积雪草苷通过抑制NLRP3炎症体介导的细胞焦亡减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤

Asiaticoside alleviates myocardial ischemia-reperfusion injury in rats by inhibiting NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis

摘要

目的 探讨积雪草苷（AS）在保护大鼠心肌缺血再灌注损伤（MIRI）中的保护机制。 方法 将50只SD大鼠随机分为假手术组（sham）、模型组（I/R）、AS处理组。AS处理组在手术前连续2周灌胃，根据给予不同剂量的AS分为低剂量组、中剂量组、高剂量组， 10只/组。检测血清中的乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、白介素-18（IL-18）和白介素-1β（IL-1β）浓度，测量各组大鼠心肌梗死和缺血范围，并观察心肌组织的病理变化。使用Western blotting法检测心肌组织中NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的蛋白含量。此外，通过缺氧复氧（H/R）实验在H9C2细胞中模拟缺血再灌注损伤，并进行AS预处理。 结果 与sham组相比，I/R组心肌梗死和缺血范围增加，血清中LDH和CK-MB水平升高，心肌组织中NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白含量升高（P<0.05）。与I/R组相比，AS处理组的心肌梗死范围、血清LDH和CK-MB水平降低，心肌组织中上述蛋白含量也降低（P<0.05），且AS的保护作用呈剂量依赖性。体外实验显示，H/R处理导致NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表达增加（P<0.05），而AS预处理可减轻H/R损伤（P<0.05）。分子对接结果表明，AS与NLRP3具有良好的结合活性。 结论 积雪草苷可以减轻大鼠心肌再灌注损伤，其机制可能通过抑制NLRP3炎症体介导的细胞焦亡实现。

Abstract

Objective To study the mechanism mediating the protective effect of asiaticoside (AS) against myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI) in rats. Methods Fifty SD rats were randomized into sham-operated group, MIRI model group and AS treatment group. AS treatment was administered at low, moderate and high doses by daily gavage for 2 weeks before MIRI modeling (n=10). Serum levels of lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase isoenzyme (CK-MB), interleukin-18 (IL-18) and IL-1β, the volume of myocardial infarction and ischemia, and myocardial pathologies of the rats were determined or observed. The protein expression levels of NLRP3, ASC, caspase-1, GSDMD, GSDMD-N, IL-1β and IL-18 in the myocardial tissues were detected using Western blotting. The changes in the expression levels of these proteins were also detected in H9C2 cells with AS pretreatment prior to hypoxia-reoxygenation (H/R) injury. Results The rats models of MIRI exhibited significant myocardial infarction and ischemia with increased serum levels of LDH and CK-MB and myocardial expressions of NLRP3, ASC, caspase-1, GSDMD, GSDMD-N, IL-1β and IL-18. AS pretreatment effectively reduced myocardial infarction volume in the rat models and significantly reduced serum LDH and CK-MB levels and the protein levels in the myocardial tissue in a dose-dependent manner. In the H9C2 cell model of H/R injury, AS pretreatment significantly suppressed the elevation of the protein expressions of NLRP3, ASC, caspase-1, GSDMD, GSDMD-N, IL-1β and IL-18. Molecular docking studies showed that AS had a strong binding affinity with NLRP3. Conclusion Asiaticoside can alleviate MIRI in rats possibly by inhibiting NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis.

Graphical abstract

关键词

积雪草苷 / 心肌缺血再灌注损伤 / NLRP3 / 细胞焦亡

Key words

asiaticoside / myocardial ischemia-reperfusion injury / NLRP3 / pyroptosis

心血管疾病是全球主要死亡原因之一，其致死率超过癌症和慢性肺病的总和，心肌梗死是最重要的致死因素^［1］。目前，急性心肌缺血的首选治疗是及时的再灌注治疗，通过开通闭塞的冠状动脉恢复心肌血供^{［2， 3］}。早期成功的血运重建可以有效减少心肌梗死面积并明显改善患者预后^［4］。然而，再灌注治疗后可能出现心肌缺血再灌注损伤（MIRI），导致氧化应激、炎症级联反应及程序性细胞死亡，最终抵消血运重建的获益，增加患者生存难度^［5］。因此，阐明MIRI的分子机制并寻找新型干预靶点至关重要。

研究表明，NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡是MIRI的核心病理机制 ^{［6， 7］}。NLRP3主要通过激活caspase-1切割GSDMD蛋白，引发细胞膜穿孔及IL-1β/IL-18释放，进而驱动心肌炎症微环境恶化。多项研究表明，通过抑制NLRP3介导的细胞焦亡可减轻MIRI^{［8， 9］}。因而，靶向抑制NLRP3焦亡通路成为治疗MIRI的高效手段。然而，现有抑制剂往往存在脱靶效应和毒性问题，限制了其临床应用^［10］。因此，寻找更安全有效的NLRP3调控策略成为当前研究的热点。

天然产物因其多靶点、低毒性的优势，已逐渐成为MIRI干预研究的重要方向。积雪草苷（AS）是积雪草中的一种三萜类化合物，具有多种心血管疾病保护作用，研究证实，AS可通过抑制氧化应激和内皮过度增殖改善糖尿病心肌病，并通过调节钙稳态减轻心力衰竭^［11-14］。研究提示AS可以通过抑制NLRP3介导的细胞焦亡来发挥帕金森病的保护作用^［15］。尽管已有研究提示AS对MIRI有保护作用，但当前研究仅从表型提示AS可能对MIRI具有保护作用，仍缺乏明确的体内与体外实验来进一步证实其具体作用机制，因此，本研究将基于分子对接和动物、细胞实验，首次深入探讨AS是否通过抑制NLRP3炎症体介导的细胞焦亡来减轻MIRI，进一步明确AS在MIRI模型中的作用机制，为未来精准靶向治疗MIRI疾病提供新的理论与数据支撑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物

50只6~7周龄SPF级SD大鼠（体质量180~220 g）购自江苏青龙山生物科技有限公司（许可证号：SCXK（浙）2024-0002），动物在温度21~25℃、相对湿度40%~60%的条件下，经历周期性的光照和黑暗变化，进行为期1周适应性喂养后随机分5组进行实验操作。本研究中严格遵循《实验动物管理条例》，并经蚌埠医科大学伦理委员会审批（伦理审批号：［2019］第074号）。

1.1.2 药物与试剂

积雪草苷、兔抗NLRP3抗体、兔抗ASC抗体、兔抗IL-1β抗体、兔抗IL-18抗体（MCE）；兔抗caspase-1抗体、兔抗GSDMD抗体、兔抗α-tubulin抗体（杭州华安生物技术有限公司）；L-乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒、大鼠白细胞介素18（IL-18）ELISA试剂盒、大鼠肌酸激酶同工酶1（CK-MB）ELISA试剂盒（北京索莱宝有限公司）；大鼠白介素1β（IL-1β）ELISA试剂盒（杭州华安生物技术有限公司）。

1.1.3 仪器

生理信号采集系统（成都仪器厂）；动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司）；化学发光成像系统（上海天能公司）；高端全自动倒置荧光显微镜（德国蔡司）。

1.2 方法

1.2.1 MIRI模型与分组

选取50只SD大鼠随机分为5组：假手术组（sham）、模型组（I/R）、不同浓度AS处理组分为低剂量AS组（I/R+AS-L）、中剂量AS组（I/R+AS-M）、高剂量AS组（I/R+AS-H），10只/组，不同浓度AS处理组在手术前分别予以12.5、25、50 mg/kg的积雪草苷灌胃，1次/d，连续14 d。假手术组与模型组灌等量的β-环糊精钠盐溶剂。MIRI模型制备参考先前文献［16］：用1%戊巴比妥（50 mg/kg）将大鼠麻醉后， 固定于板上，剔除胸前毛发暴露手术视野，经口行气管插管后，连接呼吸机设置参数：呼吸频率72次/min、吸呼比1∶1、潮气量12 mL/kg，连接心电图II导联稳定10 min后开始操作。使用碘伏对手术区域进行消毒，在左侧胸壁中间位置剪开3~4 cm的切口，使用血管钳逐层进行钝性分离，在第3、4肋间打开胸腔，暴露心脏，撕开心包膜，使用6-0缝合线在心耳与肺动脉圆锥交界下方2 mm处结扎，进针深度及宽度分别为2 mm、4 mm，打活结快速结扎左前降支，可见结扎线以下左心室变白或变紫，室壁运动减弱，心电图显示ST段抬高。缺血30 min后松开活结，再灌注2 h，左心室由白变红，ST段回落50%以上，提示MIRI模型制备成功。假手术组仅穿线不结扎。

1.2.2 分子对接

从pubchem数据库（https：//pubchem.ncbi.nim.nih.gov/）中获取AS的2 D结构文件，导入到Schrödinger Maestro软件中，使用LigPrep模块处理配体，生成3 D结构。从PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）提取分辨率<2.5 A且具有完整口袋结构的NLRP3蛋白结构文件，导入Schrödinger Maestro软件，对受体进行去优化。最后，使用Glide进行对接。

1.2.3 TTC-Evansblue染色

大鼠再灌注2 h后快速取下心脏用PBS溶液将血液洗净，再次将左前降支结扎，从主动脉逆行灌流2% Evansblue 1~2 mL后将心脏放置-20 ℃冰箱中30 min后切成2 mm薄片，用PBS配置1% TTC溶液，现用现配，将心脏切片放置溶液中在37 ℃水浴锅中避光孵育30 min，每隔15 min翻动1次，孵育结束后转移至4%多聚甲醛中固定，次日用手机拍照记录，照片导入ImageJ软件中测量心肌梗死面积和缺血面积。心肌梗死范围=梗死面积/缺血面积%，心肌缺血范围=缺血面积/左心室面积%。

1.2.4 检测大鼠血清LDH、CK-MB、IL-1β、IL-18的含量

各组大鼠再灌注2 h结束后，麻醉后腹主动脉取血，将样本置于室温1 h后使用离心机3000 r/min离心15 min，取上清，分装后置于-80 ℃冰箱备用。按照ELISA试剂盒指导手册进行操作，检测血清中LDH、CK-MB、IL-1β、IL-18的含量。

1.2.5 HE染色观察心肌组织病理变化

各组大鼠再灌注2 h后，用装有20 mL PBS的注射器从心尖插入，将右心耳剪开，缓慢注入，待流出清亮液体后停止灌流，改用4%多聚甲醛进行灌流，大鼠出现尾巴翘起，四肢抖动则停止，迅速取下心脏置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，将心脏样本进行石蜡包埋处理，随后切片、脱蜡、水化进行苏木精-伊红（HE）染色。切片染色完成后在显微镜下进行观察拍照。

1.2.6 细胞培养

配置含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的低糖DMEM培养基，将H9C2细胞放于37 ℃、5% CO₂的正常培养箱中，在配置好的低糖培养基中进行培养。将细胞分为正常组（Control）、积雪草苷组（AS）、模型组（H/R）、缺氧复氧+积雪草苷组（H/R+AS）。Control组细胞用正常培养基常氧培养箱中培养； AS组用100 μmol/L AS预处理24 h后换成正常培养基在常氧培养箱中培养；H/R组细胞换成无血清无糖培养基在37 ℃、95%N₂、5%CO₂的三气培养箱中培养6 h，再换成正常培养基置于常氧培养箱18 h。H/R+AS组H9C2细胞用100 μmol/L AS预处理24 h后换成无血清无糖培养基在三气培养箱中培养6 h后换成正常培养基置于常氧培养箱18 h。

1.2.7 CCK-8检测细胞活力

将H9C2细胞以1×10⁴/孔密度接种于96孔板中，设置4个复孔，种板24 h后进行1.2.6的操作，复氧结束后，弃去培养基，每孔加入90 μL无血清低糖DMEM培养基+10 μL CCK-8溶液，于培养箱中孵1 h，使用酶标仪测定A_{450 nm}。

1.2.8 免疫荧光染色

将H9C2细胞以2×10⁴密度种于共聚焦小皿中，处理同1.2.6后，预冷4%多聚甲醛室温固定30 min，，加入0.2% TritonX-100 通透10 min。加入5%BSA封闭90 min，敷一抗NLRP3（1∶500）、caspase-1（1∶500）4 ℃过夜，次日加入山羊抗兔二抗（1∶200）室温下孵育30 min，最后，加入DAPI染核10 min，于蔡司荧光显微镜下观察并随机拍照并使用蔡司软件分析图像。

1.2.9 Western blotting

将置于-80 ℃的各组心脏样品取出，剪取左心室部位称量50 mg，加入已配制好的RIPA裂解液（含有PMSF），匀浆，裂解，离心提蛋白。H9C2细胞处理后消化离心收集细胞加入已配置好的RIPA裂解，离心提蛋白。BCA蛋白定量后，制胶，上样，电泳，转膜，封闭，敷一抗NLRP3（1∶3000）、caspase-1（1∶2000）、IL-1β（1∶2000）、IL-18（1∶2000）、GSDMD-N（1∶2000）、ASC（1∶1000）、α-tubulin（1∶5000） 4℃过夜，次日敷二抗（1∶5000），ECL显影、曝光成像。条带用Image J软件进行灰度值分析。

1.3 统计学分析

实验中所有研究数据分析处理均由GraphPad Prism 10.0软件完成，数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行各组之间差异性比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AS与NLRP3分子对接

将AS（CAS号：11954171）与NLRP3进行分子对接，分子对接图显示了核心成分与核心靶点对接的具体情况，可以发现11954171可以嵌入在NLRP3蛋白中，并且与多个氨基酸残基发生作用，其中与NLRP3蛋白的Arg578残基，Asp662残基，Glu629残基，Gln627残基，Asn656残基，Glu654残基形成氢键。此外还与Ile574，Tyr632，Leu628，Val353，Pro352，Ile623，Ala616残基具有疏水作用。与Asp662，Glu629，Glu654，具有静电作用力等，结合能为-7.695 kcal/mol，显示AS与NLRP3结合活性较好（图1）。

2.2 体内实验

2.2.1 AS对MIRI大鼠心肌梗死面积的影响

与sham组比，I/R组心肌梗死范围和缺血范围显著增大（P<0.001）；与I/R组相比，I/R+AS-L、I/R+AS-M、I/R+AS-H缺血范围无统计学差异（图2C），I/R+AS-L、I/R+AS-M、I/R+AS-H组梗死范围显著减小，其中I/R+AS-H组的下降最多（P<0.001，图2B）。

2.2.2 各组大鼠血清中的LDH、CK-MB、IL-1β、IL-18的水平

与sham组相比，I/R组大鼠血清中LDH、CK-MB、IL-1β、IL-18含量显著增多（P<0.001），与I/R相比I/R+AS-L、I/R+AS-M、I/R+AS-H组中的LDH、CK-MB、IL-1β、IL-18随着用药浓度增加而逐渐下降，其中I/R+AS-H组下降最明显（P<0.001，图3）。

2.2.3 各组大鼠心脏HE染色结果

Sham组大鼠心肌组织结构正常，无炎性浸润，心肌纤维排列整齐，边限清楚；I/ R 组大鼠心肌组织结构紊乱，有大量炎性浸润，心肌纤维断裂；I/R+AS-L、I/R+AS-M、I/R+AS-H心肌的损伤程度随着用药的浓度升高而减小，其中I/R+AS-H组心肌组织结构相对完整，少量炎性浸润，边界相对清楚（图4）。

2.2.4 Western blotting检测各组大鼠心肌组织中NLRP3、caspase-1、ASC、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表达的变化

与sham组相比，I/R组大鼠心肌组织中NLRP3、caspase-1、ASC、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白含量显著增多（P<0.001），与I/R组相比，I/R+AS-L、I/R+AS-M、I/R+AS-H组的心肌组织中NLRP3、caspase-1、ASC、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白含量减少（P<0.001，图5）。

2.3 体外实验

2.3.1 各组H9C2细胞活力

在0~100 μmol/L的浓度范围内AS对H9C2细胞无毒性（图6A），缺氧6 h，复氧18 h后，细胞活力显著降低（P<0.001），给于AS（0、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L）预处理后，与H/R组相比，细胞活力升高，其中AS（100 μmol/L）浓度细胞活力显著升高（P<0.001，图6B）。

2.3.2 各组H9C2细胞的NLRP3、caspase-1的表达

与Control组相比，AS组细胞中的NLRP3和caspase-1的平均荧光强度无统计学差异，H/R组的NLRP3、caspase-1的平均荧光强度增强（P<0.001）；与H/R组相比，H/R+AS组细胞中的NLRP3、caspase-1平均荧光强度减弱（P<0.001，图7）。

2.3.3 Western blotting检测各组H9C2细胞中NLRP3、caspase-1、ASC、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白的表达

与Control组相比， AS组H9C2细胞中的NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表达无统计学意义，H/R组H9C2细胞中的NLRP3、caspase-1、ASC、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表达显著增多（P<0.01），与H/R组相比，H/R+AS组H9C2细胞中的NLRP3、caspase-1、ASC、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表达明显减少（P<0.05，图8）。

3 讨论

MIRI目前仍然是临床治疗中的一大挑战^［17］。本研究探讨了AS在MIRI中的保护作用，并发现了AS可能通过阻断NLRP3炎症体激活的细胞焦亡过程来实现其保护作用。在体实验通过给于AS不同剂量灌胃2周后建立MIRI模型，结果显示，AS呈剂量依赖性减小大鼠心肌梗死面积，降低了血清中LDH、CK-MB的含量，有效改善了心肌病理性损伤变化。这些结果证明了AS在MIRI中的保护作用，AS的剂量依赖性效应进一步支持其在MIRI中的心肌保护作用。

MIRI的发病机制复杂，涉及炎症反应、钙离子过载、氧化应激、能量代谢紊乱、细胞凋亡、细胞焦亡和铁死亡等多种因素，具体机制尚未完全阐明^［18］。本研究在体内实验中发现，与sham组相比，I/R组大鼠心肌中NLRP3、caspase-1、ASC、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表达显著上调，以及通过检测各组大鼠血清中炎性因子IL-1β和IL-18含量，发现I/R组炎性因子含量显著增多。这与前人实验结果相一致，细胞焦亡参与MIRI的发生发展^［19-21］。在体外实验中，利用H9C2心肌细胞通过缺氧6 h，复氧18 h建立MIRI模型，检测细胞中焦亡相关蛋白表达变化，同样证实了细胞焦亡在MIRI中的作用。NLRP3炎症体一旦被激活，随后激活caspase-1将前体-IL-1β和IL-18裂解为成熟形式，诱导细胞焦亡^{［22， 23］}。已有诸多研究表明，抑制NLRP3炎症体介导的细胞焦亡可以减轻MIRI^［24-26］。在体内实验中，与I/R组相比，不同剂量AS预处理组大鼠血清中IL-1β、IL-18含量呈剂量依赖性降低，心肌组织中NLRP3、caspase-1、ASC、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白含量也呈剂量依赖性降低，表明AS可以通过阻断NLRP3炎症小体的激活来减少心肌损伤。在体外实验中，进一步证实了AS在NLRP3炎症小体途径中的抑制作用。AS预处理显著降低了H/R处理后NLRP3、caspase-1、ASC、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表达水平，进一步验证了其对细胞焦亡的调控能力。这一结果与体内实验一致，强调了AS通过抑制NLRP3炎症小体途径减轻MIRI的机制。

此外，本研究结果发现，AS的心肌保护作用呈现明显的剂量依赖性。在体内实验中随着AS剂量的增加，心肌梗死范围及血清LDH、CK-MB水平逐渐降低，心肌组织病理性改变逐渐减轻，说明AS对心肌损伤的抑制效应与剂量呈正相关。在体外试验中，AS在0~100 μmol/L的浓度范围内预处理H9C2心肌细胞H/R处理后呈浓度依赖性恢复细胞活力水平。此剂量依赖性不仅为未来临床应用提供了剂量参考，也揭示了AS在不同浓度下的保护效果。

AS是一种从积雪草中提取的活性成分，具有广泛的药理学作用和临床应用^{［14， 27-31］}。既往有研究证明AS在MIRI中的保护作用^{［32， 33］}，但AS能否通过抑制NLRP3炎症体介导的细胞焦亡来减轻MIRI方面的研究尚无。本研究从体内、体外实验结合分子对接共同验证AS在MIRI 发挥保护作用的可能机制。首次证实了AS可以通过抑制NLRP3炎症体介导的细胞焦亡来减轻MIRI。为AS在MIRI中的应用提供了新的理论依据和思路，并确立了NLRP3炎症小体作为心肌保护治疗靶点的潜力。

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