j.neuroscience.2012.06.010

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