Orexin-A通过调节促离子型谷氨酸受体促进脊髓损伤大鼠运动功能恢复

Orexin-A promotes motor function recovery of rats with spinal cord injury by regulating ionotropic glutamate receptors

摘要

目的 探讨Orexin-A对促离子型谷氨酸受体的调节在大鼠脊髓损伤（SCI）运动功能恢复中的作用。 方法 36只7~14 d新生SD大鼠随机平均分为6组：对照组、假手术组、SCI+生理盐水组、SCI+DNQX组、SCI+Orexin组和SCI+Orexin+DNQX组。除了对照组和假手术组外，其他各组施以SCI手术，术后连续3 d，每天分别向SCI各组鞘内注射对应的药物1次。分别在术前1 d，术后1、3和7 d，应用BBB评分和斜板试验评估各组大鼠运动功能；在膜片钳实验中，将对照组、假手术组、SCI组和SCI+Orexin组大鼠麻醉后，制作脊髓切片，通过酶消化和机械吹打分离出腹角神经元，通过灌流谷氨酸，比较各组大鼠脊髓腹角神经元谷氨酸受体介导电流的翻转电位、动力学指标的差异。 结果 在术后3 d、7 d，SCI+Orexin组的BBB评分和抓握倾斜角度比SCI+生理盐水组、SCI+DNQX组和SCI+Orexin+DNQX组皆升高（P<0.01）。在术后第7天，SCI+Orexin+DNQX组高于SCI+DNQX组（P<0.01）。SCI组脊髓腹角神经元谷氨酸电流的翻转电位高于SCI+Orexin组和假手术组（P<0.01）。在谷氨酸电流动力学指标中，SCI组的上升斜率比SCI+Orexin组和假手术组皆增大（P<0.05）。在衰减时间项，SCI组比SCI+Orexin组、假手术组皆减小（P<0.05）。 结论 Orexin-A可能通过调节（改善）促离子型谷氨酸受体的功能促进脊髓损伤后运动功能的恢复。

Abstract

Objective To investigate the effect of orexin-A-mediated regulation of ionotropic glutamate receptors for promoting motor function recovery in rats with spinal cord injury (SCI). Methods Thirty-six newborn SD rats (aged 7-14 days) were randomized into 6 groups (n=6), including a normal control group, a sham-operated group, and 4 SCI groups with daily intrathecal injection of saline, DNQX, orexin-A, or orexin-A+DNQX for 3 consecutive days after PCI. Motor function of the rats were evaluated using blood-brain barrier (BBB) score and inclined plane test 1 day before and at 1, 3, and 7 days after SCI. For patch-clamp experiment, spinal cord slices from newborn rats in the control, sham-operated, SCI, and SCI+orexin groups were prepared, and ventral horn neurons were acutely isolated to determine the reversal potential and dynamic indicators of glutamate receptor-mediated currents under glutamate perfusion. Results At 3 and 7 days after SCI, the orexin-A-treated rats showed significantly higher BBB scores and grip tilt angles than those with other interventions. Compared with those treated with DNQX alone, the rats receiving the combined treatment with orexin and DNQX had significantly higher BBB scores and grip tilt angles on day 7 after PCI. In the patch-clamp experiment, the ventral horn neurons from SCI rat models exhibited obviously higher reversal potential and greater rise slope of glutamate current with shorter decay time than those from sham-operated and orexin-treated rats. Conclusion Orexin-A promotes motor function recovery in rats after SCI possibly by improving the function of the ionotropic glutamate receptors.

Graphical abstract

关键词

Orexin-A / 促离子型谷氨酸受体 / 脊髓损伤 / 脊髓腹角神经元 / 膜片钳记录

Key words

orexin-A / ionotropic glutamate receptor / spinal cord injury / spinal cord ventral horn neurons / patch-clamp recording

脊髓作为中枢神经系统的重要组成部分，是感觉信息传入和运动指令传出的重要通道。当脊髓遭受损伤时，其内部的神经纤维束被切断，导致大脑与身体的“通信”中断，进而引发运动障碍和瘫痪。如何帮助脊髓损伤瘫痪者恢复基本的运动能力，一直是学术界研究的重点。有研究报道显示^［1］，通过联合使用5-羟色胺能药物、硬膜外电刺激以及常规的康复训练，因脊髓受损而瘫痪的大鼠可以逐渐恢复一定的行走能力。这一发现为人类脊髓损伤治疗提供新的思路^［2］。

食欲素（Orexin，也称作hypocretin）是由下丘脑和穹窿区的神经元分泌的兴奋性神经肽，有orexin-A和orexin-B两种，其通过两种G蛋白耦联受体，即orexin-1受体（OX₁R）和orexin-2受体（OX₂R）参与运动控制等多种生理功能的调节^［3-8］。在运动过程中，Orexin神经元特别活跃，Orexin的释放量明显增加^{［9， 10］}。在切除大脑的动物实验中，向中脑运动区注入Orexin可以触发动物运动和增强肌紧张^［11］。有研究报道^［12］，Orexin-A通过激活其受体，直接使大鼠皮层下运动中枢的前庭神经外侧核神经元去极化、放电频率加快、神经元敏感性提高。Yamuy等^［13］报道通过电刺激下丘脑穹隆周区Orexin能神经元，可引起猫脊髓腰段运动神经元细胞膜去极化和放电频率加快，该效应由OX₁R介导。Orexin参与行为运动的调控^［14］，可能与脊髓腹角神经元上的谷氨酸能系统存在相互作用。有报道称，间歇性的伤害性刺激可以快速选择性地增加AMPA受体亚基GluA1丝氨酸831的磷酸化，并使其定位到受损脊髓的突触上，同时减少突触上的GluA2，这提示脊髓损伤导致运动功能障碍可能与谷氨酸受体的结构和功能等变化有关^［15］。在许多脊髓外中枢的研究发现，Orexin对于谷氨酸能系统具有重要调制作用^［16-18］。那么，Orexin是否能够通过调控谷氨酸受体参与脊髓损伤后的运动功能恢复呢？尚不清楚。仅有研究发现通过Orexin-A的治疗，可显著减轻糖尿病动物的痛觉过敏和运动缺陷，但未涉及Orexin对脊髓损伤后运动功能恢复作用的研究，更未深入到对脊髓腹角神经元谷氨酸受体功能的探讨^［19］。

本实验采用新生SD大鼠构建脊髓损伤模型，结合膜片钳记录技术和动物行为学实验方法，探究Orexin-A调制促离子型谷氨酸受体在脊髓损伤运动功能恢复中的潜在作用，重点研究Orexin-A对脊髓损伤后腹角神经元中谷氨酸电流的翻转电位和动力学指标的影响。通过该系列研究，可以明确Orexin和促离子型谷氨酸受体对脊髓损伤后运动功能恢复是否具有正性促进作用，这将有助于进一步完善脊髓损伤导致系列病理变化的相关知识体系，也可为临床治疗脊髓损伤提供重要的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

7~14 d SPF级新生Sprague-Dawley（SD）大鼠56只，采购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物许可证号码：SCXK（鲁）20190003。动物在正常昼夜节律12 h/12 h，干净整洁，通风良好和室温24±2 ℃环境条件下饲养。动物使用全过程遵循皖南医学院实验室动物饲养和使用规章条例。本研究通过皖南医学院实验动物伦理审查（伦理批号：LLSC-2020-009）。

1.2 溶液和药品

参照实验室前期工作^［20］，在室温下配制人工脑脊液（ACSF）且现配现用，配方（mmol/L）：124.0 NaCl，24.0 NaHCO₃，5.0 KCI，2.4 CaCl₂，1.3 MgSO₄，1.2 KH₂PO₄和10.0 Glucose，使用前要使得ACSF的pH值维持在7.35~7.45，需要提前并持续通入混合氧气（95%O₂+5%CO₂）。

配制标准细胞外液，现配现用，配方（mmol/L）：5.0 KCl，2.0 CaCl₂，150.0 NaCl，1.0 MgCl₂，10.0 Glucose和10.0 HEPES，用Tris-base调节pH值在7.35~7.45，最后定容至1000 mL。

配制电极内液，分装保存于-20 ℃冰箱，使用时将其解冻即可，配方（mmol/L）：120.0 K-gluconate，20.0 KCI，2.0 MgCl₂，0.5 EGTA，20.0 HEPES，2.0 Na₂-ATP和0.5 Na-GTP。滴加KOH调节pH值至7.26。

HEPES、Tris-base、K-gluconate、EGTA、Na₂-ATP、Na-GTP和DNQX（非NMDA型谷氨酸受体拮抗剂）均购于SIGMA公司；Orexin-A购于Tocris Bioscience公司；其他普通试剂购于国药集团化学试剂有限公司。

1.3 构建脊髓损伤模型、给药方式和运动功能评估

1.3.1 构建脊髓损伤模型

行为学实验大鼠不分雌雄，且初次BBB评分在接近21分后按随机数字表法被随机分为6组（n=6）：正常组、假手术组、SCI（脊髓损伤）+生理盐水组、SCI+DNQX组、SCI+Orexin组、和SCI+Orexin+DNQX组。膜片钳实验大鼠被分为4组（n=5）：正常组、假手术组、SCI组和SCI+Orexin组。正常组大鼠不接受任何处理，假手术组大鼠接受皮肤手术和椎板切除术；SCI（SCI+生理盐水）组大鼠、SCI+DNQX组大鼠、SCI+Orexin组大鼠以及SCI+Orexin+DNQX组大鼠均接受皮肤手术和SCI手术，并用相应的药物进行鞘内注射处理。脊髓横断手术过程如下，实施冰浴辅以乙醚麻醉后，将新生大鼠俯卧固定在自制手术台上，使用手术刀片在大鼠背部做1~2 cm的中线皮肤切口，并从T₉和T₁₀椎骨的棘突向脊柱侧切并分离棘旁肌，在T₉和T₁₀椎骨的两侧开切口，并使用牵开器将肌肉从手术区域缩回，露出T₈~T₁₁椎体椎板和棘突。使用咬骨钳对T₉椎骨行背侧椎板切除术，使用显微外科手术刀在脊髓上进行完全横断，并用4-0手术线分别缝合肌肉和皮肤层。造模后，实验大鼠的后肢运动功能显著丧失，表现为后肢拖地，尾巴无法抬起，亦或BBB评分降至0分或接近0分即为造模成功。在脊髓损伤后的7 d内施用阿莫西林以防感染。术后由人工喂养确保实验动物有足够的水和食物。对于脊髓损伤的大鼠，术后护理每天按压膀胱3次。

1.3.2 鞘内给药

进行鞘内注射^［21］时，剃除大鼠腹部和腰骶区的毛发，并用75%酒精溶液清洁。以上4个处理组的大鼠以俯卧位固定，将骨盆肢体尽可能置于腹部下方，以托起腰骶区。鞘内注射使用无菌技术，每个针头只使用1次。注射部位位于最后一节腰椎和第1节骶椎（L6-S1）之间。成功注射的标志包括注射前针座中存在脑脊液和/或注射过程中尾巴抽动。如果没有观察到这些迹象，需要重新注射。本研究在SCI术后连续3 d，每天上午9∶30~10∶00鞘内微量注射Orexin-A（100 nmol/L，20 μL）、DNQX（1 μmol/L，20 μL）等不同药物。

1.3.3 运动功能评估

首先采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分法^［22］。BBB评分从0分（表示未观察到后肢运动）到21分（表示正常行走）不等。将大鼠单独放置在开阔场地上，让其自由活动5 min，分别在术前1 d，术后1、3、7 d评估各组大鼠的BBB评分。之后进行斜板试验，将大鼠放在一块覆盖了一片橡胶垫的木板上^［23］，并使其在橡胶垫的中心处，倾斜的木板可以围绕其底部旋转。被测大鼠身体轴线与木板平行。在每次试验中，木板角度增加5°。大鼠保持其位置5 s的最大角度被视为其功能评分。每只大鼠测量5次，记录平均值作为最终得分。

1.4 制备离体脊髓切片

使用冰浴辅以乙醚麻醉新生大鼠，待其失去知觉后，将其四肢固定在自制的手术台上，自尾部向头部方向剪开背部皮肤，使用剃须刀片把脊柱两侧肌肉划开，剪除椎板暴露出椎管中的脊髓，用眼科剪游离出脊髓，在ACSF冰水混合物中剪掉神经根并只保留腰骶膨大部分，尾端朝上固定于震荡切片机（Vibratome， Technical Products International Inc）的浴碟中央，用ACSF冰水混合物和通混合氧气保持脊髓活性，启动切片机切取约500 μm厚度的切片若干片，并及时转移至室温下通有混合氧气的ACSF中孵育约30 min。

1.5 酶消化联合急性机械分离细胞

取30 mL常温的ACSF，称取0.18 g木瓜蛋白酶溶解于其中，使用漩涡混匀器使其充分混匀。将孵育后的切片移入上述酶溶液中，持续通入混合氧气，并在33 ℃的恒温水浴锅中消解约20 min。消化完成后，将切片移至ACSF中，孵育40~60 min，并保证全程持续通入混合氧。

在普通光学显微镜下观察这些切片的形态状况，选取形态完整的切片。在ACSF中借助手术刀片切取脊髓切片腹侧，接着将该腹侧组织转移到含有氧饱和的标准细胞外液的培养皿（35 mm×10 mm， Corning）中，用自制的口径大小不同的巴斯德玻璃管轻巧快速地吹打，使其游离出单个细胞，待静置10 min细胞贴壁后进行膜片钳实验。

1.6 膜片钳记录技术

1.6.1 记录前准备

膜片钳实验中用到的仪器需要预热使之稳定运行，打开不间断电源系统总开关。按照顺序启动实验设备，清洗给药管，检查管道是否通畅，配制药液并贴好标签。打开实验记录所需的Clampex 10.6软件（Axon Instrument），并建立文件保存路径，用以保存记录的实验数据。

1.6.2 快速给药系统

本实验使用快速灌流给药系统SF-77B Perfusion（Warner Instrument）完成实验，借助重力将药物灌流到神经元细胞膜上的受体。同时，为防止药物在培养皿中积累过多致神经元受体失敏，应用恒流泵匀速从培养皿排出过剩的混合液。

1.6.3 膜片钳实验过程

将含脊髓腹角分离细胞的培养皿置于荧光倒置显微镜（Leica DMI 3000B）下，选取胞体较大、立体透亮、突起多而完整的健康神经元，移至视野中央，低倍镜下放置给药管，使冲洗管管口对准胞体，将玻璃微电极毛坯（Sutter Instrument）用微电极拉制仪（Model PC-10 Puller， NARISHIGE）拉制成记录电极，胞外给药时应用穿孔膜片钳记录模式，记录电极内注入含有穿孔药AB的电极内液，固定于微操纵仪（MP-225， Sutter Instrument）的电极夹持器，操控微操纵仪使电极尖端入液，入液后电极电阻若为5~10 MΩ，适用于记录。补偿失调电位，显微镜下缓慢移动电极尖端使其接触细胞，给予负压后使电极阻值达到GΩ形成高阻封接，穿孔药作用下，细胞自动破膜，在电压钳记录模式下，设置神经元基础钳制电位（V_H）为-70 mV，当接入电阻（Ra）值<60 MΩ时可对神经元进行给药记录。

1.7 数据采集与统计学分析

膜片钳实验过程中使用图像采集软件（LAS V3.8， Leica）观察神经元的状态，并拍摄保存照片，应用Clampex 10.6（Axon Instrument）电生理信号采集软件采集和处理原始数据。动物行为学实验和膜片钳实验皆用GraphPad Prism 9.4软件（GraphPad Software）统计数据和分析结果。根据电流-电压关系曲线进行线性拟合，测出各组大鼠脊髓腹角神经元谷氨酸电流的翻转电位。测定谷氨酸电流的上升时间、上升斜率、衰减时间和衰减斜率等动力学指标。本研究数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析、事后两两进行组间比较，P<0.05表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物行为学实验

动物行为学实验显示（图1）。术前1 d各组大鼠 BBB 评分相近。术后，不同处理组的评分变化趋势各异。纵向来看，SCI+Orexin组在术后3 d和7 d的BBB评分均呈现上升趋势，且提升幅度较为明显。横向比较，该组在这两个时间点的BBB评分显著高于SCI+生理盐水组、SCI+DNQX组和SCI+Orexin+DNQX组（P<0.01）。术后第7天，SCI+Orexin+DNQX组的BBB评分也明显高于SCI+DNQX组（P<0.01）。同时，模型组（SCI+生理盐水组、SCI+DNQX组、SCI+Orexin组、SCI+Orexin+DNQX组）的BBB评分远低于正常组和假手术组（P<0.01），而假手术组和正常组之间差异无统计学意义。斜板试验结果显示类似趋势。SCI+Orexin组术后3 d、7 d的抓握倾斜角度逐渐增大，且显著大于SCI+生理盐水组、SCI+Orexin+DNQX组和SCI+DNQX组（P<0.01）。术后第7天，SCI+Orexin+DNQX组的抓握倾斜角度同样大于SCI+DNQX组（P<0.01）。正常组和假手术组的抓握倾斜角度不仅无显著差异，而且远高于其他模型组。

2.2 脊髓腹角神经元的膜片钳实验

2.2.1 脊髓腹角神经元的形态

在倒置荧光显微镜下可观察到典型的腹角神经元（图2）。分离的腹角神经元状态良好，胞体饱满明亮，形态多样，有棱形、多边形和不规则形等，且胞体周围有较多长而完整的突起，细胞活性佳，适合进行膜片钳实验。

2.2.2 不同组脊髓腹角神经元谷氨酸电流翻转电位的比较

膜片钳实验的典型结果（图3）显示SCI组的谷氨酸电流翻转电位不同于正常组、假手术组和SCI+Orexin组。SCI组的翻转电位（19.0±3.1 mV）显著高于假手术组（2.5±2.0 mVP<0.01）和SCI+Orexin组（5.9±3.1 mV，P<0.01）；而SCI+Orexin组、假手术组和正常组的翻转电位（2.7±2.6 mV）两两之间差异无统计学意义（图4）。

2.2.3 各组脊髓腹角神经元谷氨酸电流的动力学比较

在钳制电压为-70 mV、谷氨酸给药浓度为0.3 mmol/L的条件下，对比不同组腹角神经元谷氨酸电流的动力学指标（图5）。上升时间方面，SCI+Orexin组和SCI组与假手术组相比均减小（P<0.01），但SCI+Orexin组与SCI组之间差异无统计学意义，正常组与假手术组也差异无统计学意义。SCI组比SCI+Orexin组上升斜率增大（P<0.05），且大于假手术组（P<0.01），假手术组与正常组、SCI+Orexin组之间差异无统计学意义，衰减时间上，SCI组比假手术组减小（P<0.05），SCI+Orexin组比SCI组增大（P<0.01），SCI+Orexin组与假手术组相比无差异。衰减斜率方面，正常组、假手术组、SCI组和SCI+Orexin组两两比较差异无统计学意义。

3 讨论

脊髓损伤（SCI）是一种严重的神经系统疾病，其病理生理过程复杂，涉及急性期和慢性期的多种破坏性事件，如缺血、氧化应激、炎症反应、细胞凋亡和运动功能障碍等^{［23， 24］}。本研究通过构建新生SD大鼠的脊髓损伤模型^［25］，探讨了Orexin-A在脊髓损伤修复中的潜在作用及其机制。实验结果表明，Orexin-A能够显著促进脊髓损伤后运动功能的恢复，并且非NMDA型谷氨酸受体可能参与了这一过程。这一发现为脊髓损伤的治疗提供了新的思路和实验依据。

本研究发现，Orexin-A能够逆转脊髓损伤导致的谷氨酸电流翻转电位和动力学指标的变化，提示其可能通过调节谷氨酸受体的功能来改善神经元的电生理状态。这一结果与以往研究一致，表明Orexin-A在神经系统疾病中具有广泛的神经保护和修复作用^{［7， 14， 26， 27］}。例如，Orexin-A在前庭损伤修复中能够减轻前庭功能缺失综合征，并在外伤性脑损伤（TBI）中通过激活Nrf2/HO-1信号通路抑制铁死亡，从而减轻脑损伤^［14］。这些研究共同支持了Orexin-A在神经损伤修复中的潜在应用价值。

脊髓损伤后，神经元内的钙离子稳态失衡可能导致NMDA受体功能异常，进而引发一系列病理生理变化，如钙依赖性失活和突触可塑性改变^［28-31］。本研究的膜片钳实验结果显示，脊髓损伤后谷氨酸电流的翻转电位发生异常去极化，这可能与NMDA受体介导的钙离子内流有关。细胞内高钙积累又会促使谷氨酸释放增加，对神经元产生兴奋毒作用^［24］。Orexin-A可能通过调节谷氨酸受体的功能，纠正谷氨酸电流的翻转电位和动力学指标，并改善钙离子稳态，减轻兴奋毒作用。这种调节作用有助于恢复神经元的正常生物电活动，改善神经信号在脊髓中的传导。本研究观察到脊髓损伤致使脊髓腹角神经元谷氨酸电流的翻转电位显著去极化，可引发动物肌肉痉挛。而鞘内给予Orexin-A能够逆转该去极化现象，降低细胞的兴奋性，进而使动物的行为学表现恢复或接近正常生理状态，这就建立了膜片钳实验结果与行为学改善之间的联系。此外，Orexin-A还可能通过影响神经元代谢、神经系统的反馈功能或神经元-神经元的相互作用，间接调节谷氨酸受体的表达和功能^{［32， 33］}。我们认为，Orexin-A在脊髓损伤修复中的作用机制尚未完全阐明，但其通过调节谷氨酸受体功能促进运动功能恢复的潜力值需要进一步研究。尽管本研究发现Orexin-A能够改善谷氨酸电流的翻转电位和动力学指标，但谷氨酸电流的上升时间在给药后并未显著改变，提示可能存在其他调节机制或因素影响突触后电流的上升时间。因此，未来的研究应进一步探讨Orexin-A的具体作用机制，特别是其对突触传递和神经元兴奋性的影响。

近年来，国内外关于Orexin-A在神经系统疾病中的研究逐渐增多。已有研究表明，Orexin-A在神经退行性疾病、药物成瘾和神经损伤修复中具有潜在的治疗作用^［33-36］。然而，关于Orexin-A在脊髓损伤中的具体作用机制研究相对较少，且多数研究集中在Orexin-A对神经元兴奋性和突触可塑性的影响上。本文的创新点在于首次系统探讨了Orexin-A在脊髓损伤后谷氨酸受体功能调节中的作用，并通过电生理实验揭示了其潜在的神经保护机制。与以往研究相比，本文不仅验证了Orexin-A对运动功能恢复的促进作用，还进一步探讨了其通过调节谷氨酸受体功能改善神经元电生理状态的机制，为Orexin-A的临床应用提供了新的实验依据。尽管本研究取得了一定的进展，但仍有许多问题需要进一步探讨。Orexin-A对谷氨酸受体功能的具体调节机制尚不明确，未来的研究应结合分子生物学和电生理学技术，深入探讨Orexin-A对谷氨酸受体表达、转运和功能的影响。Orexin-A在脊髓损伤后不同恢复阶段的作用尚需进一步研究，以明确其最佳治疗时机和剂量。此外，开发Orexin-A的衍生物或类似物，寻找具有更强效、更持久或更少副作用的治疗候选药物，也是未来研究的重要方向。总之，Orexin-A在脊髓损伤修复中的潜在作用机制复杂且多样，本文的研究为其临床应用提供了新的实验依据。通过进一步的研究，我们有望更全面地了解Orexin-A在脊髓损伤修复中的作用机制，为脊髓损伤患者带来新的治疗希望。

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