Nrf2/HO-1抗氧化通路调控氯氰菊酯诱导的小鼠海马氧化损伤的机制

Role of the Nrf2/HO-1 pathway in cypermethrin-induced oxidative injury of mice hippocampal neurons

摘要

目的 探讨Nrf2/HO-1抗氧化通路在氯氰菊酯（CYP）诱导的C57BL/6小鼠海马氧化损伤中的作用及其机制。 方法 将10周龄C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组和CYP低剂量（5 mg/kg）、中剂量（10 mg/kg）、高剂量（20 mg/kg）组，连续3周经口灌胃染毒，检测海马组织丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）及过氧化氢酶水平。HE染色观察海马组织细胞形态学变化。免疫荧光双标技术检测Nrf2/HO-1蛋白在海马锥体层神经元细胞中的表达。RT-qPCR及Western blotting检测Nrf2及其下游靶激酶HO-1的mRNA与蛋白表达。 结果 与对照组相比，CYP暴露组脂质过氧化产物丙二醛含量逐渐增加，GSH-PX、T-SOD、过氧化氢酶等抗氧化酶活性逐渐下降，差异具有统计学意义（P<0.01）。HE结果显示，海马CA1、CA3区锥体层神经元受损，且暴露剂量越高损伤越严重。免疫荧光结果显示，CYP暴露引起Nrf2细胞核易位，Nrf2/HO-1蛋白共表达增加。RT-qPCR与Western blotting结果显示，CYP暴露诱导Nrf2及其下游靶激酶HO-1 mRNA与蛋白表达上调（P<0.01）。 结论 抗氧化通路Nrf2/HO-1调控CYP诱导的C57BL/6小鼠海马氧化损伤，且损伤效应与暴露水平呈现剂量效应关系。

Abstract

Objective To explore whether the antioxidant axis Nrf2/HO-1 is involved in the regulation of hippocampus injury induced by cypermethrin and its underlying mechanism. Methods Ten-week-old C57BL/6 mice were randomly divided into control group and cypermethrin exposure groups with low, medium, and high exposure levels. After 21 days of oral gavage of corn oil (control) or cypermethrin, the levels of MDA, T-SOD, GSH-Px and CAT in the hippocampus of the mice were examined to evaluate the oxidative stress levels. HE staining was used to observe morphological changes of the hippocampal neurons. Western blotting, immunofluorescence staining and RT-qPCR were employed to detect the protein expressions and mRNA expression of Nrf2 and HO-1 and HO-1. Results Subacute oral exposure to cypermethrin significantly increased MDA level, decreased the activities of antioxidant enzymes T-SOD, GSH-Px and CAT, and induced neuronal damage in the CA1 and CA3 regions in the hippocampus of C57BL/6 mice. Cypermethrin exposure also caused Nrf2 protein translocation from the cytoplasm to the nucleus, accompanied by upregulated expression levels of the key antioxidant factor Nrf2 and its downstream target kinase HO-1. Conclusion Cypermethrin exposure dose-dependently causes oxidative damage in the hippocampus of C57BL/6 mice, which is regulated by the Nrf2/HO-1 antioxidant pathway.

Graphical abstract

关键词

氯氰菊酯 / 杀虫剂 / 海马 / Nrf2/HO-1

Key words

cypermethrin / pyrethroid insecticide / hippocampus / Nrf2/HO-1

农药残留是全世界关注的公共卫生问题^［1］。据美国环境保护署开展的一项全国性住宅样本环境污染物检测结果显示，氯氰菊酯（CYP）的平均残留浓度最高^［2］。CYP是II型拟除虫菊酯类（Py）杀虫剂，据调查，Py杀虫剂使用量超过全世界杀虫剂使用总量的30%^［3］。随着Py杀虫剂使用量的增加，所伴随的农药残留问题及其对神经系统的危害也逐渐显现。杀虫剂暴露不仅诱导自由基产生引起氧化损伤，还会改变抗氧化防御机制^［4］。核转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）介导的信号转导在神经保护中起着重要作用^{［5， 6］}。Nrf2在多种组织和细胞类型中都有表达，特别是脑组织和神经细胞。血红素加氧酶1 （HO-1）是血红素降解途径中的限速酶，可将细胞中的前氧化血红素降解生成胆红素、胆绿素和一氧化碳，上述物质具有强大的抗氧化及细胞保护作用^{［7， 8］}。Nrf2/HO-1是机体重要的抗氧化轴，Nrf2与HO-1相互调节，共同维护细胞正常功能^{［9， 10］}。

研究表明，环境杀虫剂暴露与阿尔茨海默症、帕金森病等神经退行性疾病有关^{［11， 12］}。一项长达7年的流行病学调查显示，农药使用量较高地区的阿尔茨海默症和帕金森病患病风险显著高于农药使用量较低的地区^［13］。神经退行性疾病通常与神经元结构或功能损害有关^［11］。生命早期暴露Py杀虫剂可诱导海马氧化应激、神经元损伤及突触发育缺陷^{［14， 15］}。因此，海马是研究杀虫剂对认知功能影响的重要脑区，但目前就CYP暴露对海马的损伤效应的研究不多。海马是中枢神经系统的关键区域，也是认知功能调控的基础。作为室内高度残留的杀虫剂，CYP对海马的神经毒性值得探究。我们前期研究发现^［16-18］，Nrf2信号通路在CYP诱导的皮层神经元和小脑组织氧化损伤及凋亡过程中具有保护作用，但是该保护作用受暴露剂量和时间的影响。当CYP暴露剂量较低或时间较短时，Nrf2及其下游靶激酶激活，增强组织或细胞对抗氧化应激的能力；反之，Nrf2通路受到抑制。这一结果也证实Nrf2在稳定氧化与抗氧化平衡中的关键性，以及机体本能的Nrf2易位效应不足以防止杀虫剂的神经毒性。为全面探讨CYP的神经毒性，本实验模拟经口暴露途径建立CYP亚急性染毒模型，研究CYP对海马组织细胞的损伤效应以及抗氧化轴Nrf2/HO-1在CYP诱导海马损伤中的调控。一方面对现有的CYP神经毒性效应研究进行补充，另一方面也为探索与杀虫剂暴露相关的神经退行性疾病的研究提供新视角。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6小鼠，10周龄左右，体质量22.85±1.56 g，由蚌埠医科大学动物中心提供（SCXK［苏］2019-0001）。受试动物在实验中心屏障系统内进行无菌饲养，温度24±2 ℃，湿度（55±5）%，实验期间小鼠自由进食、饮水。动物实验符合蚌埠医科大学实验动物伦理规定（伦理批号：伦动科批字［2023］第648号）。

1.1.2 主要试剂与仪器

CYP标准品（Sigma-Aldrich）；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT） （南京建成）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit （Thermo）；UltraSYBR （CoWin）；Anti-Nrf2 antibody、Anti-HO-1 antibody（Proteintech），Anti‑β‑actin anti-body、Anti-H3 antibody （Cell Signaling Technology）。低温离心机（Eppendorf），荧光显微镜（Olympus）、Synergy 2 酶标仪（BioTek）、化学发光凝胶成像分析系统（Alpha Innotech）。

1.2 方法

1.2.1 实验设计

适应性喂养1周后，随机将小鼠分为4组：对照组（Control）以及CYP低（5 mg/kg）、中（10 mg/kg）、高剂量（20 mg/kg）暴露组，12只/组。将CYP溶于玉米油中，按照暴露剂量连续3周经口灌胃（染毒剂量基于前期实验结果），给药量为1 mL/kg，每隔1 d称取小鼠体质量。对照组行玉米油灌胃，其余条件相同。染毒结束，小鼠用异氟醚麻醉后处死，剪开颅骨，完整取出脑组织，分离双侧海马，液氮冷冻后-80 ℃保存。

1.2.2 氧化及抗氧化水平检测

用生理盐水冲洗海马组织表面残留血污，滤纸吸干、称质量、剪碎，按照每克组织加入9 mL生理盐水制成10%组织匀浆。4000 g离心10 min，分离上清，4 ℃冰箱保存。按照试剂盒说明书步骤配置相应试剂，采用酶标仪分别在450 nm （T-SOD）、412 nm （GSH-Px）、405 nm （CAT）及532 nm （MDA）波段处检测各组吸光度值A。以 nmol/mg蛋白为单位记录MDA含量，以U/mg蛋白为单位记录抗氧化酶T-SOD、GSH-Px和CAT的活性。组织匀浆蛋白采用BCA法分别定量。

1.2.3 苏木素-伊红（HE）染色观察组织细胞形态学变化

小鼠麻醉后，每组随机选择3只经左心室和升主动脉快速注射0.9%生理盐水和4%多聚甲醛，进行组织病理学分析。解剖颅骨，完整取出脑组织，用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，参照小鼠脑立体定位图谱，对海马区连续切片，每张切片厚约5 μm，切5选1，二甲苯脱蜡，HE染色后用中性树胶封片，分别用光学显微镜在20倍、40倍视野下观察海马区域组织细胞形态学变化。每张切片至少随机选择5个区域，每组选取3个样本。

1.2.4 免疫荧光双染检测蛋白表达

采用免疫荧光双染技术检测Nrf2/HO-1蛋白在海马锥体层神经元细胞表达。按上述方法制备石蜡切片，常规脱蜡后进行抗原修复。采用0.2% Triton X-100破膜，5%牛血清白蛋白封闭。随后，组织切片用兔抗Nrf2（1∶500）和HO-1（1∶1000）在4 ℃冰箱过夜，次日，荧光二抗在室温下避光孵育1 h，随后用DAPI进行细胞核染色，封片后在荧光显微镜下观察并拍照。标记绿色荧光的为HO-1蛋白，标记红色荧光的为Nrf2蛋白。每张切片随机选择5个视野，计数细胞阳性表达后取均值，采用ImageJ软件进行分析。

1.2.5 RT-qPCR检测mRNA水平

将海马组织按照比例加入适量裂解液后在低温下匀浆，根据总RNA提取试剂盒要求分别提取各组RNA，用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，测定样品浓度和纯度。对于符合要求的样本，按照UltraSYBRMixture试剂盒要求配置相应PCR反应体系。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环。以β-actin作为内参，用2^－△△Ct法评估mRNA相对表达量，每组设3个样本，每个样本重复3次。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物信息见表1。

1.2.6 Western blotting分析蛋白表达

称取20 mg海马组织，加入200 μL含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，置于冰上裂解30 min。随后，12 000 g离心15 min取上清。采用BCA法测定蛋白浓度，蛋白上样量为30 μg。用10%的SDS-PAGE分离胶进行电泳后转移到0.45 μm PVDF膜上。脱脂牛奶室温封闭2 h，TBST洗膜3次，5 min/次，随后将膜与Nrf2（1∶500）、HO-1（1∶1000）、H3 （1∶1000）及β-actin （1∶1000）抗体在4 ℃孵育过夜。使用化学发光凝胶成像分析系统检测ECL发光并采集图像，ImageJ软件对相应灰度值进行半定量分析。

1.3 统计学分析

应用统计软件SPSS 26.0进行数据分析，计量数据以均数±标准差表示，组间差异比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。每组实验至少重复3次。

2 结果

2.1 小鼠状态及体质量变化

对照组小鼠活泼、警觉，正常摄食饮水；暴露组小鼠精神萎靡，毛色发暗有污渍，耳朵和尾巴上出现新旧不一的撕咬痕迹，中、高剂量组较为明显。小鼠初始体质量为22.85±1.56 g，组间差异无统计学意义（P>0.05）。实验结束时，各组小鼠体质量较初始均有所增加；与对照组相比，CYP 20 mg/kg组体质量增加缓慢，两组小鼠体质量差异具有统计学意义（P<0.05，图1）。

2.2 CYP暴露引起小鼠海马氧化损伤

与对照组相比，暴露组GSH-Px、T-SOD、CAT活性下降，随着染毒剂量增加，酶活性逐渐降低，CYP 10 mg/kg、20 mg/kg组与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。暴露组海马组织MDA含量高于对照组，随着染毒剂量增加，MDA含量逐渐升高，CYP 10 mg/kg、20 mg/kg组与对照组差异具有统计学意义（P<0.01，图2）。

2.3 HE染色观察海马组织形态学变化

对照组海马CA1、CA3和DG区形态正常，结构紧密，神经元细胞数量丰富，分子层、锥体层 （颗粒层）、多形层等各层结构清晰，锥体层与颗粒层细胞排列规则，胞质丰富，胞核大而圆（图3A2~A4）。在CYP 5 mg/kg组，神经元细胞排列松散（图3B2、B3）。随着暴露剂量增加，CA1、CA3及DG区神经元结构紊乱，细胞间隙增大，可见较多神经元固缩深染（黑色箭头），以高剂量暴露组损伤最为明显（图3）。

2.4 免疫荧光双染分析Nrf2/HO-1蛋白表达

对照组海马CA1、CA3区锥体层神经元细胞核形态规则，均匀蓝染。标记绿色荧光的HO-1蛋白分布均匀，荧光强度较弱，标记红色荧光的Nrf2蛋白表达微弱。随着CYP暴露剂量增加，细胞内荧光强度增强，细胞核出现固缩深染。荧光显微镜下可见红色、绿色细胞共定位现象（白色箭头），即Nrf2和HO-1蛋白在海马锥体层神经元细胞共表达。随着暴露剂量增加，Nrf2/HO-1蛋白共表达比例增加，暴露组与对照组差异具有统计学意义（P<0.01，图4）。

2.5 RT-qPCR分析mRNA表达

与对照组相比，CYP暴露组Nrf2和HO-1的mRNA相对表达量均有上调，随着暴露剂量增加，mRNA表达量也增加，CYP 10 mg/kg、20 mg/kg组与对照组在mRNA表达上的差异具有统计学意义（P<0.01，图5）。

2.6 Western blotting分析蛋白表达

与对照组相比，暴露组Nrf2、HO-1总蛋白以及Nrf2细胞核蛋白表达量均有增加，随着暴露剂量增加，蛋白表达量也逐渐增加，CYP 10 mg/kg、20 mg/kg组与对照组在蛋白表达上的差异具有统计学意义（P<0.01，图6）。

3 讨论

中枢神经系统是II型Py杀虫剂的主要神经毒性靶点^［1］。作为环境和农产品中普遍存在且高度残留的杀虫剂，CYP能够选择性地作用于脑组织，诱导该部位产生氧化应激，造成细胞损伤、凋亡或坏死^{［17， 19］}。氧化应激是Py杀虫剂导致神经毒性的主要生物学变化^［20］，当氧化物质产生和清除超过机体抗氧化能力时，活性氧会破坏脂质、蛋白质、核酸等大分子，诱发组织/细胞损伤^［21］。在前期实验基础上，我们选择低、中、高3个剂量水平的CYP模拟经口暴露途径对C57BL/6小鼠进行为期3周的染毒。结果显示，CYP暴露导致脂质过氧化产物MDA水平升高，抗氧化防御关键酶GSH-PX、T-SOD和CAT活性降低，这与Gargouri等^［14］的研究结果一致。氧化还原系统酶活性的降低反映了机体抗氧化系统无法抵御活性氧攻击引起的氧化损伤^［22］。与其他重要器官相比，脑组织由于富含高浓度多不饱和脂肪酸，对脂质过氧化非常敏感，对自由基损伤的防御能力较弱^［23］。

有研究发现^［24］，Py类杀虫剂溴氰菊酯能够诱导大鼠脑额叶皮层和海马神经元细胞选择性丧失以及星形胶质增生。本研究显示，CYP暴露导致海马锥体层神经元排列紊乱，细胞间隙增大，细胞质与细胞核界限模糊，CA1与CA3区神经元细胞出现核固缩现象，且CYP暴露剂量越高，神经元损伤越严重。杀虫剂暴露能够引起大脑特定区域的神经元丧失，从而导致随后的认知能力下降、记忆和注意力受损^［12］，除此之外，杀虫剂暴露还能够改变多种记忆相关蛋白的表达水平^［25］，这一系列改变可能最终导致阿尔茨海默症、帕金森病等神经退行性疾病的发生。免疫荧光结果表明，随着CYP暴露剂量增加，标记Nrf2蛋白与HO-1蛋白的荧光强度逐渐增强，Nrf2由胞浆易位到胞核，Nrf2与HO-1蛋白细胞共表达增加。Western blotting与RT-qPCR显示Nrf2及HO-1 mRNA及蛋白表达增强，该结果与免疫荧光表达一致。研究发现^［26］，抑制Nrf2核易位能够加剧CYP诱导的氧化应激和内在凋亡以及线粒体抗氧化蛋白表达减少。Nrf2激活剂萝卜硫素能够促进Nrf2核易位来减弱CYP诱导的线粒体抗氧化蛋白表达的降低。因此，Nrf2的激活是机体发挥抗氧化作用的关键环节。然而与本研究不同，Sarkar等^［26］发现CYP在诱导Wistar大鼠黑质纹状体组织损伤中Nrf2在细胞质和细胞核中的表达不一致，与对照组相比，细胞质中Nrf2蛋白表达增加而细胞核中Nrf2蛋白表达下降。这可能是鼠种的差异也可能是损伤部位、暴露时间不同导致的差异。

应激条件下，生物体通过上调参与氧化还原信号通路的基因来抵消或平衡应激源损伤并维持内稳态^［27］。Nrf2/HO-1通路是协调神经系统适应性应激反应初始阶段的核心^［28］。细胞通过触发Nrf2抗氧化通路及调控靶基因的表达来抵抗氧化应激，靶基因蛋白产物通过偶联反应参与活性氧的解毒和清除，增加细胞抗氧化能力^［29］。生理状态下，Nrf2的合成与降解同时进行，未降解的Nrf2通过Keap1锚定在细胞质中，因此，Nrf2在细胞中呈低水平表达^［30］。Nrf2的稳定状态使细胞内抗氧化系统处于基础表达水平，以确保细胞稳态。当细胞受到内外环境自由基和化学物质刺激时，Nrf2被激活并与其抑制因子Keap1解离，激活后的Nrf2易位到细胞核，与抗氧化反应元件（ARE）结合，启动下游ARE依赖型抗氧化酶基因和Ⅱ相解毒酶基因的转录，促使HO-1表达上调^{［31， 32］}。HO-1是一种细胞保护蛋白，HO-1的上调可减轻脑微血管充血，阻止血脑屏障损伤^［33］。HO-1蛋白表达取决于Nrf2通路的激活，HO-1也可通过HO-1基因应急响应元件调节Nrf2的活性^{［9， 10］}。Nrf2与HO-1相互作用增加机体抗氧化和神经保护作用^［34］。

综上所述，本研究表明，CYP亚急性暴露诱导C57BL/6小鼠海马区锥体层神经元氧化损伤，脂质过氧化产物含量增加，抗氧化酶活性降低，且损伤效应与暴露剂量呈剂量效应关系。CYP暴露诱导Nrf2/HO-1信号通路活化，Nrf2核易位，下游靶激酶HO-1表达上调。我们认为Nrf2/HO-1通路参与调控CYP诱导的C57BL/6小鼠海马抗氧化防御。感知氧化应激和协调防御反应是组织细胞适应和生存能力的重要方面^［35］。生命体通过直接的酶激活/失活机制表现出的适应性反应是一种本能^{［36，37］}。机体的这种本能应激反应能持续多久？反应阈值在哪里？探索Nrf2/HO-1通路在CYP诱导C57BL/6小鼠海马损伤效应中的抗氧化防御阈值是本课题下一步的研究目标。

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