过表达RGL1通过激活CDC42/RAC1复合体上调运动型黏着斑组装促进结直肠癌转移

RGL1 overexpression promotes metastasis of colorectal cancer by upregulating motile focal adhesion assembly via activating the CDC42/RAC1 complex

摘要

目的 探究Ral鸟嘌呤核苷酸解离激活样因子1（RGL1）在转移性结直肠癌中的作用及机制。 方法 分析GEO数据库中RGL1在结直肠癌转移性和非转移性中的表达差异。收集珠江医院2020年1月~2022年12月50例临床转移性与非转移性结直肠癌患者，采用qPCR和免疫组化分析RGL1与结直肠癌转移的关系。体外构建稳定过表达和稳定干扰RGL1基因的细胞株，分别分组为：过表达对照组（veh）与过表达组（RGL1+），敲低对照组（shNC）与敲低组（shRGL1）。Western blotting实验验证过表达和干扰效率。Transwell实验体外验证细胞表型，明确RGL1对肿瘤细胞侵袭、迁移能力的影响。体内实验采用小鼠盲肠原位种植肝转移模型验证动物表型，明确RGL1对肿瘤转移的影响。细胞-基质黏附检测实验、免疫荧光实验验证RGL1与黏着斑形成的关系，免疫共沉淀实验探究RGL1与GTP酶活化的关系。 结果 与非转移性结直肠癌相比，RGL1在转移性结直肠癌中高表达（P<0.05）。与对照组相比，过表达RGL1细胞中该基因上调（P<0.05），细胞迁移、侵袭能力增强（P<0.05），小鼠出现结直肠癌肝转移；并且加速了结直肠癌细胞运动型黏着斑的组装（P<0.05），促进了运动型黏着斑的形成，上调CDC42/RAC1的活化态与RGL1的结合。 结论 RGL1在转移性结直肠癌中高表达，通过激活CDC42/RAC1复合体上调运动型黏着斑组装，从而促进结直肠癌转移。RGL1有望成为防治结直肠癌转移的新靶点。

Abstract

Objective To investigate the regulatory role of Ral guanine nucleotide dissociation stimulator-like 1 (RGL1) in metastasis of colorectal cancer (CRC). Methods We analyzed the differential expression of RGL1 between metastatic and non-metastatic CRC in GEO database, and examined its expression in 25 patients with metastatic CRC and 25 patients with non-metastatic CRC treated in Zhujiang Hospital between January, 2020 and December, 2022 using quantitative PCR (qPCR) and immunohistochemistry. HCT116 cell lines with stable RGL1 overexpression and SW480 cells with RGL1 knockdown were established using lentiviral vecors, and the changes in invasion and migration abilities of the cells were assessed using Transwell invasion and migration assays. The transduced cells were injected into the serosa of the cecum of nude mice, and tumor growth and liver metastasis were observed 8 weeks later. Fibronectin adhesion assays and immunofluorescence experiments were employed to assess the relationship between RGL1 and focal adhesion formation, and co-immuno-precipitation assays were performed to explore the interaction between RGL1 and GTPase activation. Results Compared with non-metastatic CRC, metastatic CRC showed significantly upregulated expression of RGL1. HCT116 cells overexpressing RGL1 exhibited obviously enhanced migration and invasion in vitro with increased capacity for liver metastasis in nude mice. RGL1 overexpression strongly accelerated focal adhesion assembly, facilitated the formation of motile focal adhesions, and enhanced the binding of activated CDC42/RAC1 complex to RGL1. Conclusion RGL1 is highly expressed in metastatic CRC and promotes distant metastasis of CRC by activating the CDC42/RAC1 complex to facilitate the formation of motile focal adhesions. These findings suggest that RGL1 can potentially serve as a therapeutic target for CRC metastasis.

Graphical abstract

关键词

RGL1 / 转移性结直肠癌 / 运动型黏着斑 / CDC42 / RAC1

Key words

Ral guanine nucleotide dissociation stimulator-like 1 / metastatic colorectal cancer / motile focal adhesion / CDC42 / RAC1

结直肠癌为胃肠道中的常见肿瘤，其病死率为9.3%，仅次于肺癌^［1］。约有20%的结直肠癌患者在诊断时已发生远处转移，且5年生存率低于20%^{［2， 3］}。其中肝脏是结直肠癌最常见的远处转移部位，肝转移也是导致结直肠癌患者死亡最重要的原因^［4］，也是临床治疗的难点和热点。目前关于结直肠癌肝转移的原因尚未明确。

RGL1是一种RAS效应蛋白，属于Ral特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子（RalGEF）家族，能通过刺激核苷酸交换激活Ras样GTP酶，调控RAS信号通路下游的细胞行为^［5］。Ras样GTP酶被认为与肿瘤生长^{［6， 7］}、转移密切相关^{［8， 9］}，是目前研究的热点。然而，目前关于RGL1与肿瘤的研究极少，仅在乳腺癌^［10］、髓母细胞瘤^［11］中报道，且研究聚焦于相关性分析及相关的Ras信号通路。关于RGL1与结直肠癌转移的关系尚未见报道。

肿瘤转移是多因素影响的结果，Rho GTP酶家族被认为与肿瘤转移密切相关^［12］。CDC42与RAC1属于Rho GTP酶家族，通过GTP/GDP循环切换激活状态，调控细胞骨架动态、细胞极性、迁移和胞吞等作用^［13-15］。Rho GTP酶家族的活性受到多种上游调控因子的控制，其中鸟苷酸交换因子（GEFs）是最直接的上游激活者^［16］。关于RalGEF是否能调控Rho GTP酶暂无报道，尚未明确。本研究将重点关注RGL1是否通过CDC42与RAC1来影响肿瘤转移，探究RGL1在结直肠癌转移中的作用和机制，以期为RGL1参与结直肠癌转移的分子机制提供有关证据，为临床治疗提供新的靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

人结直肠正常上皮细胞NCM460和人结直肠癌细胞株HT29、DLD1、RKO、CACO2、HCT116、SW480、SW620、LOVO、HCT15等购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2 试剂

RGL1慢病毒过表达系统由上海吉凯基因构建并包装，针对RGL1的小干扰RNAs（siRNAs）由苏州吉玛基因完成，qPCR引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。1640培养基、胎牛血清（Gibco），蛋白提取试剂盒（碧云天生物），FAK、F-actin、Paxillin、RhoGDIa、CDC42、CDC42^GTP、RAC1、RAC1^GTP、RhoA、RhoA^GTP（CST），RGL1抗体（Thermo Fisher Scientific，ABclonal），β-actin抗体、GAPDH、兔二抗（abcam），Lipofectamin^TMRNAiMAX转染试剂、Trizol裂解液（Thermo Fisher Scientific），逆转录试剂盒、Real-Time PCR试剂盒（Takara），Transwell小室（Corning Incorporated）。

1.1.3 动物

6~8周龄雄性裸鼠，体质量约20 g，由广东省动物中心提供，并饲养于珠江医院实验动物中心。体内实验通过南方医科大学珠江医院医学伦理委员会审批（伦理批号：2022-KY-307-01）。

1.1.4 临床样本

收集珠江医院2020年1月~2022年12月伴有转移的结直肠癌（25例）和不伴转移的结直肠癌（25例）的原发灶肿瘤组织样品。所有样本均由2位以上有经验的病理医师确诊为结直肠癌。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

用含10%胎牛血清和1%抗青霉素抗链霉素的1640培养基培养结直肠癌细胞株，并置于含有5%CO₂、37 ℃恒温培养箱内培养，待细胞密度达到80%，进行常规传代和后续实验。1~2 d进行一次换液。

1.2.2 RGL1过表达及敲低RGL1的结直肠癌细胞株构建

共构建4株稳定表达细胞株，分别为HCT116 veh与HCT116 RGL1+、SW480 shNC与SW480 shRGL1。合成RGL1过表达慢病毒及shRGL1慢病毒（上海吉凯公司），按照病毒转染说明书进行转染：将细胞以1×10⁵/孔铺于24孔板内，使细胞在慢病毒转染时数量达到2×10⁵/孔。待细胞达到对数生长期后，含6 μg/mL polybrene的新鲜培养基替换原有培养基，并加入适当病毒液，孵育24 h后用新鲜的完全培养基替换含有病毒液的培养基。为筛选稳定转染RGL1的细胞克隆，在病毒转染的第3天开始加入嘌呤霉素，持续嘌呤霉素暴露2周后，收集部分细胞，提取总蛋白质，利用Western blotting法检测RGL1的过表达情况。

1.2.3 Western blotting

按照蛋白试剂盒说明书操作提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加入5×loading buffer，95 ℃金属浴变性10 min，-80 ℃保存。取20 μg蛋白，行10%SDS-PAGE电泳。电泳完毕后，将PAGE胶上的蛋白移至PVDF膜上。4%BSA室温封闭1 h。RGL1（1∶1000）、β-actin（1∶5000）、RhoGDIa（1∶1000）、CDC42（1∶1000）、RAC1（1∶1000）、RhoA（1∶1000）、GAPDH（1∶5000）一抗4 ℃过夜孵育。次日，洗膜后加入HRP标记的二抗（1∶5000），显影采用ECL化学发光试剂盒。

1.2.4 qPCR

采用Trizol法提取总RNA，使用分光光度计（Nanodrop，Thermo）进行RNA浓度测定及质量评估。取1 μg总RNA使用逆转录试剂盒逆转录为cDNA，使用SYBR Green Master Mix进行qPCR检测。引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。RGL1的上游引物为GCAAGATGGCTAGGGGTTGAA，下游引物为TGCCAGCTTTTATGGTCCTGA；GAPDH的上游引物为：ATTCCATGGCACCGTCAAGGC-TGA；下游引物为：TTCTCCATGGTGGTGAAGAC-GCCA。

1.2.5 HE染色

4%多聚甲醛固定组织样品，于脱水机内进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸腊，最后包埋。采用Leica RM2235切片机将组织切成2.5 μm厚的薄片，60 ℃烘箱烘烤3 h。经二甲苯及梯度酒精脱蜡至水，苏木素-伊红染色，梯度酒精至二甲苯透明，中性树脂封片。显微镜下质检，扫片机扫片保存。随机选取5个400倍视野进行图片采集。

1.2.6 免疫组织化学

前期步骤同HE染色，经二甲苯及梯度酒精脱蜡至水后，高压锅抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，室温封闭。RGL1（1∶100）一抗4 ℃过夜孵育，二抗（1∶2000）室温孵育1 h，DAB显色，苏木素复染，1%盐酸酒精分化，梯度酒精至二甲苯透明，中性树脂封片。显微镜下质检，扫片机扫片保存。随机选取5个400倍视野进行图片采集。

1.2.7 Transwell迁移实验

先在下室加入600 μL完全培养基。细胞消化离心后，用完全培养基重悬，吸取100 μL 3×10⁴细胞悬液加入上室内。用镊子轻移，使下室培养基刚好没过上室底部。将Transwell孔板放于37 ℃培养箱内培养24 h。弃去培养基，用PBS清洗小室2遍，4%多聚甲醛固定30 min。弃去多聚甲醛，稍微风干小室，1%结晶紫染色10 min。用PBS清洗数遍直至背景干净，用棉签轻轻擦拭，自然晾干。使用显微镜拍摄小室底部迁移细胞，直径上取4个视野。使用Image J软件进行统计学分析。

1.2.8 Transwell侵袭实验

实验前从-20 ℃冰箱中取出Matrigel基质胶，放于4 ℃冰箱过夜融化固态Matrigel基质胶为液态。使用提前预冷的实验器材，在低温条件下用无血清培养基按照1∶8的比例稀释Matrigel基质胶。在Transwell小室中加入60 μL稀释后的基质胶，在37 ℃放置1.5 h使基质胶凝固成薄胶。下室加入600 μL完全培养基，上室加入100 μL 3×10⁴个细胞悬液。用镊子轻移，使下室培养基刚好没过上室底部。将Transwell孔板放于37 ℃培养箱内培养48 h。后续步骤同Transwell迁移实验。

1.2.9 动物实验（盲肠原位种植肝转移模型）

使用6~8周龄裸鼠，体质量约20 g，随机分为shNC组、shRGL1组。1%戊巴比妥钠麻醉小鼠（8 μL/g剂量腹腔注射）。于裸鼠左下腹竖直切开1~2 cm的腹膜，于盲肠浆膜层注射1×10⁶不同分组的肿瘤细胞，缝合，待小鼠复苏。8周后收集原位肿瘤和肝脏组织进行后续实验。

1.2.10 细胞-基质黏附检测实验

用PBS配制20 μg/mL纤连蛋白胶（Fn胶），按500 μL/孔加入24孔培养板内。将培养板放置4 ℃过夜。用PBS洗3次后，再用1% BSA 在37 ℃封闭1 h。用RPMI1640培养基洗2遍，调整细胞浓度为1×10⁵/mL，按照500 μL/孔加入经包被的细胞培养板内。低速离心培养板2 min，使细胞沉降于培养板底部，在CO₂培养箱中静止放置30 min，吸弃未粘附的细胞，用PBS洗3次。4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS洗3次。使用显微镜拍摄，直径上取4个视野。使用Image J软件进行统计学分析。

1.2.11 细胞免疫荧光实验

收集细胞后用PBS冲洗细胞3次，4%甲醛固定细胞10 min，PBS冲洗细胞3次。1% Triton X-100于室温渗透细胞20 min，PBS冲洗细胞3次。用10%正常山羊血清于室温阻断1 h，一抗4 ℃孵育过夜，荧光二抗室温孵育1 h，用PBS冲洗细胞3次，滴加DAPI于共聚焦显微镜下观察。

1.2.12 免疫共沉淀实验

用IP特异性RIPA缓冲液（Beyotime）提取蛋白质。将同一种的一抗或IgG（1 μg抗体∶1 mg细胞蛋白）加入蛋白悬液中，4 ℃孵育过夜。次日，取20 μL蛋白A/G磁珠（HY-K0202MCEUSA）结合120 min，用RIPA缓冲液洗涤3次，加入2×上样缓冲液变性。最后进行SDS-PAGE Western blotting。

1.3 统计学分析

使用SPSS 26.0统计软件及Graphpad Prism10进行数据分析及处理。计量资料符合正态分布以均数±标准差表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析。计数资料用频数表示，组间比较采用卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。所有实验均独立重复3次。

2 结果

2.1 RGL1在伴有转移的结直肠癌原发灶中高表达

结直肠癌GEO数据库（GSE39582和GSE87211）分析显示，伴有转移的结直肠癌原发灶中RGL1表达水平上调，差异具有统计学意义（P<0.05，图1A）。qPCR实验显示，RGL1在伴有转移的结直肠组织中的表达更高（P<0.05，图1B）；免疫组化实验显示，在蛋白水平伴有转移的结直肠癌的RGL1表达较高，差异具有统计学意义（P<0.05，图1C）。

2.2 构建RGL1过表达细胞株和敲低细胞株

RGL1在正常肠上皮细胞NCM460和9种结直肠癌细胞中的蛋白表达量（图2A），选择原位细胞株HCT116细胞构建过表达稳转株。与对照组（veh）相比，过表达RGL1组（RGL1+）表现出良好的过表达效果（图2B）；选择SW480细胞构建基因敲低，与shNC相比，敲低RGL1组（shRGL1）表现出敲低效果（图2C）。

2.3 RGL1高表达促进结直肠癌的转移与侵袭

Transwell实验结果显示，RGL1过表达促进肿瘤细胞转移，敲低RGL1抑制肿瘤细胞转移，差异具有统计学意义（P<0.05，图3A）；RGL1过表达促进肿瘤细胞侵袭，敲低RGL1肿瘤细胞侵袭能力减弱，差异具有统计学意义（P<0.05，图3B）。为体内验证RGL1与结直肠癌转移的关系，构建裸鼠盲肠原位种植肝转移模型，实验结果显示，相较于对照组，敲低RGL1原位肿瘤更小（图3C），裸鼠生存期延长，差异具有统计学意义（P<0.05，图3D），且肝转移的发生率下降（图3E）。

2.4 RGL1高表达促进运动型黏着斑组装

结直肠癌GEO数据库富集分析显示，RGL1高表达促进结直肠癌多种信号通路的激活，其中GSE39582、GSE83889、GSE87211芯片数据集提示RGL1高表达促进结直肠癌细胞黏着斑相关基因的富集（图4A）。细胞-基质黏附检测结果显示，过表达RGL1可以加速结直肠癌细胞黏着斑的组装（P<0.05，图4B），敲低RGL1细胞黏着斑的组装减缓（P<0.05，图4C）。免疫荧光实验显示，过表达RGL1的细胞中局部黏着斑激酶（FAK）以及桩蛋白呈现分散的“星点状”信号，随机分布于基底膜中，RGL1促进了运动型黏着斑的形成（图4D）；敲低RGL1的细胞中FAK和桩蛋白分布呈现规则的斑块状或纤维状聚集，信号强度高且均匀，此时细胞主要存在非运动型黏着斑（图4E）。

2.5 RGL1可以激活CDC42/RAC1复合体

免疫共沉淀实验检测Rho GTP酶家族中的3个关键蛋白，结果显示过表达RGL1或敲低RGL1不影响这些信号蛋白的表达水平（图5A），也不影响RhoA在激活态与RGL1的结合（图5B），但提高了CDC42、RAC1在激活状态与RGL1的结合（图5C、D）。

3 讨论

本研究通过分析GEO数据库和临床标本初步证实了RGL1在伴有转移的结直肠癌原发灶中高表达，表明RGL1在结直肠癌中发挥促肿瘤转移的功能。进一步的通过体内、体外功能实验证明了RGL1能促进结直肠癌的侵袭和转移；对RGL1促进肿瘤转移的机制探讨显示，RGL1可以激活CDC42/RAC1复合体，重排结直肠癌细胞中的FAK和桩蛋白分布，加速运动型黏着斑组装，从而增强肿瘤的迁移和侵袭能力，导致结直肠癌发生转移。

本研究首次发现RGL1与结直肠癌转移的关系。以往关于RGL1的研究多集中于淋巴细胞炎症相关途径的新靶点，如在动脉粥样硬化中C0X2缺失会降低RGL1的表达^［17］、系统性红斑狼疮的发病机制中RGL1是ac⁴C的潜在修饰靶点^［18］、RGL1可以作为接受肝移植患者的乙型肝炎感染预后的标志物^［19］等。目前关于RGL1与肿瘤的研究极少，且其促癌或抑癌作用在不同癌肿存在差异。比如，在乳腺癌中发现激活Ras-RGL1/2-RalB-exocyst-WRC通路可促进乳腺癌转移^［10］；但是在Group3型髓母细胞瘤中RGL1下调与转移相关，原因未知^［11］。RGL1在肿瘤发生发展中的作用和相关机制目前尚不明确。与RGL1同家族的RGL2曾被报道能促胰腺癌生长和侵袭^［20］，RGL2与RGL3能促进非小细胞肺癌的锚定非依赖性生长^［21］。所以我们前期猜测RGL1也有促肿瘤转移的可能性，而结直肠癌在我国发病率高，远处转移是其最晚期的表现，临床标准治疗方案为根治性手术切除和化疗，但是手术仅适用于10%~20%的患者，且5年生存率仍然很低^［22］。寻找并确定RGL1作为新的分子靶点对于结直肠癌转移的防治非常必要。

Rho GTP酶家族在肿瘤转移中发挥重要作用，其中CDC42和RAC已被证实是多种肿瘤转移的驱动因素，如肝癌^［23］、肺癌^［24］、乳腺癌^［25］、结直肠癌^［24］ 等。Cdc42调控丝状伪足形成，探测微环境并引导定向迁移^［27］；Rac1诱导板状伪足形成，增强细胞前沿推进能力^［28］，这些均与黏着斑的组装密切相关。CDC42和RAC1的上游调控网络很复杂，目前研究主要认为核心是通过GEFs响应生长因子^［29］、整合素^［30］、GPCR^［31］等信号，协同GTP酶激活蛋白（GAPs）^［32］和鸟苷酸解离抑制因子（GDIs）^［［33］维持动态平衡。RalGEF属于GEF家族，它是一类特异性激活Ral GTP（RalA/RalB）的鸟苷酸交换因子^［34］。暂无研究表明RalGEF家族可以影响Rho GTP家族发挥作用。本研究创新性地提出RGL1可以激活CDC42/RAC1复合体促进黏着斑组装从而促进肿瘤转移，这是首次从Rho GTP酶的角度解释RGL1促肿瘤转移的机制，但本研究没有深入探索RGL1激活CDC42/RAC1复合体的具体机制，猜测可能是Ral通路和Rho通路下游分子的交叉调控的结果，有待后续进一步实验验证。

综上所述，本研究证实了RGL1是结直肠癌转移中潜在防治分子靶点，并提出RGL1新的作用机制，为进一步临床上治疗结直肠癌转移提供了研究基础和新思路。

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基金资助

广东省自然科学基金(2020A1515010212)

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